袁夢(mèng)琪，李東富，龍春歡，楊慧君

(石家莊市人民醫(yī)院，河北 石家莊 050035)

肺栓塞是因栓子堵塞肺動(dòng)脈引發(fā)的病理生理性綜合征，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與修復(fù)在病情發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1].近年來，關(guān)于肺栓塞發(fā)病機(jī)制的研究主要著重于對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、修復(fù)的細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)的探索[2].人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是源于臍帶組織的干細(xì)胞，理論上能夠無限制傳遞，參與人體正常的生理活動(dòng)[3].一氧化氮(NO)作為血管舒張因子在抑制肺栓塞病情惡化過程中發(fā)揮重要作用，一氧化氮合酶(NOS)能夠催化調(diào)節(jié)NO的生成[4].熱休克蛋白70(HSP70)是具有多種生物學(xué)功能的活性物質(zhì)，多種病理狀態(tài)下HSP70均會(huì)出現(xiàn)改變[5].研究[6]顯示：大鼠心肌組織中HSP70表達(dá)水平與NOS呈正相關(guān).但關(guān)于肺栓塞患者血漿對(duì)引起血管內(nèi)皮損傷的NO、cGMP因子表達(dá)的影響及在此過程中HSP70、NOS表達(dá)的作用仍未見系統(tǒng)研究報(bào)道.鑒于目前進(jìn)行的血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)多選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型[7]，本研究利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞，探討肺栓塞患者血漿對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中HSP70和NOS表達(dá)的影響，對(duì)臨床上判斷肺栓塞患者病情發(fā)展具有實(shí)際意義.

1 材料與方法

1.1 材 料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(上海康朗生物科技有限公司)；肺栓塞患者血漿來自2018年5月—2019年10月石家莊市人民醫(yī)院收治的152例肺栓塞患者，均經(jīng)多層螺旋CT肺動(dòng)脈造影和放射性核素肺通氣/灌注顯像確診，發(fā)病14 d以內(nèi).其中，男85例，女67例；年齡52～76歲，平均(64.80±10.15)歲.健康人血漿來自同期體檢的健康志愿者152例，男83例，女69例；年齡48～74歲，平均(64.07±9.83)歲.性別、年齡在肺栓塞患者、健康志愿者之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性.

1.2 主要試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(武漢純度生物科技有限公司)；RT-PCR檢測(cè)試劑盒(天津生物芯片技術(shù)有限公司)；NO硝酸還原酶檢測(cè)試劑盒、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)放射免疫檢測(cè)試劑盒(上?？祈樕锟萍加邢薰?；HSP70特異性抑制劑HSP70-IN-1(GipBio公司，美國(guó))；免疫共沉淀試劑和所用抗體(上海愛必信生物有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置入37 ℃ 10% CO2培養(yǎng)箱中孵育，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞約有80%匯合時(shí)進(jìn)行分組(對(duì)照組、模型組、HSP70-IN-1干預(yù)組).在對(duì)照組中加入終濃度為20%的健康人血漿，模型組中加入終濃度為20%的肺栓塞患者血漿，HSP70-IN-1干預(yù)組中加入終濃度為20%的肺栓塞患者血漿和終濃度為10 μg/mL的HSP70-IN-1.

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)HSP70和NOS mRNA表達(dá)

分別于不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(0、30、60、120、240 min)收集各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，提取RNA，操作步驟嚴(yán)格按照RT-PCR檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行.取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用凝膠成像儀進(jìn)行灰度掃描，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算HSP70和NOS mRNA的相對(duì)表達(dá)量.PCR引物設(shè)計(jì)與合成由上海索寶生物有限公司完成.HSP70序列：上游引物5′-CCGTCATTAGGCGGTCGGAA-3′，下游引物5′-CTCATGTAGTGGTCGTCGTAG-3′；NOS序列：上游引物5′-AAGAGGAGGTCGCGGGC GCC-3′，下游引物5′-CTGACTGATGGAGTACTTC TA-3′；β-actin序列：上游引物5′-CCGTCATTAGGCGGTCG GAA-3′，下游引物5′-CTCATGTAGTGGTCGTCGTA G-3′.

1.3.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中NO、cGMP濃度檢測(cè)

取各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，37 ℃ 10% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄去上清液；加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集培養(yǎng)基上清液.使用硝酸還原酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定NO濃度，放射免疫檢測(cè)試劑盒測(cè)定cGMP濃度，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行.

1.3.4 免疫共沉淀法檢測(cè)HSP70與NOS相互作用

分別于不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(0、30、60、120、240 min)收集各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，低溫裂解細(xì)胞，4 ℃ 12 000 r/min恒溫離心，收集上清液.將上清液分成兩份，其中一份加入兔抗人HSP70多克隆抗體，另一份加入兔抗人NOS多克隆抗體，再分別加入蛋白A、瓊脂糖4B懸液(1∶1)10 μL，4 ℃孵育3 h，3 000 r/min離心10 min，磷酸緩沖液洗滌后備用.分別取上述樣品10 μL，行瓊脂糖凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)模至PVDF膜，分別滴加兔抗人HSP70多克隆抗體(1∶500稀釋)，兔抗人NOS多克隆抗體(1∶300稀釋)，4 ℃過夜.次日滴加山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析灰度值.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組患者人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中HSP70和NOS mRNA的表達(dá)水平

在培養(yǎng)30～120 min時(shí)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中HSP70和NOS mRNA表達(dá)水平呈明顯提升趨勢(shì)，培養(yǎng)240 min時(shí)較培養(yǎng)120 min時(shí)有所下降.培養(yǎng)30～240 min時(shí)，HSP70-IN-1干預(yù)組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中HSP70和NOS mRNA表達(dá)水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).見表1.

表1 各組患者人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中HSP70和NOS mRNA的表達(dá)水平Tab.1 HSP70 and NOS mRNA expression levels of human umbilical vein endothelial cells in each group

2.2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中NO、cGMP的含量

模型組與HSP70-IN-1干預(yù)組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中NO、cGMP含量明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HSP70-IN-1干預(yù)組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中NO、cGMP含量明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).見表2.

表2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中NO、cGMP的含量Tab.2 NO and cGMP contents of the supernatant of human umbilical vein endothelial cell culture medium in each group

2.3 肺栓塞患者血漿處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中HSP70與NOS蛋白的相互作用

應(yīng)用免疫共沉淀法檢測(cè)肺栓塞患者血漿處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)HSP70與NOS蛋白的相互作用.分別使用兔抗人HSP70多克隆抗體、兔抗人NOS多克隆抗體沉淀蛋白復(fù)合體，電泳、轉(zhuǎn)膜，再次用抗HSP70抗體、抗NOS抗體進(jìn)行免疫識(shí)別.在相對(duì)分子量110 kD和153 kD位置出現(xiàn)特異性蛋白條帶，提示HSP70與NOS存在相互作用.隨著肺栓塞患者血漿處理時(shí)間的延長(zhǎng)，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中HSP70與NOS蛋白表達(dá)水平均明顯增加；HSP70與NOS蛋白表達(dá)水平在不同時(shí)間點(diǎn)之間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見圖1、表3.

圖1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)HSP70與NOS蛋白的相互作用Fig.1 Interaction between HSP70 and NOS protein in human umbilical vein endothelial cells

表3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)HSP70與NOS蛋白的表達(dá)水平Tab.3 HSP70 and NOS protein expression levels of human umbilical vein endothelial cells at diffe- rent time points

3 討 論

相關(guān)研究[8]顯示：血清HSP90在COPD患者中表達(dá)水平明顯升高，且參與炎癥調(diào)節(jié)作用.多種病理因素共同參與肺栓塞所致的肺組織小動(dòng)脈收縮及相關(guān)低氧性損傷，其中HSP70表達(dá)是否增強(qiáng)目前仍未見相關(guān)研究報(bào)道.本研究結(jié)果顯示：使用肺栓塞患者血漿處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后HSP70mRNA表達(dá)水平明顯升高，使用HSP70特異性抑制劑HSP70-IN-1干預(yù)后HSP70 mRNA的表達(dá)水平明顯下降，且上述表達(dá)呈明顯的時(shí)間依賴性.提示肺栓塞患者血漿處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞能夠明顯上調(diào)HSP70 mRNA的表達(dá)，且隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)水平逐漸升高；下調(diào)HSP70表達(dá)后，肺栓塞患者血漿對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中HSP70 mRNA的表達(dá)影響明顯減弱.HSP70是一類高度保守的蛋白，屬于熱休克蛋白家族，參與蛋白質(zhì)折疊過程，是細(xì)胞中活躍的分子伴侶蛋白[9].當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境刺激時(shí)HSP70表達(dá)水平明顯增加，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激損傷[10].HSP70不與底物活性肽作用時(shí)常處于ATP結(jié)合狀態(tài)，其自身存在一定的ATP酶活性，短時(shí)間內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)自身水解[11].新生成的蛋白質(zhì)在核糖體出現(xiàn)時(shí)，HSP70能夠與疏水氨基酸殘基序列相互結(jié)合，具有可逆性[12].當(dāng)ATP水解生成ADP時(shí)，HSP70結(jié)合位點(diǎn)關(guān)閉，需要合成蛋白質(zhì)時(shí)，核苷酸交換因子開放結(jié)合位點(diǎn)，誘發(fā)ADP釋放，進(jìn)而介導(dǎo)HSP70向HSP90轉(zhuǎn)移[13].

研究[14]發(fā)現(xiàn)：在血流剪切力、雌激素等多種因素的作用下，誘發(fā)HSP70與NOS結(jié)合，改變NOS的構(gòu)象可增強(qiáng)其催化活性.但在肺栓塞發(fā)生與發(fā)展過程中是否存在HSP70與NOS的相互作用仍未見相關(guān)研究報(bào)道.本研究結(jié)果顯示：使用肺栓塞患者血漿處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后NOS mRNA的表達(dá)水平明顯升高，使用HSP70特異性抑制劑HSP70-IN-1干預(yù)后NOS mRNA的表達(dá)水平明顯下降，且上述表達(dá)呈明顯的時(shí)間依賴性.提示肺栓塞患者血漿處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞能夠明顯上調(diào)NOS mRNA表達(dá)，且隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)水平逐漸升高；下調(diào)NOS表達(dá)后，肺栓塞患者血漿對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NOS mRNA表達(dá)的影響明顯減弱.NO作為舒血管因子，其合成與分泌主要依賴NOS，并參與調(diào)節(jié)血管平滑肌張力，在降低血管平滑肌收縮和增生、抑制血小板活性和炎癥因子釋放中發(fā)揮重要作用[15].NOS包括內(nèi)皮型NOS、神經(jīng)型NOS、誘導(dǎo)型NOS在內(nèi)的3種同工酶，正常生理狀態(tài)下，NO主要由結(jié)構(gòu)型NOS合成與分泌，但在病理狀態(tài)下，誘導(dǎo)型NOS表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)NO濃度增加[16].

人體合成的NO進(jìn)入靶細(xì)胞后可激活鳥苷酸環(huán)化酶，促使cGMP濃度增加，臨床上常通過測(cè)定cGMP濃度來反映NO水平.本研究結(jié)果顯示：模型組與HSP70-IN-1干預(yù)組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中NO、cGMP含量明顯高于對(duì)照組，使用HSP70-IN-1干預(yù)后NO、cGMP含量明顯降低，提示肺栓塞患者血漿刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后NO水平明顯升高.本研究采用免疫共沉淀法觀察肺栓塞患者血漿處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后HSP70與NOS蛋白之間的相互作用，結(jié)果顯示：HSP70與NOS存在相互作用，且隨著肺栓塞患者血漿處理時(shí)間的延長(zhǎng)，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中HSP70與NOS蛋白的表達(dá)水平也明顯增加，HSP70特異性抑制劑HSP70-IN-1能夠下調(diào)HSP70與NOS蛋白表達(dá)，提示HSP70與NOS存在相互作用關(guān)系，HSP70構(gòu)象改變能夠影響NOS對(duì)NO合成的調(diào)節(jié)作用.本研究應(yīng)用肺栓塞患者血漿在體外作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，探討肺栓塞患者HSP70對(duì)NOS催化活性的影響，但血漿中存在多種刺激因子，在今后的研究中將進(jìn)一步細(xì)化血漿中的刺激因子，探討其對(duì)肺栓塞患者病情發(fā)展的影響.