季開心，陳思言，張敏杰，張苗苗

正畸牙齒移動是外力作用下引發(fā)的無菌性炎癥反應(yīng)，可以使牙周組織發(fā)生損傷與重建[1]。加力后牙周微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)被打破，牙周組織的微循環(huán)受到干擾，壓力側(cè)局部組織缺血、血管壓縮，白細胞發(fā)生遷移[2]。當組織適應(yīng)機械外力后，牙周微環(huán)境發(fā)生改變，細胞損傷程度加重，觸發(fā)細胞死亡，引起炎癥性改變，釋放炎癥介質(zhì)、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)等，共同調(diào)節(jié)破骨細胞分化[3]。RANKL與OPG的表達含量可以代表牙周組織改建的活躍程度[4-6]。

有研究發(fā)現(xiàn)牙齒移動過程中表達壞死性凋亡的關(guān)鍵蛋白——受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein 1/3，RIP1/3)，提示壞死性凋亡參與了牙齒移動過程。壞死性凋亡抑制劑Necrostatin-1(Nec-1)可以降低壞死性凋亡的發(fā)生率[7-9]。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)在正畸牙齒移動過程中存在壞死性凋亡，但壞死性凋亡如何參與牙齒正畸過程中牙周組織的改建目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

正畸結(jié)扎絲(新亞，中國)；6 mm鎳鈦拉簧(速航科技，中國)；酸蝕劑(杭州生物，中國)；粘結(jié)劑、樹脂(3M，美國)；游標卡尺(美耐特，中國)；石蠟切片機(瑞沃生命科技，中國)；全自動脫水機(上海三葳醫(yī)療，中國)；組織包埋機(泰維科技，中國)；光學(xué)顯微鏡(徠卡，德國)；水合氯醛(科密歐，中國)；多聚甲醛(金穗化工，中國)；EDTA(九州化工，中國)；Nec-1(MCE，中國)；兔抗鼠RANKL多克隆抗體、兔抗鼠OPG多克隆抗體(Affinity，中國)；SABC免疫組化試劑盒(博士德，中國)；DAB顯色試劑盒(卡諾斯，中國)。

1.2 構(gòu)建牙齒移動模型與實驗分組

選擇6周齡雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量為(206.43±10.43)g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。本實驗獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準。10%水合氯醛溶液進行大鼠腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g)后，將6 mm鎳鈦拉簧兩端用光固化流動樹脂分別固定在上頜切牙以及左側(cè)第一磨牙處，保持拉簧力值為50 g，同時磨短下頜切牙，建立正畸牙齒移動(orthodontic tooth movement，OTM)模型。按照是否加力以及注射Nec-1，將大鼠隨機分為對照組(A組)、抑制劑組(B組)、加力組(C組)、加力+抑制劑組(D組)。C、D兩組構(gòu)建OTM模型，A、C兩組分別在第1、3、7、10、14天上午8時腹腔注射生理鹽水，注射劑量為1 mg/(kg·d)，B、D兩組于同一時間腹腔注射Nec-1，注射計量為1 mg/(kg·d)。

1.3 組織取材

各組大鼠在注射藥物當天下午5時進行麻醉后依次灌注生理鹽水以及多聚甲醛溶液，取大鼠上頜左側(cè)頜骨組織，以待后續(xù)操作。

1.4 牙齒移動距離測量

游標卡尺測量左側(cè)第一磨牙近中邊緣嵴與第三磨牙遠中邊緣嵴距離，移動距離為兩次測量距離之差，由同一實驗者測量3次，取3次平均值。

1.5 制備切片

多聚甲醛對大鼠上頜骨標本體外固定，使用EDTA對標本脫鈣后，石蠟脫水包埋。沿牙體長軸矢狀向連續(xù)切片，每個切片厚度在4 μm左右，恒溫烤片2 h，對上頜左側(cè)第一磨牙壓力側(cè)牙周組織進行HE染色和免疫組織化學(xué)染色，染色后顯微鏡觀察。

1.6 HE染色

將切片用蘇木精溶液進行染色5 min，稀氨水(1%)浸泡30 s，伊紅溶液染色1 min，應(yīng)用中性樹脂封膠處理，顯微鏡下觀察。

1.7 免疫組化染色與平均光密度測量

切片用山羊血清封閉處理并與一抗RANKL抗體(濃度1∶300)和OPG抗體(濃度1∶250)共同孵育過夜后，再與二抗(濃度1∶200)繼續(xù)孵育4 h。孵育后用DAB檢測試劑盒顯色，利用Image-Pro-Plus9.0進行陽性細胞分析，計算平均光密度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0進行單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)對比應(yīng)用獨立樣本t檢驗。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠第一磨牙移動距離

A、B組牙齒在各實驗時間點均無移動。第3、7、10、14天時，C、D組第一磨牙均向近中明顯移動，且C組牙齒移動距離較D組明顯增加(P<0.05)，如表1所示。

表1 大鼠牙齒移動距離

2.2 大鼠上頜第一磨牙壓力側(cè)玻璃樣變變化

切片HE染色后發(fā)現(xiàn)，A、B兩組大鼠第一磨牙在各實驗時間點均未出現(xiàn)明顯的玻璃樣變區(qū)域。C組第一磨牙在第1、3天時未發(fā)現(xiàn)明顯的玻璃樣變區(qū)域；第7天可以觀察到壓力側(cè)出現(xiàn)大面積玻璃樣變區(qū)域，牙周膜間隙縮窄，膠原纖維發(fā)生斷裂；第10天時玻璃樣變區(qū)域變小，牙周膜間隙略增寬；第14天時玻璃樣變區(qū)域持續(xù)減小，牙齒移動。D組加入Nec-1后，第一磨牙壓力側(cè)第1、3、7天時出現(xiàn)的玻璃樣變區(qū)域不明顯，牙周膜間隙縮窄，在第10天時壓力側(cè)出現(xiàn)明顯的玻璃樣變區(qū)域，第14天時玻璃樣變區(qū)域減少(圖1)。

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；R：牙根；紅色箭頭代表大面積玻璃樣變區(qū)域

2.3 大鼠第一磨牙壓力側(cè)RANKL、OPG變化

本實驗中，A、B組在第1、3、7、10、14天RANKL、OPG表達無明顯差異(P>0.05)。C組中RANKL、OPG表達隨著時間逐漸遞增，RANKL在第7天時表達達到高峰，OPG在第10天時表達達到頂峰，之后隨著加力時間的增加，表達呈下降趨勢，各實驗時間點表達均高于A組(P<0.05)。加入壞死性凋亡抑制劑Nec-1后，D組中RANKL、OPG表達趨勢與C組一致，較A、B組表達增強；第7、10天時，C、D兩組RANKL、OPG比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2～3，表2～3)。

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；R：牙根；紅色箭頭代表陽性表達

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；R：牙根；紅色箭頭代表陽性表達

表2 不同加力時間大鼠第一磨牙壓力側(cè)RANKL平均光密度值變化

表3 不同加力時間大鼠第一磨牙壓力側(cè)OPG平均光密度值變化

3 討 論

壞死性凋亡是一種與炎癥相關(guān)、受細胞調(diào)節(jié)的死亡過程[10-11]。當細胞中caspase缺失或被抑制，受體相互作用蛋白激酶RIP1和RIP3在腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)誘導(dǎo)下，募集MLKL形成壞死小體，發(fā)生壞死性凋亡。Nec-1是一種小分子生物堿，可以有效抑制壞死性凋亡，避免細胞發(fā)生壞死[12]。單獨應(yīng)用Nec-1對健康細胞中的ATP水平、線粒體膜電位、質(zhì)膜完整性、細胞形狀、細胞分化以及增殖等均無影響[13-14]。本實驗僅使用Nec-1后，RANKL與OPG的表達與對照組相比無明顯差異，提示Nec-1不直接影響RANKL與OPG的表達。而在加力時使用Nec-1，牙齒移動距離縮短，證明壞死性凋亡參與了牙齒移動過程。

壞死性凋亡在細胞死亡中發(fā)揮促炎作用[15]。與其他類型的細胞死亡方式相比，壞死性凋亡的獨特性在于其會觸發(fā)危險相關(guān)分子模式(DAMPs)進而引發(fā)炎癥。當牙周組織發(fā)生大量炎癥反應(yīng)時，其本身不能發(fā)生適應(yīng)性改建后則出現(xiàn)玻璃樣變區(qū)域，阻礙牙齒移動。本實驗中，加入抑制劑Nec-1可以使加力后壓力側(cè)出現(xiàn)大范圍的玻璃樣變區(qū)域變晚，提示抑制壞死性凋亡會延遲玻璃樣變出現(xiàn)的時間，但壞死性凋亡與玻璃樣變之間的關(guān)系仍有待進一步研究。

破骨細胞的形成以及骨改建激活取決于牙周組織中細胞因子的表達含量[16-17]。破骨細胞分化成熟后可吸收壓力側(cè)牙槽骨，促使牙齒移動。在壓力側(cè)微環(huán)境中，RANKL、OPG以及RANK都發(fā)揮著重要的作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)OPG在破骨細胞形成過程中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，可抑制破骨細胞形成，減緩牙齒移動[18]。Aoki等[19]、Noguchi等[20]實驗證實，增加RANKL含量會上調(diào)破骨細胞前體中的RANK表達，加快破骨細胞形成，提高牙齒移動速度。本實驗中，大鼠單獨進行加力后，RANKL與OPG的表達呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，與破骨細胞形成規(guī)律相一致，提示在正畸牙齒移動過程中引發(fā)的無菌性炎癥反應(yīng)，可以使RANKL與OPG的表達增高，參與破骨細胞形成。加力時使用Nec-1可減少RANKL與OPG的表達，提示抑制牙周組織中壞死性凋亡的發(fā)生，可以減輕牙周組織中的炎癥反應(yīng)，影響破骨細胞的形成與分化。以上結(jié)果提示，在牙齒移動過程中，正畸力可能會激發(fā)壓力側(cè)牙周組織產(chǎn)生壞死性凋亡，發(fā)生壞死性凋亡后，壓力側(cè)牙周組織環(huán)境發(fā)生改變，炎癥反應(yīng)程度逐漸加重，刺激成骨細胞分泌RANKL等細胞因子，幫助破骨細胞形成與分化，促使牙齒移動。當使用Nec-1后，壞死性凋亡被抑制，壓力側(cè)牙周組織炎癥反應(yīng)減輕，破骨細胞形成與分化不活躍，牙槽骨改建速度下降，造成牙齒移動速率變緩。

綜上所述，壞死性凋亡可以促進牙齒移動，還可能導(dǎo)致了玻璃樣變的發(fā)生，但壞死性凋亡與牙齒移動之間的關(guān)系還需更多實驗的支持。本實驗以期能為牙齒移動機制提供新思路，為更加深入了解壞死性凋亡與牙齒移動的關(guān)系提供新視角。