岳 磊 黃麗杰 崔燕貞 李曉靜

1.鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

一清顆粒，作為一種臨床常用的中成藥，在《中國(guó)藥典( 2015 版) 》中規(guī)定，其處方為黃連、大黃和黃芩這三味藥材，功能與主治為清熱、瀉火、解毒、化瘀、涼血、止血[1]?，F(xiàn)行的藥典規(guī)定中，在含量測(cè)定項(xiàng)下使用高效液相色譜(HPLC)法，僅以黃芩苷作為目標(biāo)物進(jìn)行測(cè)定，不能有效地針對(duì)黃連及大黃進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。近期關(guān)于一清顆粒質(zhì)量控制的研究集中在制備工藝[2]、指紋圖譜[3]、使用HPLC法檢測(cè)更多的目標(biāo)化合物[4]及針對(duì)其中大黃蒽醌類(lèi)化合物的測(cè)定進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行有效的質(zhì)量控制[5-7]。本文以超高效液相聯(lián)合三重四級(jí)桿質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS法)來(lái)針對(duì)一清顆粒中的5種標(biāo)識(shí)成分進(jìn)行含量測(cè)定，質(zhì)譜檢測(cè)法可以在測(cè)定多種成分的時(shí)，對(duì)被測(cè)成分在液相條件下的分離度沒(méi)有強(qiáng)制要求，能具有更高的專(zhuān)屬性和靈敏度。通過(guò)對(duì)一清顆粒中黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的液相條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，形成較為成熟的UPLC-MS/MS含量測(cè)定方法，可以在日常工作中幫助檢驗(yàn)檢測(cè)人員有效地提高檢驗(yàn)工作時(shí)的工作效率和準(zhǔn)確程度，為更全面地針對(duì)不同廠(chǎng)家，不同批次的一清顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超高效液相色譜儀，型號(hào)：ACQUITY UPLC (美國(guó)Waters)； 線(xiàn)型離子阱質(zhì)譜分析儀，型號(hào)：4000 QTrap(美國(guó)Sciex)；電子分析天平，型號(hào)：XS205DU(瑞士Mettler Toledo)；超聲波清洗機(jī)，型號(hào)：SB-800DTD(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥 對(duì)照品均為中國(guó)食品藥品檢定研究院生產(chǎn)，分別為：黃芩苷(110715-201619，93.5%)、鹽酸小檗堿(110713-201814，86.7%)、大黃素(110756-201512，98.7%)、大黃酚(110796- 201922，99.4% )、大黃素甲醚(110758-201817，99.2%)；一清顆粒均為河南省及鄭州市2018～2020年度安全監(jiān)督抽檢樣品；乙腈、甲醇(德國(guó)Merck)；甲酸(美國(guó)Fisher)；純凈水(杭州娃哈哈公司)。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEN C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脫程序(0～3 min，20%→90%A；3～4 min，90%A；4～4.5 min，90%→20%A)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)；正、負(fù)離子實(shí)時(shí)切換模式；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；源噴射電壓：5500V/-4500V(隨離子模式實(shí)時(shí)切換)；源內(nèi)溫度(TEM)：500 ℃；氣簾氣壓力(CAD)：20 psi；渦旋氣壓力(GAS1、GAS2)：50 psi；碰撞室氣體：氮?dú)?。黃芩苷等5個(gè)成分具體質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 線(xiàn)性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限

表1 黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷和大黃素的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取5種對(duì)照品(黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚)適量，分別置于適合的容量瓶中，分別取適量體積置100 mL量瓶中，加甲醇制成混合對(duì)照品溶液，對(duì)應(yīng)各濃度分別為197.5362μg/mL、52.0497 μg/mL、0.5116 μg/mL、0.5053 μg/mL、0.5071 μg/mL。

2.3 供試品溶液制備 取本品10袋，倒出混合后精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取約0.l g，置100 mL錐形瓶中，加入70%甲醇50 mL，精密稱(chēng)定。置超聲機(jī)中滿(mǎn)功率超聲30 min，取出放至室溫，稱(chēng)重后如有重量損失，使用70%甲醇補(bǔ)足其減失的重量，搖勻后使用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備 取空白輔料，按藥典一清顆粒制法項(xiàng)下的比例混合，制得陰性對(duì)照樣品，按2.3項(xiàng)下的方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別精密吸取稀釋后的混合對(duì)照品溶液(精密量取混合對(duì)照品溶液5 mL，置 50 mL 量瓶中，加適量甲醇稀釋?zhuān)⒍ㄈ葜量潭?，即?、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各 1 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件與質(zhì)譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示：供試品及對(duì)照品溶液在各成分的提取離子流圖(XIC)中出峰時(shí)間一致，而陰性對(duì)照溶液在對(duì)應(yīng)的XIC圖中均沒(méi)有干擾，其專(zhuān)屬性強(qiáng)。

1.黃芩苷；2.鹽酸小檗堿；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚；A.對(duì)照品溶液； B.供試品溶液； C .陰性對(duì)照溶液圖1 5種成分的提取離子流圖

2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1.00、5.00、10.00、50.00 mL，分別置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻即得。以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，分別以信噪比S/N=3、S/N=10時(shí)的濃度作為檢測(cè)限和定量限，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1，各成分在對(duì)應(yīng)范圍內(nèi)的線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下的稀釋后的混合對(duì)照品溶液，取連續(xù)進(jìn)樣6次的數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素及大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.37%、2.21%、4.33%、4.49%、4.25%，顯示本方法的精密度符合要求。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為01的一清顆粒細(xì)粉各6分，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得各成分的平均含量分別為1.377、0.373、0.762、16.361 、4.357 mg/片，其RSD分別為3.89%、4.18%、4.76%、2.32%、2.18%，顯示本方法重復(fù)性符合要求。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份編號(hào)為01的供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h后測(cè)定。結(jié)果各成分的RSD分別為2.12%、2.38%、4.17%、4.42%、3.97%，表明該供試品溶液在12 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 隨機(jī)取同一批一清顆粒(編號(hào)為01)，精密稱(chēng)取其顆粒細(xì)粉0.05 g，精密加入混合對(duì)照品溶液適量，制備6份加標(biāo)供試品溶液的平行樣，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果顯示，各成分的平均加樣回收率分別為96.37%、95.15%、89.57%、90.64%、87.13%，其RSD分別為2.74%、2.19%、2.44%、2.56%、3.03% 。

2.11 供試品含量測(cè)定 全部樣品共9批一清顆粒，按照“2.3”項(xiàng)下方法，分別制備供試品溶液進(jìn)行分析，通過(guò)回歸方程計(jì)算其5種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 供試品含量測(cè)定結(jié)果 (mg/包,n=2)

3 討論

3.1 目標(biāo)化合物的選擇 通過(guò)藥典的記載得知，一清顆粒的處方為黃連、黃芩與大黃三味藥材，通過(guò)分別煎煮后濃縮成浸膏粉，混合加輔料制成顆粒[1]。其中大黃的用量最大，不使用含量測(cè)定的方法對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制顯然不夠嚴(yán)謹(jǐn)。沿用藥典選擇的黃芩苷作為黃芩的標(biāo)志物的思路，實(shí)驗(yàn)中增加了鹽酸小檗堿作為黃連的標(biāo)志物，選用大黃素、大黃酚以及大黃素甲醚作為大黃的標(biāo)志物進(jìn)行含量測(cè)定，使用液質(zhì)聯(lián)用方法，一次性針對(duì)其中的目標(biāo)成分進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而能夠保證對(duì)其進(jìn)行更為全面的質(zhì)量控制。

3.2 提取方法的優(yōu)化 針對(duì)供試品前處理中的提取方式、選用溶劑與提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化研究。其中提取方式選擇了直接超聲和回流提取，結(jié)果顯示二者提取率差異較小，而超聲提取操作較為便捷。選擇的溶劑包括甲醇、50%甲醇、70%甲醇與90%甲醇，最終選用提取率較高的70%甲醇。超聲提取時(shí)間在 15 min、30 min與45 min之間進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明選用超聲30 min的樣品，其提取率明顯高于15 min，與45 min的樣品相比差別不明顯。經(jīng)綜合考量，最終確定選用提取溶劑為70%甲醇，超聲提取時(shí)間選擇30 min。

3.3 色譜條件的優(yōu)化 流動(dòng)相的優(yōu)化先采用相同比例的甲醇-水、甲醇-水(含0.1%甲酸)、乙腈-水、乙腈-水(含0.1%甲酸)進(jìn)行考察。結(jié)果顯示使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，其圖譜的峰型比甲醇的更好，目標(biāo)化合物的分離程度也更好；而對(duì)比加入0.1%的甲酸的水相與純水相，可明顯看到加入0.1%的甲酸可以有效增強(qiáng)這5種化合物的信號(hào)強(qiáng)度，也能改善峰形的對(duì)稱(chēng)性。最后考察了不同梯度的洗脫方式，進(jìn)一步提升了分離效率。最終選擇乙腈-水(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式進(jìn)行試驗(yàn)。

3.4 結(jié)果分析 綜上所述，本試驗(yàn)建立了使用UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定一清顆粒中5個(gè)成分的含量，9批樣品測(cè)定結(jié)果中可以看出，黃芩苷作為藥典方法的控制因素，其含量測(cè)定結(jié)果顯示，各批次間差異較小，且均符合藥典規(guī)定(每袋不得少于21 mg)。鹽酸小檗堿的含量測(cè)定結(jié)果，各個(gè)批次差異也相對(duì)較??；而以大黃素、大黃酚、大黃素甲醚作為大黃藥材的特征成分來(lái)看，各批次間呈現(xiàn)出較大差異。