曹瑞蘭，李知青，歐陽雯婷，胡冬南，周增亮，蘇文娟，陳 霞，劉 娟*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院/江西省森林培育重點實驗室，江西 南昌 330045；2.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350028）

【研究意義】油茶（Camellia oleiferaAbel.），是我國特有的木本油料樹種，與油橄欖、油棕和椰子并稱為世界四大木本油料植物，綜合利用價值極高[1-2]。油茶生長在山地或丘陵地帶，適生性強，耐干旱貧瘠，且不與糧棉爭耕地，近年來已成為我國南方山區(qū)重點發(fā)展的油料作物。發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)也成為保障國家糧油安全、提高食用油自給率的重要途徑。截至2019年底，我國油茶種植面積約453.3萬hm2，其中高產(chǎn)油茶林93.3萬hm2，產(chǎn)油62.7萬t，全國油茶產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值達到1 160億元[3]。

干旱是影響植物生長發(fā)育的主要逆境脅迫之一，也是全球作物栽培面臨的最嚴重的環(huán)境壓力之一[4]。油茶是我國南方山地的鄉(xiāng)土樹種，一般認為其耐旱性較強，但是其主產(chǎn)區(qū)在6—9 月常出現(xiàn)持續(xù)干旱，同時伴隨著極端高溫，這將嚴重影響油茶的集約化栽培和生產(chǎn)[5]。干旱脅迫將降低油茶光合效率，影響花芽分化和油脂轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致大量落花落果，進而造成油茶林大面積減產(chǎn)[6]。民間諺語“七月干果，八月干油”，說的就是夏季高溫干旱對油茶產(chǎn)量和茶油品質(zhì)的影響。大量研究發(fā)現(xiàn)，在長期進化過程中，油茶已形成一系列形態(tài)、生理機制來應(yīng)對或適應(yīng)干旱脅迫，例如，通過促進根系生長，提高根冠比[7]；關(guān)閉部分葉片氣孔，破壞光合色素，降低光合效率，減緩植株生長[8]；減小花芽分化，降低油脂轉(zhuǎn)化，抑制生殖生長等[9]。在分子調(diào)控水平上，誘導(dǎo)或抑制一系列干旱脅迫相關(guān)的基因表達，這包括直接參與干旱脅迫相關(guān)基因，以及調(diào)節(jié)這些基因表達水平的轉(zhuǎn)錄因子?！厩叭搜芯窟M展】NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族是植物界數(shù)量最大、分布最廣的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，主要參與調(diào)控植物的生長發(fā)育和形態(tài)建成[10-12]。Souer[13]和Aida等[14]先后從矮牽牛和擬南芥中發(fā)現(xiàn)了NAM、ATAF1/2 和CUC2 等3 個NAC 轉(zhuǎn)錄因子。序列比對分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAM、ATAF1/2 和CUC2 所編碼的蛋白質(zhì)具有較高的同源性。即使它們有不同的生物學(xué)功能，但其N 端結(jié)構(gòu)相似，故以其首字母命名為NAC[15]。研究發(fā)現(xiàn)NAC 家族NAM和CUC基因?qū)敹朔稚M織的形成和分化具有重要調(diào)控作用[16]，啟動子區(qū)富含逆境響應(yīng)元件，如低溫響應(yīng)元件[17]、干旱響應(yīng)元件[18]、損傷響應(yīng)元件[19]等，是植物應(yīng)答生物或非生物脅迫的重要方式之一。

【本研究切入點】研究表明，NAC 轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對干旱的過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。例如，Hu等[20]發(fā)現(xiàn)，NAC轉(zhuǎn)錄因子能在氣孔保衛(wèi)細胞中被誘導(dǎo)表達，調(diào)控葉片氣孔運動，進而提高植株抗旱性。Duan 等[21]研究表明，苜蓿在受到干旱脅迫時，MfNACsa去棕櫚?；孜恢良毎耍ㄟ^調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達維持植株體內(nèi)谷胱甘肽庫處于還原狀態(tài)，保證植株在干旱脅迫下正常生長發(fā)育。擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子ANAC096與ABRE結(jié)合蛋白共同激活植株體內(nèi)ABA誘導(dǎo)基因，促使植株體內(nèi)ABA合成，保證在干旱時植株體內(nèi)滲透壓平衡，增加抗旱性[22]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從課題組油茶三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分離得到CoNAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員，明確各個基因的系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系、理化性質(zhì)、Motif 預(yù)測、亞細胞定位等，并基于油茶干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析CoNAC在不同干旱脅迫程度和復(fù)水下的表達水平，最后采用q-PCR 驗證CoNAC家族成員在不同耐旱油茶品種和不同干旱脅迫強度下的表達特征，進而探討油茶響應(yīng)干旱脅迫的分子調(diào)控機理，為水分高效利用油茶基因型的篩選提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

取生長較一致的一年生油茶苗為試驗材料，供試品種選取課題組前期干旱脅迫研究中篩選的相對耐旱油茶品種長林53 和相對不耐旱的長林18。2019 年7—9 月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園大棚內(nèi)進行盆栽試驗，每3株一盆，每盆裝相等的質(zhì)量的河沙為基質(zhì)，測定土壤田間持水量和含水量。試驗設(shè)置充分供水（對照）、自然干旱（8 d）、復(fù)水（自然干旱8 d后）3個處理。采用稱量控水法于每天17：00稱量測定土壤含水量，并將同一處理補水至相同含水量值。實驗對照組的土壤含水量維持在田間持水量的85%～90%；處理組土壤經(jīng)自然干旱，第8 天時土壤含水量下降至田間持水量的35%，處理第9 天復(fù)水至對照水平。分別在處理前、處理第8 天、復(fù)水后第5 天采樣，采樣時間為每天08：00—09：00。采集油茶苗幼葉，立即放入液氮中冷凍，然后置于-80 ℃冰箱冷藏，直至RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 油茶NAC 基因家族成員的篩選及基本信息分析 下載擬南芥NAC 蛋白序列（https：//www.arabidopsis.org/）和茶樹NAC蛋白序列[23]，使用本地blast-2.9.0+程序中tblastn對課題組已有的油茶三代測序轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行檢索，參數(shù)設(shè)置為-evalue 1e-5，-max_target_seqs 100，-outfmt 6。隨后，將初始搜索中鑒定出的所有油茶NAC基因序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫中的CDD（http：//www.ncbi.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgo）進行在線驗證，確定存在NAC結(jié)構(gòu)域，去除冗余和無效基因模型。將CDD驗證的所有候選基因上傳到ORFfinder（http：//www.ncbi.nih.gov/orffinder/），獲得CDS 序列和氨基酸序列。最后將這些氨基酸序列再次使用CDD 和Pfam 驗證，得到油茶NAC基因家族候選基因。ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）在線分析分子量（MW）、理論等電點（pI）等基因的一級結(jié)構(gòu)，利用CELLO v.2.5（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）進行亞細胞定位預(yù)測。

1.2.2 多序列比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 利用ClustalX2.1軟件將本研究鑒定出的油茶CoNAC蛋白序列同擬南芥（A.thaliana）和茶樹（C.sinensis）的NAC 蛋白序列進行多重比對分析，然后運用MEGA10.0軟件打開，在氨基酸序列中使用鄰近法（Neighbor-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，參數(shù)設(shè)置為泊松矯正（Poission correction）、成對刪除（pairwise deletion）和1 000 次重復(fù)的Bootstrap 值。使用在線程序iTOL（https：//itol.embl.de/）對進化樹進行美化。根據(jù)序列比對結(jié)果和進化樹，通過引進已知亞家族分類的擬南芥NAC蛋白和茶樹NAC蛋白的NAC區(qū)域，分類方法綜合Hisiko[24]文獻，對油茶NAC基因進行亞家族的分類。

1.2.3 基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析 利用保守元件分析工具MEME 5.0.5（http：//meme-suite.org/tools/meme）在線對油茶NAC 家族蛋白進行保守序列分析，設(shè)定參數(shù)motif 的最大數(shù)目為20，motif 長度設(shè)置為6～60個氨基酸，其他則為默認值。使用TBtools軟件繪圖。

1.2.4 基因表達譜分析 根據(jù)已發(fā)表的油茶干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用Galaxy 生信在線分析平臺的Salmon quant 工具進行轉(zhuǎn)錄組reads 的mapping，將不同處理的所有可用讀取數(shù)據(jù)分別映射到對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，計算油茶NAC基因的TPM值，最后使用TBtools繪制表達圖譜。

1.2.5 候選基因的表達模式分析 提取油茶長林18 和長林53 幼葉在不同試驗處理下的RNA，使用iScriptTMcDNA Synthesis Kit 進行cDNA 的合成，于-20 ℃保存，用于差異表達分析。挑選CoNAC28、CoNAC51、CoNAC52、CoNAC56、CoNAC60和CoNAC61基因進行q-PCR 驗證，引物序列如表1所示，內(nèi)參基因為EF1a1。將所有樣品都放在冰盒，按照所需的反應(yīng)體系進行實驗，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。設(shè)置好熒光定量儀程序，待反應(yīng)結(jié)束后，采用2—△△CT方法進行計算實時熒光定量反應(yīng)中候選基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物Tab.1 Primers for quantitative real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶NAC家族的篩選與基本信息分析

本研究在已成功構(gòu)建的RNA-seq 本地blast 文庫的基礎(chǔ)上進行NAC基因相似序列檢索與搜索，經(jīng)CCD 和Pfam 在線數(shù)據(jù)庫進一步篩選分析后最終確定了67 個含有NAM 保守結(jié)構(gòu)域的序列。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中unigenes 對67 個NAC 基因進行編號，即CoNAC1～CoNAC67（表2）。油茶NAC 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析顯示，67 個CoNAC基因大小為423（CoNAC48）～1911（CoNAC7）bp，編碼的氨基酸長度在140（CoNAC48）～636（CoNAC7），這些油茶NAC 蛋白的氨基酸長度變化差異較大；相對分子質(zhì)量介于15.65（CoNAC48）～388.73（CoNAC13）ku，與氨基酸含量成正比；等電點分布在4.54（CoNAC11）～9.65（CoNAC65），其中26 個為堿性蛋白質(zhì)（pI＞7），41 個為酸性蛋白質(zhì)（pI＜7）；有18 個CoNAC 的不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，是穩(wěn)定蛋白，約占NAC基因家族的26.87%。CoNAC成員的總平均親水系數(shù)（GRAVY值）都小于0。因此，推斷這些油茶NAC 家族蛋白表現(xiàn)均為親水蛋白，并且多數(shù)穩(wěn)定。亞細胞定位預(yù)測表明，除了CoNAC24 定位在葉綠體和細胞核，其余的油茶CoNAC蛋白都定位在細胞核。

表2 油茶NAC蛋白基本信息Tab.2 Basic information of C.oleifera NAC proteins

續(xù)表Continued tab.

2.2 油茶NAC蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

保守結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)中能夠折疊成特定三維結(jié)構(gòu)的一段相對區(qū)域，其結(jié)構(gòu)亞單位稱為基序（Motif），組成這些基序的氨基酸區(qū)段行使特異的功能，并蘊含各自的遺傳進化信息[26]。通過GeneDoc軟件對油茶NAC轉(zhuǎn)錄因子進行序列比對（圖1），發(fā)現(xiàn)油茶NAC轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)的N端存高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域（約150～160個氨基酸），這與擬南芥也相吻合[24,27]。此外，油茶NAC家族成員中除了少數(shù)基因具有不完整的NAC結(jié)構(gòu)域外，大多數(shù)基因具有5個保守的亞結(jié)構(gòu)域（A～E），說明CoNAC基因在進化過程中具有高度保守性。

圖1 油茶NAC蛋白序列比對Fig.1 Sequence alignment of C.oleifera NAC proteins

2.3 油茶NAC蛋白Motif分析

CoNAC基因家族中選用了20個Motif對油茶的NAC蛋白分析顯示（圖2），油茶NAC家族單獨建樹與擬南芥、茶樹和油茶共同構(gòu)建的物種間系統(tǒng)進化樹總體趨勢相吻合（圖3），表明通過建樹預(yù)測基因功能穩(wěn)定可靠。按照Motif 在CoNAC基因家族中出現(xiàn)次數(shù)進行排序，其中Motif 5 出現(xiàn)65 次，Motif 6 出現(xiàn)62 次，Motif 1 出現(xiàn)58 次，Motif 2 和Motif 4 出現(xiàn)56 次，Motif 7 和Motif 10 出現(xiàn)12 次，Motif 12 和Motif 13 出現(xiàn)7次，Motif 8和Motif 9出現(xiàn)6次，Motif 11、Motif 14、Motif 19和Motif 20出現(xiàn)5次，Motif 15、Motif 16、Motif 17和Motif 18 出現(xiàn)4 次，Motif 在CoNAC基因家族中出現(xiàn)頻率越高說明其越重要。通過分析Motif 與蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)Motif 5、6、1、2、3和4分別對應(yīng)CoNAC轉(zhuǎn)錄因子N端5個保守的亞結(jié)構(gòu)A～E。

圖2 油茶中NAC蛋白保守基序Fig.2 Sequence logos of CoNAC domains in C.oleifera

圖3 NAC基因家族成員保守基序分析Fig.3 Distribution of conserved Motifs in the NAC gene family members

2.4 NAC基因家族的多序列比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

為充分明確油茶NAC基因家族各基因間親緣關(guān)系與生物學(xué)功能的關(guān)系，對鑒定得到的油茶、茶樹和擬南芥的NAC 基因家族成員進行進化關(guān)系分析，根據(jù)Hisako 等[24]的分類方法，對CoNAC家族進行了分類，結(jié)果顯示（圖4）：進化樹共分為17 個亞組，其中ANAC2 最多有13 個成員，ONAC003 次之有8 個CoNAC成員，ATAF 和ANAC63 含有5個CoNAC成員，NAM、Unclassified、TIP 和SENU5含有4 個CoNAC成員，NAP、TERN、ONAC22、ANAC011和OSNAC8含有3個CoNAC成員，OSNAC7、NAC1含有2個CoNAC成員，ATNAC3和ONAC022亞組最少，含有1個CoNAC成員，只有ANAC001亞組中不包含CoNAC基因。在進化關(guān)系上比較相近的一類NAC 基因在結(jié)構(gòu)與功能上均比較相似，可以作為推測油茶中NAC 基因功能的參考依據(jù)。

圖4 油茶、茶樹和擬南芥NAC的鄰接法進化樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of NAC in C.oleifera，C.sinensis and A.thaliana

2.5 油茶NAC基因家族表達分析

基于油茶不同干旱脅迫處理下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用TBtools 分析軟件進行Row-Scale 均一化處理（圖5），發(fā)現(xiàn)在中度干旱、重度干旱和復(fù)水后，大部分CoNAC基因間的表達模式存在一定差異。其中，CoNAC1、CoNAC8、CoNAC9、CoNAC27、CoNAC34、CoNAC43、CoNAC45、CoNAC47和CoNAC58等基因在干旱脅迫下，下調(diào)表達；CoNAC15、CoNAC16、CoNAC18、CoNAC28、CoNAC49、CoNAC51、CoNAC52、CoNAC55、CoNAC56、CoNAC57、CoNAC60、CoNAC61、CoNAC65和CoNAC67等基因上調(diào)表達，其中CoNAC56在中度干旱脅迫下的表達量比對照增加7 倍，CoNAC60基因的表達量增加4 倍，CoNAC61增加12 倍，達到最高峰。隨著干旱脅迫程度加強，CoNAC15、CoNAC16、CoNAC18、CoNAC28、CoNAC51、CoNAC60、CoNAC61等基因表達量也持續(xù)增加。在復(fù)水后，CoNAC18、CoNAC28、CoNAC49、CoNAC51、CoNAC52、CoNAC56、CoNAC57、CoNAC59、CoNAC60、CoNAC61和CoNAC65等基因表達呈明顯下降趨勢，而CoNAC12、CoNAC14、CoNAC23、CoNAC30、CoNAC36、CoNAC41、CoNAC50、CoNAC53、CoNAC54、CoNAC62、CoNAC63和CoNAC64等基因表現(xiàn)為上調(diào)表達，表達量增加。分析油茶干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CoNAC基因家族中有大部分CoNAC會響應(yīng)干旱脅迫。為了驗證RNA-seq數(shù)據(jù)，本研究挑選了CoNAC28、CoNAC51、CoNAC52、CoNAC56、CoNAC60和CoNAC61基因進行q-PCR驗證。

圖5 CoNAC基因在不同干旱脅迫下的表達特征Fig.5 Expression profiles of CoNAC genes under different concentration of drought

2.6 候選基因在干旱脅迫下的表達模式分析

為了研究CoNAC基因在油茶不同干旱時期的表達情況，本研究挑選在干旱脅迫表達譜中表達量較高的6 個CoNAC基因，利用q-PCR 檢測它們在2 個不同耐旱油茶品種（長林18 和長林53）中處于適宜水分、干旱、復(fù)水試驗下葉片中表達量。結(jié)果顯示，在干旱脅迫和復(fù)水后，大部分CoNAC基因在2個油茶品種中均表現(xiàn)出較為相似的表達趨勢，即基因在干旱處理時表達量均呈顯著上調(diào)趨勢，復(fù)水后呈現(xiàn)下降趨勢，這與表達譜（圖5）結(jié)果基本相同。例如，在長林53和長林18中，在干旱處理時CoNAC28、51、56、61等4個CoNAC基因候選表達量在干旱脅迫處于最高峰，復(fù)水后表達量有所下降。

圖6 6個CoNAC基因表達特征Fig.6 Expression patterns of 6 CoNAC genes

同時，筆者也發(fā)現(xiàn)CoNAC51和CoNAC52基因表達模式呈現(xiàn)不同趨勢，而且在不同品種間的表達模式不同。例如，在長林18 中，CoNAC52基因在干旱脅迫時表現(xiàn)為下調(diào)表達，復(fù)水后顯著上調(diào)，而CoNAC51基因在干旱脅迫下表達量呈上升趨勢，復(fù)水后表達量持續(xù)增加。長林53中，這2個基因的表達模式均呈現(xiàn)隨著干旱脅迫增加而上調(diào)，復(fù)水后下調(diào)。

3 討論

油茶是我國南方山地或丘陵地區(qū)主要的經(jīng)濟樹種之一。雖然油茶屬于中等耐旱植物，但是干旱脅迫仍是其生長發(fā)育過程中常遇到的逆境脅迫。研究發(fā)現(xiàn)，南方地區(qū)夏季持續(xù)干旱會對油茶生長產(chǎn)生嚴重影響，進而造成油茶林大面積減產(chǎn)，油茶果的果徑、果高、果形指數(shù)和體積等降低，花徑的生長量較自然狀況減少[5]。NAC 家族的NAM和CUC基因具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，能調(diào)控頂端分生組織的形成和分化，且啟動子區(qū)富含逆境響應(yīng)元件，在植物應(yīng)答干旱脅迫中具有重要作用[29-30]。本研究從油茶全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出67 個NAC 轉(zhuǎn)錄因子。油茶為六倍體樹種，其NAC基因數(shù)目明顯低于擬南芥（117）[31]、水稻（151）[32]、大豆（152）[33]、茶樹（45）[23]等二倍體物種。這可能是在三代轉(zhuǎn)錄組測序過程中由于受到基因文庫構(gòu)建或測序儀數(shù)據(jù)讀取不確定性的影響，導(dǎo)致相對基因組測序來說存在基因數(shù)目不全等問題。因此油茶NAC家族成員的完整性需要依賴全基因組測序數(shù)據(jù)來進一步確定和完善。

根據(jù)油茶、擬南芥和茶樹NAC 家族共建的系統(tǒng)發(fā)育樹，油茶67 個NAC基因家族的蛋白序列可分為17個亞族，除AtNAC001亞組中不包含油茶CoNAC基因，其它每個亞族都同時含有擬南芥和茶樹NAC基因。其中ANAC2 和ONAC003 亞組成員較多，暗示ANAC2 和ONAC003 亞組對油茶具有更加重要的作用。一般而言，位于同一系統(tǒng)發(fā)育進化枝小組上的蛋白，若序列的相似性較高，則它們可能具有極為類似的蛋白功能[34]。因此，可以利用NAC 蛋白間的進化保守性，來探討和預(yù)測油茶NAC 蛋白的抗旱能力。已有研究表明，ATAF、AtNAC3、ONAC003、NAM 亞組在非生物脅迫中具有重要作用[23,35]。擬南芥水脅迫處理抑制ATAF1的表達，脫水和ABA 處理可以誘導(dǎo)擬南芥ATAF 亞組的一些干旱相關(guān)基因表達，從而影響擬南芥抵抗干旱脅迫[12,36]。在本研究中，系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果分析顯示，油茶CoNAC60和CoNAC61分布于ATAF亞類，與擬南芥AtNAC102、AtNAC81、AtNAC32、AtNAC2聚為一類，并且該基因在干旱脅迫后表達量上調(diào)，表明其可能與ATAF亞類基因具有相似的功能。擬南芥AtNAC3亞類若干AtNAC19、55、72基因受水分影響誘導(dǎo)表達，且過表達該基因可提高植株抗旱性[37]。Fujita等[38]對擬南芥進行脫水處理，分離出一個編碼NAC 蛋白AtNAC3 亞組的AtNAC072基因，在干旱、高鹽脅迫誘導(dǎo)下高表達。CoNAC56分布于AtNAC3亞組，與擬南芥AtNAC072、AtNAC019和AtNAC055有較近的同源關(guān)系。水稻ONAC003的表達受干旱誘導(dǎo)，其過表達株系在高溫、干旱抗性增強，表明ONAC003調(diào)控水稻非生物脅迫過程[39]。油茶CoNAC28基因歸于ONAC003亞組，在干旱脅迫下的表達模式相似，具有相似的親緣關(guān)系，表明它們在干旱脅迫下具有相似的功能。陳瓊瓊等[40]采用實時定量qRT-PCR 表達分析顯示，10個NAM基因在不同組織中均特異表達，大部分NAM 基因在鹽和干旱脅迫下表達上調(diào)。CoNAC51和CoNAC52分布于NAM亞組，它們可能具有極為類似的蛋白功能在干旱脅迫時都表現(xiàn)為上調(diào)。在干旱脅迫下，油茶中的大部分ATAF、AtNAC3、ONAC003、NAM 亞組成員上調(diào)表達，暗示這些NAC 蛋白極有可能在油茶抗干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。

此外，基于RNA-Seq 和qPCR 分析，本研究驗證了大部分候選CoNAC基因在油茶干旱脅迫時的表達模式與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果較為相似，整體呈現(xiàn)為在干旱下基因表達上調(diào)，復(fù)水后下調(diào)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，候選CoNAC51和CoNAC52基因在長林18 和長林53 表達趨勢在干旱和復(fù)水后存在差異。課題組前期對江西主推油茶品種在干旱脅迫下的生理和形態(tài)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，長林53 耐旱性較強，而長林18 耐旱性相對較弱。這與馮士令[41]對長林系列的9 個油茶品種幼苗的抗旱性綜合評價結(jié)果相似。筆者的研究結(jié)果表明，在長林18 中CoNAC52在干旱脅迫和復(fù)水后表現(xiàn)為先下調(diào)后上調(diào)，而CoNAC51基因的表達量呈上升趨勢，它們在長林53中的表達模式均呈現(xiàn)隨著干旱脅迫上調(diào)，復(fù)水后下調(diào)。而這2個CoNAC基因的所在亞組，在其他物種中已證實在對干旱脅迫起到正調(diào)控作用[42]。由此說明，在長林18中CoNAC52基因的表達調(diào)控對水分敏感程度較低，表現(xiàn)為下調(diào)表達，在長林53中對水分較為敏感，基因表達上調(diào)。筆者的研究結(jié)果從一定程度上說明由于不同耐旱油茶品種的CoNAC基因表達對水分的敏感程度不同，應(yīng)對干旱脅迫的響應(yīng)機制存在差異。

4 結(jié)論

本研究的結(jié)果豐富了油茶NAC 家族轉(zhuǎn)錄因子的基本信息，對其蛋白理化特征、保守基序和基因結(jié)構(gòu)等進行了分析。多數(shù)CoNAC基因保守結(jié)構(gòu)域位于蛋白N 端，與其他植物中NAC 的結(jié)構(gòu)特征相符。CoNAC基因啟動子區(qū)具有多種脅迫響應(yīng)元件，系統(tǒng)進化樹將67 個CoNAC劃分為17 個亞類，同一亞組在基因結(jié)構(gòu)方面具有相似性且同一或不同亞類CoNAC基因在干旱脅迫處理后呈現(xiàn)差異表達?；诠矓?shù)據(jù)庫中油茶干旱RNA-Seq 數(shù)據(jù)，篩選油茶干旱脅迫相關(guān)的42 個NAC基因的TPM 值，顯示不同NAC基因在干旱脅迫下具有不同的表達程度。qPCR 結(jié)果顯示，6 個油茶NAC基因在干旱脅迫下呈現(xiàn)大致相似的表達趨勢，而CoNAC52和CoNAC51基因表達存在品種差異，說明其基因表達在不同油茶品種中對水分的敏感程度不同，不同油茶品種對干旱脅迫的響應(yīng)機制存在差異。本研究為更好的探討油茶耐旱脅迫響應(yīng)機制提供一定的參考，同時也能為油茶進一步抗旱品種選育和遺傳改良提供良好的基因資源。