周業(yè)飛，張琰杰，柳依靈

(南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210017)

目前，密閉式乳頭飲水器在我國(guó)蛋雞養(yǎng)殖中被廣泛使用，可以有效封閉水源，避免浪費(fèi)水，提高雞只飲用水品質(zhì)[1]。有助于保持雞舍干燥、減少發(fā)酵和氨氣的釋放，在蛋雞養(yǎng)殖收益中發(fā)揮著重要作用[2]。但長(zhǎng)期使用后，飲水管道壁和飲水乳頭與管道間隙特別容易滋生細(xì)菌，空腸彎曲桿菌、大腸桿菌、假單胞菌和沙門菌等蛋雞飲用水中常見(jiàn)微生物可通過(guò)水線(飲水管道)水傳播給蛋雞，從而給蛋雞健康養(yǎng)殖造成潛在風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，乳頭式密閉式飲水系統(tǒng)的水質(zhì)是蛋雞養(yǎng)殖過(guò)程中重要質(zhì)控點(diǎn)之一，一些病原菌可能通過(guò)水傳播給蛋雞，因此水線(飲水管道)水的生物安全衛(wèi)生控制是養(yǎng)殖企業(yè)重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。

本試驗(yàn)對(duì)江蘇南京某蛋雞場(chǎng)水線水采樣，并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、藥敏試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)，以期為該蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)乃至該地區(qū)臨床用藥和水質(zhì)管理提供參考建議和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水線水樣品 用無(wú)菌離心管直接采集江蘇南京某規(guī)模化蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)乳頭式密閉式飲水系統(tǒng)的水線(飲水管道)水樣品10 mL。

1.2 主要試劑 所用培養(yǎng)基、生化反應(yīng)管，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；PCR試劑，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；微量生化鑒定管，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏紙片(直徑6.0 mm)，購(gòu)自常德比克曼生物有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 50只21日齡雛雞，購(gòu)自南京家禽所種禽孵化場(chǎng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌的分離純化 無(wú)菌蘸取水線樣品接種在NAC瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h，觀察菌落形態(tài)特征，選取典型菌落純培養(yǎng)再接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、S.S.瓊脂和血平板上，37 ℃培養(yǎng)12～24 h。對(duì)純培養(yǎng)的分離株進(jìn)行革蘭染色并鏡檢，觀察菌落形態(tài)。

1.4.2 分離菌株的生化鑒定 根據(jù)綠膿桿菌常見(jiàn)生化試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和鑒定。

1.4.3 分離菌株的PCR鑒定 根據(jù)已報(bào)道[4]的綠膿桿菌外毒素A(ETA)基因序列設(shè)計(jì)引物，ETA1和ETA2的序列分別為：5′-GACAACGCCCTCAGCATCACCAGC-3′和5′-CGCTGGCCCATTCGCTCCAGCG-CT-3′，擴(kuò)增該基因上一段369 bp的區(qū)域。采用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提的細(xì)菌DNA為模板，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 將PCR產(chǎn)物送至南京擎科生物科技股份有限公司測(cè)序。

1.4.4 藥敏試驗(yàn) 利用紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，挑取純培養(yǎng)的綠膿桿菌單菌落溶于無(wú)菌生理鹽水中，并均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，并等距貼上藥敏紙片，置37 ℃溫箱培養(yǎng)18 h，抑菌環(huán)直徑判定依據(jù)歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(EUCAST)。

1.4.5 致病性試驗(yàn) 挑取純培養(yǎng)的單菌落溶于無(wú)菌PBS中制成菌懸液，按傾注平板培養(yǎng)方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。將50只21日齡雛雞隨機(jī)分成2個(gè)組，每組25只。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)試驗(yàn)組雛雞采取胸肌注射菌懸液0.2 mL/只(含菌量為3×108CFU/mL)，對(duì)照組雛雞接種無(wú)菌PBS 0.2 mL/只。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的鑒定及形態(tài)觀察 從水線水中分離的細(xì)菌，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成表面光滑濕潤(rùn)、微隆、邊緣不整齊的黃綠色的菌落(圖1)。在S.S.瓊脂培養(yǎng)基上有紅色單菌落生長(zhǎng)(圖2)，挑取紅色菌落接種在血平板上呈β溶血環(huán)，經(jīng)革蘭染色、鏡檢后確定為革蘭陰性桿菌。

圖1 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology on common nutrient AGAR medium

圖2 S.S.瓊脂培養(yǎng)基上紅色的單菌落Fig.2 Red single colonies on S.S.AGAR medium

2.2 分離菌株的生化鑒定 分離菌株的生化項(xiàng)目鑒定結(jié)果見(jiàn)表1，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，初步判定為綠膿桿菌。

表1 分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Biochemical test results of isolated strains

2.3 分離菌株的PCR鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得的目的條帶大小與預(yù)期相符(圖3)。同時(shí)測(cè)序結(jié)果在NCBI上經(jīng)BLAST對(duì)比表明：分離的菌株為綠膿桿菌。

圖3 分離菌株P(guān)CR鑒定Fig.3 PCR identification of isolated strains1：綠膿桿菌外毒素A(ETA)基因； 2：陰性對(duì)照； M：DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1:ETA gene fragment of isolate; 2:Negative control; M:DL-2 000 DNA marker

2.4 藥敏試驗(yàn) 由表2可知，綠膿桿菌分離株對(duì)頭孢他啶、鹽酸左氧氟沙星、硫酸阿米卡星、青霉素鉀、環(huán)丙沙星較為敏感；對(duì)頭孢克肟、氟苯尼考、林可霉素、磷霉素鈣、鹽酸多西環(huán)素、阿莫西林、單硫卡耐藥性較強(qiáng)。

表2 2株分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test results of 2 isolated strains

2.5 致病性試驗(yàn) 人工感染雛雞后，試驗(yàn)組雛雞表現(xiàn)出精神沉郁、食欲不振、拉稀等明顯的發(fā)病臨床癥狀，發(fā)病后期出現(xiàn)震顫或轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀。雛雞在接種后12 h開(kāi)始死亡，96 h后全部死亡。對(duì)死亡的病雞剖檢可見(jiàn)死雞皮下及胸肌表面附著淡黃色、膠胨樣水腫液，病程稍久的死雞胸肌化膿呈干酪樣。早期死亡雞心包積液，后期死亡雞可見(jiàn)心包炎。肝臟見(jiàn)出血點(diǎn)，脾臟壞死，肺淤血、水腫。從試驗(yàn)組雛雞的皮下水腫液、肝臟中均可分離到與原代分離菌株形態(tài)特征和生化特性相同的菌株。對(duì)照組雛雞均存活，且無(wú)明顯臨床癥狀，剖檢后無(wú)肉眼可見(jiàn)病灶及出血點(diǎn)，細(xì)菌回歸試驗(yàn)結(jié)果為陰性，表明該分離菌對(duì)雛雞具有高度致病性。

3 討論

飲用水對(duì)維持蛋雞免疫功能和體內(nèi)電解質(zhì)平衡至關(guān)重要，對(duì)蛋雞的健康發(fā)揮重要和持續(xù)的作用[5]。通過(guò)改善衛(wèi)生條件，防止水傳播疾病，是蛋雞健康養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展目標(biāo)的一個(gè)關(guān)鍵組成部分。目前，在蛋雞飲用水中常被檢出假單胞菌屬、葡萄球菌屬和大腸桿菌屬等微生物群落，也有彎曲桿菌屬和沙門菌屬等人獸共患病病原體被檢出[6-7]。與革蘭陽(yáng)性菌相比，革蘭陰性菌的檢出率更高，這可能是因?yàn)槊荛]式乳頭飲水系統(tǒng)中更適合革蘭陰性菌形成微生物生物膜[8]。

綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)又稱銅綠假單胞菌，屬假單胞菌屬，是一種條件性致病菌，是導(dǎo)致人類條件性感染的三大原因之一，在家禽養(yǎng)殖中也是一種重要的條件性致病菌，在雞群中可迅速傳播，引起較高的死亡率[9-10]。該菌廣泛分布于自然界中，是一種多功能的革蘭陰性菌，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力和抵抗能力較強(qiáng)，可引起多種動(dòng)物的臟器出現(xiàn)膿腫現(xiàn)象[11]，主要因?yàn)樵摼梢援a(chǎn)生如黏附素、多糖莢膜和內(nèi)外毒素等多種致病因子，通過(guò)阻遏真核細(xì)胞蛋白合成等途徑產(chǎn)生有毒物質(zhì)，并損傷機(jī)體的多種組織和器官[12]。有報(bào)道稱，也會(huì)與雞大腸桿菌、沙門菌和新城疫等病原體混合感染，引起肉雞的較高死亡率，在蛋雞養(yǎng)殖業(yè)中也是不容忽視的威脅之一，可導(dǎo)致胚胎發(fā)育停止或死亡，也會(huì)給剛出殼的雛雞造成局部或全身性疾病[13-14]。近年來(lái)，我國(guó)蛋雞養(yǎng)殖業(yè)也會(huì)受到綠膿桿菌感染的影響，其感染以后發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[15]，由于該病在1～5日齡的雛雞中多發(fā)，且感染后多出現(xiàn)各種實(shí)質(zhì)器官損傷，死亡率高，嚴(yán)重制約蛋雞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，加上在養(yǎng)殖過(guò)程中對(duì)于用藥的不科學(xué)和不合理，導(dǎo)致綠膿桿菌的耐藥問(wèn)題也日益加重[16]。為了對(duì)該病的防控和用藥等方面有所指導(dǎo)，本試驗(yàn)從蛋雞水線水中分離出致病性較強(qiáng)的綠膿桿菌，為蛋雞養(yǎng)殖企業(yè)水線消毒劑的種類精準(zhǔn)選擇提供了可行性理論依據(jù)，提醒養(yǎng)殖者重視綠膿桿菌污染造成的潛在危險(xiǎn)，保障雞群飲水水質(zhì)衛(wèi)生質(zhì)量，防止水傳播病原菌在蛋雞群中的流行。

抗菌藥物耐藥性在家禽細(xì)菌感染中具有重要意義，因?yàn)樗梢允箍咕幬锏目咕Ч麥p弱甚至無(wú)效，是造成人類菌群或其他細(xì)菌耐藥性的一個(gè)重要因素[17]。不同地區(qū)和不同場(chǎng)所分離的綠膿桿菌也會(huì)因?yàn)榛蛐筒煌蛴盟幜亢头N類不同而產(chǎn)生多重耐藥性[18]。有研究報(bào)道[19]從雞心包炎中分離的綠膿桿菌對(duì)阿奇霉素、慶大霉素﹑左氧氟沙星、新霉素和諾氟沙星等高度敏感，對(duì)多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、多黏菌素和丁胺卡那霉素等中度敏感，對(duì)阿莫西林和氨芐西林等不敏感。本試驗(yàn)通過(guò)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離的綠膿桿菌對(duì)頭孢克肟、氟苯尼考、林可霉素、磷霉素鈣、鹽酸多西環(huán)素、阿莫西林、單硫卡耐藥性較強(qiáng)。對(duì)頭孢他啶、鹽酸左氧氟沙星、硫酸阿米卡星、青霉素鉀、環(huán)丙沙星較為敏感。由于環(huán)丙沙星、慶大霉素、阿米卡星不存在交叉耐藥性[20]，所以可以考慮聯(lián)合用藥。根據(jù)藥敏試驗(yàn)進(jìn)行藥物篩選和選擇合理的藥物，是目前蛋雞養(yǎng)殖精準(zhǔn)用藥管理的需求，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2019年發(fā)布的194號(hào)公告，飼料端“禁抗”，養(yǎng)殖端“減抗、限抗”大勢(shì)已定，而且會(huì)越來(lái)越嚴(yán)格。因此，除了對(duì)密閉式乳頭飲水系統(tǒng)的水線水及時(shí)和定期消毒外，一旦發(fā)現(xiàn)水傳播疫情時(shí)，應(yīng)當(dāng)及時(shí)進(jìn)行臨床檢測(cè)和病原學(xué)鑒定，合理使用敏感性藥物，交替輪換用藥，忌濫用藥和亂用藥，做好防治工作，將養(yǎng)殖損失降低到最小。