周云潔， 宋 歌， 路永平， 韓麗華

河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1研究生辦公室 2功能檢查科 3心內(nèi)科，鄭州 450002

心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及其導(dǎo)致的凋亡在多種心血管疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用[1-2]。微小RNAs(micro RNA，miRNAs)是一類小的非編碼RNAs，能與靶基因的3′UTR互補配對，導(dǎo)致靶基因的降解或者抑制mRNA的翻譯，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在哺乳動物中有將近90%的基因都是被miRNAs調(diào)節(jié)的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNAs在多種生物進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，如細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化和凋亡等。miR-219a-5p是近年來發(fā)現(xiàn)的一個miRNA，已有的研究顯示miR-219a-5p在多種癌癥中表達(dá)異常，具有明顯的抑癌作用[3-5]，還能促進(jìn)肺癌對放療、化療的敏感性[3，6]。Xiao等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟缺血再灌注損傷小鼠模型中過表達(dá)miR-219a-5p能夠降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和氧化指標(biāo)的水平，減少肝臟中凋亡細(xì)胞數(shù)目，這表明miR-219a-5p能夠減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷。此外，通過細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-219a-5p也能減少H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡[7]。但是，目前miR-219a-5p對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用和機制還未見相關(guān)報道。Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)是一個進(jìn)化上保守的含鋅指修飾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)節(jié)包括多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞生長、增殖和分化等[8]。KLF4與心肌梗死過程中心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[9]。miRNAs是調(diào)節(jié)KLF4表達(dá)的一個重要因素[10]。但是，目前miR-219a-5p和KLF4的關(guān)系還未見相關(guān)研究。本研究使用H2O2誘導(dǎo)人心肌細(xì)胞(human cardiac myocytes，HCM)氧化應(yīng)激損傷，探究過表達(dá)miR-219a-5p對H2O2誘導(dǎo)HCM氧化應(yīng)激損傷的作用及其與KLF4的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

HCM細(xì)胞(Catalog #6200)和心肌細(xì)胞培養(yǎng)液均購于美國ScienCell公司，MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒和Annexin Ⅴ/PI凋亡檢測試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司，Lipofectamine 2000和TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司，活性氧檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxyde dismutase，SOD)檢測試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒均購買于上海碧云天有限公司，一抗Bax(使用時1∶2000稀釋)和Bcl-2(使用時1∶1000稀釋)均購于美國Abcam公司，一抗KLF4(使用時1∶1000稀釋)購于美國Cell signaling technology公司，熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于廣州銳博生物科技有限公司，cDNA第一鏈合成試劑盒和Real-time PCR試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理

將HCM細(xì)胞培養(yǎng)在含有5%胎牛血清、1%心肌細(xì)胞生長因子和1%青霉素/鏈霉素的心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。將HCM細(xì)胞隨機分成4組：對照組，H2O2組，H2O2+NC mimic組和H2O2+miR-219a-5p組。除對照組外，其余3組均使用200 μmol/L H2O2刺激6 h；H2O2+NC mimic組和H2O2+miR-219a-5p組分別使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染NC mimic和miR-219a-5p mimic，轉(zhuǎn)染48 h后使用H2O2刺激。

1.3 MTT檢測細(xì)胞活力

將HCM細(xì)胞按照1.2項中分組進(jìn)行處理，H2O2處理6 h后用胰酶消化，按照3×103個/孔的密度接種到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄上清液，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液與10 μL MTT溶液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄上清液后每孔加入110 μL Formazan溶解液，在搖床上低速振蕩10 min使紫色結(jié)晶完全溶解。利用酶標(biāo)儀在490 nm處測定各孔的吸光度值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

利用Annexin Ⅴ/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。具體操作如下：H2O2處理6 h后，換成新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細(xì)胞2次，用250 μL稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL；取100 μL樣品加入5 μL Annexin Ⅴ和10 μL PI溶液，混勻后室溫避光孵育15 min，再加入400 μL PBS，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA和SOD含量檢測

胞內(nèi)ROS含量檢測：先用無血清的心肌細(xì)胞培養(yǎng)液按照1∶1000的比例將DCFH-DA稀釋至終濃度為10 μmol/L；然后將稀釋好的DCFH-DA加入到細(xì)胞中(按1.0×106個細(xì)胞/mL)，37 ℃孵育20 min；用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞以除去未進(jìn)入胞內(nèi)的DCFH-DA后，在熒光酶標(biāo)儀上檢測各孔的熒光強度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

胞內(nèi)MDA和SOD水平檢測：將H2O2處理后培養(yǎng)24 h的細(xì)胞充分裂解，離心取上清液，按照試劑盒說明書操作進(jìn)行檢測。最后使用酶標(biāo)儀分別在532 nm、450 nm處測定吸光度值。

1.6 Real-time PCR檢測

應(yīng)用TRIzol法提取細(xì)胞中的總RNA，采用Nandrop2000測定總RNA的濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以cDNA為模板使用Real-time PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴增。miR-219a-5p和KLF4分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列如下：miR-219a-5p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGATTGTCCAAACGC-3′，下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；KLF4上游引物5′-GATGCTCACCCCACCTTCTT-3′，下游引物5′-TTTCTCACCTGTGTGGGTTCG-3′；GAPDH上游引物5′-TTCTTTTGCGTCGCCAGCCGA-3′，下游引物5′-GTGACCAGGCGCCCAATACGA-3′。

1.7 Western blot檢測

用含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液提取細(xì)胞的總蛋白，并使用BCA蛋白試劑盒測定所提取蛋白的濃度。取適量蛋白行SDS-PAGE電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜孵育，二抗室溫孵育1 h；然后加入ECL發(fā)光液拍照，并使用Image J軟件分析條帶的灰度值。

1.8 雙熒光素酶檢測

Starbase V3.0軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-219a-5p能夠與KLF4的3′-UTR互補配對。將預(yù)測的與miR-219a-5p互補配對的KLF4 3′-UTR序列克隆到pGL3-basic載體中，構(gòu)建野生型pGL3-KLF4載體；另外，將KLF4 3′-UTR突變序列克隆到該載體中，構(gòu)建突變型pGL3-KLF4-Mut載體，作為陰性對照。然后將構(gòu)建的2種質(zhì)粒與miR-219a-5p mimic或?qū)φ誱imic(NC mimic)使用Lipofectamine 2000共同轉(zhuǎn)染到HCM細(xì)胞中。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中miR-219a-5p的表達(dá)

采用Real-time PCR檢測miR-219a-5p表達(dá)。結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，H2O2組中miR-219a-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與H2O2組相比，H2O2+miR-219a-5p組中miR-219a-5p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

1：對照組；2：H2O2組；3：H2O2+NC mimic組；4：H2O2+miR-219a-5p組；與對照組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖1 各組細(xì)胞中miR-219a-5p表達(dá)情況Fig.1 miR-219a-5p expression in each group

2.2 各組細(xì)胞活力的變化

MTT法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，H2O2組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。與H2O2組相比，H2O2+miR-219a-5p組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)。

1：對照組；2：H2O2組；3：H2O2+NC mimic組；4：H2O2+miR-219a-5p組；與對照組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖2 各組細(xì)胞活力情況Fig.2 Cell viability in each group

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)果如圖3A所示，與對照組相比，H2O2組中細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.05)。與H2O2組相比，H2O2+miR-219a-5p組中細(xì)胞凋亡顯著降低(P<0.05)。

采用Western blot檢測細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果如圖3B所示，與對照組相比，H2O2組中Bax/Bcl-2的比值顯著增加(P<0.05)。與H2O2組相比，H2O2+miR-219a-5p組中Bax/Bcl-2的比值顯著降低(P<0.05)。

1：對照組；2：H2O2組；3：H2O2+NC mimic組；4：H2O2+miR-219a-5p組；A：流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率；B：Western blot檢測各組中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)；與對照組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖3 各組細(xì)胞中凋亡率和Bax/Bcl-2比值的變化Fig.3 Apoptosis rate and ratio of Bax/Bcl-2 in each group

2.4 各組細(xì)胞中ROS、MDA和SOD含量的變化

與對照組相比，H2O2組中ROS和MDA水平增加，SOD水平降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與H2O2組相比，H2O2+miR-219a-5p組中ROS和MDA水平降低，SOD水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖4。

1：對照組；2：H2O2組；3：H2O2+NC mimic組；4：H2O2+miR-219a-5p組；與對照組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖4 各組細(xì)胞中ROS、MDA和SOD含量Fig.4 Levels of ROS，MDA and SOD in each group

2.5 各組細(xì)胞中KLF4表達(dá)情況

Real-time PCR和Western blot檢測各組細(xì)胞中KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)水平情況，結(jié)果如圖5所示。與對照組相比，H2O2組中KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05)。與H2O2組相比，H2O2+miR-219a-5p組中KLF4 mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)。

1：對照組；2：H2O2組；3：H2O2+NC mimic組；4：H2O2+miR-219a-5p組；與對照組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖5 各組細(xì)胞中KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)情況Fig.5 The mRNA and protein levels of KLF4 in each group

2.6 KLF4是miR-219a-5p的靶基因

使用雙熒光素酶報告基因檢測確證KLF4與miR-219a-5p的關(guān)系，結(jié)果見圖6，在PGL3-KLF4野生型載體中，與NC mimic組相比，miR-219a-5p mimic轉(zhuǎn)染顯著降低了熒光強度(P<0.05)；而在PGL3-KLF4-Mut突變型載體中，與NC mimic組相比，miR-219a-5p mimic轉(zhuǎn)染對熒光強度的影響不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

與NC mimic組比較，*P<0.05圖6 雙熒光素酶報告基因檢測證實KLF4是miR-219a-5p的靶基因Fig.6 Dual-luciferase reporter gene assay revealed that KLF4 is a target gene of miR-219a-5p

3 討論

miR-219a-5p是近年來開始被廣泛研究的一個miRNA，它在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-219a-5p還能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[11]，緩解肝臟缺血再灌注損傷[7]，減輕大腦缺血再灌注損傷[12]。但是，目前miR-219a-5p在心血管疾病中的研究還未見相關(guān)報道。本研究探究了miR-219a-5p對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用和機制。

H2O2是常見的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的誘導(dǎo)物，我們利用H2O2誘導(dǎo)建立HCM細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。氧是心肌細(xì)胞的一個重要底物，線粒體呼吸通常伴隨著ROS的產(chǎn)生。ROS會與核酸、蛋白和脂質(zhì)等生物大分子相互作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和凋亡[13]。氧化劑與抗氧化劑之間的平衡對于維持正常的生理功能至關(guān)重要，外源性刺激會破壞這個平衡造成ROS的過度積累，誘導(dǎo)多種疾病。在氧化應(yīng)激條件下，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(如MDA)可直接反映ROS的產(chǎn)生，胞內(nèi)抗氧化劑(如SOD)可減少胞內(nèi)ROS含量[13]。Bax是一個重要的凋亡蛋白，而Bcl-2是一個重要的抗凋亡蛋白，H2O2可誘導(dǎo)Bax和Bcl-2比例的失調(diào)[13]。本研究使用200 μmol/L H2O2刺激后，HCM細(xì)胞活力和SOD含量降低，凋亡率、Bax/Bcl-2、ROS和MDA水平增加，這表明HCM細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型構(gòu)建成功。

使用Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)H2O2刺激導(dǎo)致miR-219a-5p表達(dá)降低。本研究通過miR-219a-5p mimic在HCM細(xì)胞中過表達(dá)miR-219a-5p，探究miR-219a-5p在H2O2誘導(dǎo)HCM細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-219a-5p能夠增加細(xì)胞活力和SOD水平，減少細(xì)胞凋亡、ROS和MDA含量，下調(diào)Bax/Bcl-2比值。這表明過表達(dá)miR-219a-5p能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

我們又進(jìn)一步探究了miR-219a-5p的作用機制。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示miR-219a-5p能夠與KLF4的3′-UTR互補配對。研究發(fā)現(xiàn)，在視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)KLF4表達(dá)，進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)[14]。在心肌梗死的心臟樣本中，KLF4呈高表達(dá)[15]。而KLF4表達(dá)下調(diào)可以緩解H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[16]。因此，我們將miR-219a-5p的作用機制主要集中到KLF4上。與之前的研究結(jié)果相似，我們的研究也顯示H2O2刺激后，HCM細(xì)胞中KLF4表達(dá)上調(diào)。過表達(dá)miR-219a-5p能夠抑制KLF4 mRNA和蛋白水平表達(dá)，且雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實了KLF4是miR-219a-5p的靶基因。miR-219a-5p能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[3-5]，而本研究發(fā)現(xiàn)miR-219a-5p能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，這可能是因為在不同類型的細(xì)胞中，miR-219a-5p的靶基因不同導(dǎo)致的。

總之，本研究結(jié)果表明miR-219a-5p過表達(dá)能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的人心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，這種作用可能是通過下調(diào)KLF4表達(dá)實現(xiàn)的。本研究進(jìn)一步闡明了心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的機制，也為臨床上心肌氧化損傷的治療提供了一定的理論依據(jù)。