田文靜，廖成水，李 琦，毛福超，程相朝

(1. 洛陽職業(yè)技術學院食品與藥品學院，河南 洛陽 471003 ； 2.河南科技大學動物科技學院 洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，河南 洛陽 471023)

腸炎沙門菌(Salmonellaenteritidis)是臨床上常見的宿主廣泛的食源性腸道病原體，它可以引起動物感染疾病，甚至造成人的食物中毒，嚴重者出現(xiàn)全身性敗血癥[1-2]。腸炎沙門菌作為人獸共患病病原菌，給養(yǎng)殖行業(yè)以及人類的健康帶來了嚴重的危害，被大眾廣泛關注和研究[3]。腸炎沙門菌的致病性主要是依賴于一些毒力因子，如菌毛、莢膜、鞭毛和脂多糖等[4]。為了能在宿主中存活，許多細菌分泌多種胞外酶，例如蛋白酶、脂肪酶、透明質(zhì)酸酶和胞外核酸酶等，這些酶能使細菌逃避宿主的免疫系統(tǒng)[5]。這些酶類可以固定在細胞外膜上，也可以釋放到細胞外空間[6]。其中，胞外核酸酶是一種由人類、動物、細菌、真菌、寄生蟲等多種生物分泌的酶類，能夠降解環(huán)境中DNA或RNA的酶類，對于細菌的毒力、生物被膜的形成、黏附、侵襲以及利用胞外DNA獲取營養(yǎng)起著重要作用[7-9]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，胞外核酸酶還能防御中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)，降解胞外誘捕網(wǎng)中的DNA[10]。

雖然近年來在研究腸炎沙門菌致病機制方面取得一定的進展，但關于腸炎沙門菌分泌的胞外蛋白在其致病機制中的作用尚未見報道。因此，本試驗通過瓊脂糖凝膠電泳法、瓊脂擴散法和瓊脂培養(yǎng)法檢測腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性，并從溫度、pH和金屬離子等因素探究腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶的最適反應條件。試驗結果不僅能為研究胞外分泌蛋白的核酸酶提供理論依據(jù)，并為進一步研究腸炎沙門菌病的致病機制以及逃避機體免疫作用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑 腸炎沙門菌由筆者實驗室保存。DNase I，購自TaKaRa(大連)有限公司；λDNA，購自德國Sigma公司；核酸染料GoldView和BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、NaCl、瓊脂、酵母浸粉、瓊脂粉、瓊脂糖等常用試劑,均為國產(chǎn)分析純，均購自天津市德恩化學試劑有限公司。

1.2 腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的收集 取-70 ℃超低溫冰箱保存的腸炎沙門菌，利用固體培養(yǎng)基進行活化培養(yǎng)、傳代，挑取固體培養(yǎng)基上的單菌落接種到普通液體培養(yǎng)基中，放入溫度為37 ℃、轉速為180 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，然后按1 mL菌液轉接至新鮮的10 mL普通液體培養(yǎng)基中，同樣溫度和轉速培養(yǎng)5 h后，用低溫離心機高速離心15 min，取上清液，將上清液透析，獲取胞外蛋白，BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定所獲胞外蛋白的濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 瓊脂培養(yǎng)法測定腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性 以50 mmol/L的PBS溶液(pH 7.0)為基礎溶液配制普通培養(yǎng)基進行滅菌，加入無菌的λDNA，使其終濃度達到50 μg/mL，另外再加入GoldView核酸染料，使染料終濃度達到1 μg/mL，倒入平皿涼干備用。將已培養(yǎng)的腸炎沙門菌菌液稀釋到合適濃度，取100 μL菌液均勻涂抹在固體平板上，放置到37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，取出放入凝膠成像系統(tǒng)，觀察平板上各菌落周圍λDNA的降解程度。

1.4 瓊脂擴散法測定腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性 按1.3中方法配置固體培養(yǎng)基，用打孔器打4個直徑為5 mm的孔，向其中3個孔中分別加入LB液體培養(yǎng)基(陰性對照組)、DNase I(陽性對照組)、胞外分泌蛋白(試驗組)，剩余1個孔不加任何試劑，作為空白對照組。恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h， 利用凝膠成像系統(tǒng)觀察4個孔周圍λDNA的降解程度。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳法測定腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性 通過設置對照組進行測定，試驗組：胞外分泌蛋白的濃度分別為1、2、3、4 μg/mL和5 μg/mL；5 μL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)、1 μL λDNA，ddH2O補充到總體積為20 μL，混合均勻。以λDNA(0.01 μg)作為參照量，DNase I為陽性對照組，普通培養(yǎng)基為陰性對照組。37 ℃恒溫水浴30 min后，通過瓊脂糖凝膠電泳法測定產(chǎn)物。

1.6 溫度對腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響 參照1.5的方法，根據(jù)預試驗將λDNA質(zhì)量調(diào)至0.1 μg，其他參數(shù)不變，設置不同溫度梯度，分別為4、16、25、30、37、42、50 ℃和60 ℃，檢測溫度變化對腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響，以λDNA(0.1 μg)作為參照量，凝膠成像系統(tǒng)進行觀察。同樣參照1.5的方法，根據(jù)預試驗將λDNA質(zhì)量調(diào)至0.05 μg，其他參數(shù)不變，將胞外分泌蛋白分別在50、60、70 ℃和80 ℃孵育20 min。以λDNA(0.05 μg)作為參照量，按同樣操作，檢測其熱穩(wěn)定性。

1.7 pH對腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響 參照1.5的方法，根據(jù)預試驗將λDNA質(zhì)量調(diào)至0.05 μg，分別向反應體系中加入5 μL不同pH 的緩沖溶液(pH 3.0～11.0)，37 ℃孵育20 min。以λDNA(0.05 μg)作為參照量，同樣利用凝膠成像系統(tǒng)觀察pH變化對胞外分泌蛋白的核酸酶活性的影響。

1.8 金屬離子對腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響 參照1.5的方法，測定鈉離子(Na+)、鉀離子(K+)、鈣離子(Ca2+)、鈷離子(Co2+)、鋇離子(Ba2+)、鎂離子(Mg2+)、鎳離子(Ni2+)、鋅離子(Zn2+)、銅離子(Cu2+)、錳離子(Mn2+)和鐵離子(Fe3+)對胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響，配置上述不同金屬離子終濃度分別為0.01、0.1、1、5 mmol/L和10 mmol/L的20 μL反應體系，根據(jù)預試驗將λDNA質(zhì)量調(diào)至0.05 μg，其他參數(shù)不變，37 ℃孵育20 min，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察。

2 結果

2.1 瓊脂培養(yǎng)法測定腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性 將稀釋后的腸炎沙門菌菌液均勻涂抹在固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，利用凝膠電泳成像系統(tǒng)觀察，結果如圖1A所示，固體瓊脂平板上有單個菌落長出且菌落周圍出現(xiàn)酶切圈，腸炎沙門菌胞外分泌蛋白表現(xiàn)出對λDNA具有切割能力，說明胞外分泌蛋白具有核酸酶活性。

圖1 瓊脂培養(yǎng)法測定腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性Fig.1 Detection of nuclease activity in Salmonella enteritidis exocrine proteins by agar culture assayA：胞外分泌蛋白； B：對照A:Extracellular secreted proteins; B:Control

2.2 瓊脂培養(yǎng)法測定腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性 將含有λDNA和核酸染料的瓊脂平板打4個孔，并加入對應的溶液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。凝膠電泳成像儀觀察結果如圖2所示，DNase I陽性對照組和胞外分泌蛋白試驗組出現(xiàn)了酶切圈，說明λDNA被降解，而陰性對照組和空白對照組沒有出現(xiàn)酶切圈(圖2)，進一步證實了腸炎沙門菌胞外分泌蛋白具有切割λDNA的能力，具有核酸酶活性。

圖2 瓊脂擴散法測定腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性Fig.2 Detection of the nuclease activity in Salmonella enteritidis exocrine proteins by agar diffusion methodA：DNase Ⅰ 陽性對照組； B：胞外分泌蛋白試驗組； C：陰性對照組； D：空白對照組A:DNase Ⅰ positive control group； B:Extracellular secreted proteins experimental group; C:Negative control group； D:Blank control group

2.3 瓊脂糖凝膠電泳法測定腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性 通過瓊脂糖凝膠電泳法測定腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性[11]，結果如圖3所示，DNase I陽性對照組中的λDNA被完全降解，陰性對照組中的λDNA未被降解，試驗組不同濃度的胞外分泌蛋白均能將λDNA降解，并且隨著胞外分泌蛋白濃度的增加核酸酶的活性逐漸增強，4 μg/mL胞外分泌蛋白就可以把λDNA完全降解。結果說明腸炎沙門菌胞外分泌的蛋白具有核酸酶活性。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳法測定腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性Fig.3 Detection of the nuclease activity in Salmonella enteritidis exocrine proteins by agarose gel electrophoresis 1：λDNA； 2：DNase Ⅰ 陽性對照組； 3：陰性對照組； 4～8：1、2、3、4 μg/mL和5 μg/mL胞外分泌蛋白試驗組1:λDNA； 2:DNase Ⅰ positive control group； 3:Negative control group； 4-8:1,2,3,4 μg/mL and 5 μg/mL extracellular secreted proteins experimental group

2.4 溫度對腸炎沙門菌分泌蛋白核酸酶活性的影響 通過檢測溫度對胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，在不同溫度下胞外分泌蛋白均能表現(xiàn)出降解λDNA的活性，其中在4～30 ℃時胞外分泌蛋白的核酸酶活性較弱，37～50 ℃時核酸酶活性較強，37 ℃時降解λDNA活性最強(圖4A)，60 ℃時酶活性又有所降低。對其熱穩(wěn)定性進行分析，腸炎沙門菌胞外分泌蛋白經(jīng)50、60、70 ℃和80 ℃處理后再進行酶切試驗。結果顯示，胞外分泌蛋白在低于60 ℃時具有核酸酶活性，在高于60 ℃時核酸酶活性降低，但并未完全消失(圖4B)。結果表明腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶的熱穩(wěn)定性差。

圖4 溫度對腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the nuclease activity of Salmonella enteritidis exocrine proteinsA：胞外分泌蛋白在不同孵育溫度下的核酸酶活性(1：λDNA； 2：4 ℃； 3：16 ℃； 4：25 ℃； 5：30 ℃； 6：37 ℃； 7：42 ℃； 8：50 ℃； 9：60 ℃);B：胞外分泌蛋白在高溫條件下的熱穩(wěn)定性(1：λDNA； 2：50 ℃； 3：60 ℃； 4：70 ℃； 5：80 ℃)A:Nuclease activity of extracellular secreted proteins at different temperatures; B:Heat stability of extracellular secreted proteins under high temperature conditions

2.5 pH對腸炎沙門菌分泌蛋白核酸酶活性的影響 采用瓊脂糖凝膠電泳法測定不同pH環(huán)境對腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響，結果如圖5所示，腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶在環(huán)境pH 3.0～6.0時酶活性較弱，而在pH 7.0～8.0時腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶活性逐漸增強，pH 8.0時胞外分泌蛋白的核酸酶活性最高，pH 9.0～11.0時核酸酶活性又被有所抑制。

圖5 pH對腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響Fig.5 Effect of pH on nuclease activity of Salmonella enteritidis exocrine proteins1：λDNA； 2：pH 3.0； 3：pH 4.0； 4：pH 5.0； 5：pH 6.0；6：pH 7.0； 7：pH 8.0； 8：pH 9.0； 9：pH 10.0； 10：pH 11.0

2.6 金屬陽離子對腸炎沙門菌分泌蛋白核酸酶活性的影響 用瓊脂糖凝膠電泳法測定不同濃度金屬陽離子對腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響。結果如圖6所示，不同金屬陽離子對腸炎沙門菌胞外分泌蛋白切割DNA的能力影響存在顯著差異，其中Na+、K+(0.01～10 mmol/L)對胞外分泌蛋白的核酸酶活性沒有影響；Ca2+在低濃度時(0.01 mmol/L)促進胞外分泌蛋白的核酸酶活性，在0.1～10 mmol/L時抑制胞外分泌蛋白的核酸酶活性；Co2+、Cu2+、Mg2+、Ba2+和Fe3+五種金屬離子濃度為0.01～1 mmol/L時抑制胞外分泌蛋白的核酸酶活性，濃度為5～10 mmol/L時促進胞外分泌蛋白的核酸酶活性；而Ni2+、Zn2+和Mn2+三種金屬離子則是在低濃度區(qū)間(0.01～1 mmol/L)時能促進胞外分泌蛋白的核酸酶活性，在高濃度區(qū)間(5～10 mmol/L)時可抑制胞外分泌蛋白的核酸酶活性(圖6)。

圖6 金屬陽離子對腸炎沙門菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響Fig.6 Effect of metal ions on nuclease activity of Salmonella enteritidis exocrine proteinsA：Na+； B：K+； C：Ca2+； D：Co2+； E：Ba2+； F：Mg2+； G：Ni2+； H：Zn2+； I：Cu2+； J：Mn2+； K：Fe3+1：λDNA； 2：λDNA+DNase Ⅰ； 3：λDNA+胞外蛋白； 4～8：各離子不同濃度(0.01、0.1、1、5 mmol/L和10 mmol/L)1:λDNA; 2:λDNA and DNase Ⅰ; 3:λDNA and extracellular secreted proteins; 4-8:Different concentrations of each ion(0.01,0.1,1,5 mmol/L and 10 mmol/L)

3 討論

鞭毛、纖毛、Ⅲ型分泌系統(tǒng)、黏附系統(tǒng)、外毒素等是沙門菌致病機制研究中常見的致病因子[12-13]，但腸炎沙門菌分泌的胞外蛋白在其致病過程中的作用至今尚未見報道。本試驗以腸炎沙門菌分泌的胞外蛋白為切入點，初步研究腸炎沙門菌分泌的胞外蛋白是否具有核酸酶的活性，然后對影響酶活性的因素進行研究，分析酶學特性。本試驗證明了腸炎沙門菌胞外分泌蛋白具有切割λDNA的能力，并且隨其濃度增加，胞外分泌蛋白核酸酶的切割能力逐漸加強，說明腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶具有活性，該結果為今后研究腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶在致病過程中以及逃避機體免疫作用提供了新的思路。

細菌胞外核酸酶在人類和植物的致病菌中尤為常見，致病菌分泌的胞外蛋白核酸酶主要具有內(nèi)切活性。部分胞外核酸酶以鑲嵌形式存在于細胞膜上，有的則可以直接分泌到周圍的環(huán)境中，均為I型核酸酶，該酶型不僅具有核酸內(nèi)切酶，同時還具有3′核苷酸酶活性，可以降解RNA、ssDNA、dsDNA等底物[14-16]。在不同環(huán)境中，多種因素均能影響核酸酶的活性，例如溫度、酸堿和金屬離子等。多數(shù)微生物核酸酶在溫度35～44 ℃表現(xiàn)出高活性[17]，如DNase、ITREX1和FEN I等核酸酶最佳活性溫度是37 ℃。本試驗結果顯示，腸炎沙門菌胞外核酸酶在37～50 ℃均表現(xiàn)出較高活性，最適酶活性溫度為37 ℃，說明腸炎沙門菌分泌的胞外核酸酶可能屬于I型核酸酶。通常情況下，微生物產(chǎn)生的核酸酶在pH 6.0～10.0時具有活性，且在反應環(huán)境pH 8.0～8.5時活性最高[17]，而本試驗發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門菌分泌的核酸酶在pH 8.0時活性最高，在酸性條件下(pH 3.0～7.0)胞外核酸酶的活性較弱，這說明腸炎沙門菌胞外分泌蛋白中可能不存在酸性核酸酶或者含量較少。大多數(shù)核酸酶的活性至少需要Ca2+和Mg2+離子活化[18]。本試驗發(fā)現(xiàn)，Ca2+在低濃度時能促進胞外分泌蛋白的核酸酶活性，而超過0.1 mmol/L時則出現(xiàn)抑制胞外分泌蛋白的核酸酶活性現(xiàn)象；而Mg2+則在高濃度時能促進胞外分泌蛋白的核酸酶活性，這說明該胞外核酸酶依賴Ca2+和Mg2+離子的活化，但對其依賴的濃度不同。本試驗還發(fā)現(xiàn)，無論低濃度還是高濃度的Na+和K+都不能促進腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性；Co2+、Cu2+、Mg2+、Ba2+和Fe3+五種金屬離在高濃度時促進胞外分泌蛋白的核酸酶活性；而Ni2+、Zn2+和Mn2+三種金屬離子則是在低濃度時促進胞外分泌蛋白的核酸酶活性，試驗結果充分說明了該胞外核酸酶具有金屬離子選擇依賴性，還能表明腸炎沙門菌胞外分泌蛋白可能存在不止一種具有活性的核酸酶。

對于致病菌來說，胞外核酸酶不僅可以影響生物被膜上DNA的含量，提供補救合成核苷酸的原料，還有可能參與致病菌對抗宿主的免疫應答[19-21]。在生物膜形成過程中，這些核酸酶通過誘導生物膜擴散以控制生物膜的形成[22]，但是其潛在的分子和調(diào)控機制仍不為人所知，有待進一步闡明。有趣的是，Heun等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，希瓦氏菌的胞外核酸酶在生物膜形成過程中并沒有發(fā)揮重要作用，這充分地說明了不同的核酸酶具有不同的功能。本試驗證實了腸炎沙門菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性，但從核酸酶的部分酶學特性來看，該胞外分泌蛋白中可能含有多種核酸酶。所以，腸炎沙門菌胞外核酸酶是否與腸炎沙門菌生物被膜的形成存在聯(lián)系，有待以后繼續(xù)探究。在對抗宿主的免疫應答方面，胞外核酸酶的另一個重要功能是防御中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)，降解胞外誘捕網(wǎng)(ETs)中的DNA骨架，從而進行逃逸。研究發(fā)現(xiàn)，普氏菌[23]、化膿性鏈球菌[15]、分支結核桿菌[24]和金黃色葡萄球菌[25]等細菌所產(chǎn)生的胞外核酸酶能夠降解破壞ETs，對病原菌具有明顯的保護作用。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，某些寄生蟲分泌的胞外核酸酶也有破壞ETs的作用[26-27]，腸炎沙門菌是否也是通過分泌核酸酶的途徑逃避先天性免疫防御也是今后深入研究的一個方向。