胡玉婷，楊發(fā)龍，刀筱芳

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，MH)屬于巴氏桿菌科，是一種革蘭陰性球桿菌，其作為一種條件致病菌常存在于牛、羊等反芻動物上呼吸道的鼻腔和扁桃體隱窩等部位[1]。當(dāng)動物因長途運輸、飼養(yǎng)條件及天氣環(huán)境變化而受到應(yīng)激，或因支原體和病毒等病原感染而導(dǎo)致免疫功能下降時，其會迅速增殖并下行擴散至肺部，引起嚴重的肺炎。該病原是引起牛的呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)(運輸熱)最為重要的病原之一[2]。同時，溶血性曼氏桿菌也能感染山羊及綿羊等小反芻動物和美洲野牛、大角羊、大耳羊、麋鹿、駝鹿、鹿和叉角羚等反芻野生動物。也有研究發(fā)現(xiàn)，其還能夠感染某些非反芻動物，例如騾、兔、豬、鱷魚、狗和貓等[3]。目前，溶血性曼氏桿菌在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4]。由于溶血性曼氏桿菌對牛、羊養(yǎng)殖業(yè)帶來的巨大威脅，因此，國內(nèi)外學(xué)者對其致病機制，特別是對一些重要毒力因子的生物學(xué)特征以及在致病過程中發(fā)揮的作用進行了一系列研究，本文對近年來的相關(guān)研究進展進行了綜述。

1 分類地位及命名

目前，溶血性曼氏桿菌被歸為變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteob-acteria)、巴氏桿菌目(Pasteurellales)、巴氏桿菌科(Pasteurellaceae)、曼氏桿菌屬(Pasteurella)[5]。溶血性曼氏桿菌自首次分離以來，其分類和命名經(jīng)歷了多次變化。起初，Kitt[6]于1885年將其命名為多殺性雙極桿菌(Bacteriumbipolaremultocidum)。1932年,Newsom等[7]根據(jù)其在血平板表現(xiàn)弱溶血性的特點將其更名為溶血性巴氏桿菌(Pasteurellahaemolytica)。1959年，Smith[8]根據(jù)不同菌株發(fā)酵阿拉伯糖和海藻糖的能力將其分為2個生物型，即A型和T型。1960年，Biberstein等[9]根據(jù)莢膜表面抗原的不同將A型和T型的菌株分為17個血清型，其中A型包括A1、A2、A5～A9、A11～A14、A16和A17共13個血清型，而T型包括T3、T4、T10、T15血清型。隨后，Angen等[10-11]根據(jù)DNA-DNA雜交和16S rRNA測序的研究，把其中A11血清型單獨命名為葡萄糖苷曼氏桿菌(Mannheimiaglucosida)，而把其他A血清型命名為溶血性曼氏桿菌，所有T型菌株則命名為海藻糖巴氏桿菌(Pasteurellatrehalosi)[12]。2007年，Blackall等[13]又將其正式命名為海藻糖比伯斯坦桿菌(Bibersteiniatrehalose)。

對溶血性曼氏桿菌分類及命名的主要過程如圖1所示。

圖1 溶血性曼氏桿菌的分類及命名過程

2 血清型

在最初將溶血性曼氏桿菌歸為巴氏桿菌屬時，根據(jù)其分別發(fā)酵阿拉伯糖和海藻糖的能力將其分為2個生物類型：A型和T型[8]。Biberstein等[9]利用間接血凝試驗，根據(jù)莢膜表面抗原將A型和T型的菌株分為17個血清型，其中生物A型包括13種血清型，分別為A1、A2、A5～A9、A11～A14、A16和A17血清型，T型包括4種血清型，分別為T3、T4、T10、T15。隨后，將A型中A1、A2、A5～A9、A12～A14、A16和A17血清型命名為溶血性曼氏桿菌，A11血清型命名為葡萄糖苷曼氏桿菌(Mannheimiaglucosida)[10-11]。因此，目前溶血性曼氏桿菌共有12個血清型，分別為A1、A2、A5～A9、A12～A14、A16和A17血清型。

在溶血性曼氏桿菌的12種血清型中，A1、A2及A6血清型是流行最為廣泛的血清型，其次是A7、A9、A11和A12血清型[14]。雖然A1、A2和A6血清型都能感染牛、羊并定殖于上呼吸道，但表現(xiàn)為一定的宿主特異性，即感染不同宿主的血清型存在一定的差異。其中A1和A6血清型是引起牛肺炎的主要血清型。姜志剛等[15]對我國東北地區(qū)牛群感染溶血性曼氏桿菌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引起我國牛肺炎的溶血性曼氏桿菌血清型主要為A1和A6，分別占分離菌株的66.7%和33.3%，與國外的相關(guān)報道一致。雖然A2血清型菌株也存在于健康牛的上呼吸道，但普遍認為A2血清型在牛上僅作為非致病性血清型，在應(yīng)激或合并感染后，A1血清型很快取代A2血清型成為主要血清型，這種轉(zhuǎn)變可能是由感染的A1血清型菌株的病畜其傳播給感染A2血清型菌株的動物來完成的[16]。

關(guān)于感染山羊及綿羊的溶血性曼氏桿菌的優(yōu)勢血清型，相關(guān)報道并不一致。多數(shù)學(xué)者認為，A2血清型是感染羊的主要血清型，如：Fodor等[17]對從匈牙利山羊中分離得到的49株溶血性曼氏桿菌進行血清型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A2血清型所占比例高達94.0%。但也有報道與上述結(jié)果并不相符，如：Abay等[18]對山羊源溶血性曼氏桿菌陽性血清樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)A1血清型為優(yōu)勢血清型，占43.5%，其次是A2和A7血清型。因此，不同血清型與感染宿主之間的相關(guān)性尚無明確的結(jié)論。特別是不同血清型對綿羊和山羊致病性并不了解，值得進一步研究。

3 毒力因子

與大多數(shù)致病性細菌一樣，溶血性曼氏桿菌在其感染和進一步致病的過程中，是通過依靠各種毒力因子來完成的[14]。目前，已經(jīng)對溶血性曼氏桿菌的一些重要毒力因子進行了鑒定，其中包括對反芻動物白細胞具有特異性毒性的白細胞毒素(Leukotoxins，LKT)，能夠誘導(dǎo)炎性細胞因子應(yīng)答的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，能夠激發(fā)機體免疫應(yīng)答的外膜蛋白(Outer membrane proteins，OMP)，與細菌定植相關(guān)的黏附素以及在細菌黏附和侵入過程中起重要作用的莢膜等，均與疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13]。因此，深入了解溶血性曼氏桿菌中的毒力因子，有助于闡明溶血性曼氏桿菌的致病機制，并為其疫苗研制和藥物治療提供重要的理論基礎(chǔ)[1]。

3.1 白細胞毒素 白細胞毒素(Leukotoxin，LKT)屬于細菌成孔毒素(Repeats in toxin，RTX)家族的成員，是溶血性曼氏桿菌最為重要的毒力因子[5]。Tatum等[19]通過基因敲除構(gòu)建了溶血性曼氏桿菌LKT基因缺失株。發(fā)現(xiàn)與野生型溶血性曼氏桿菌相比，缺失株的LKT活性降低，甚至不會引起明顯的肺部病變[19]，說明LKT對于溶血性曼氏桿菌的致病性至關(guān)重要。

LKT作為RTX家族的成員，由4個基因簇lktC、lktA、lktB和lktD編碼組成[19]。其中，lktA作為結(jié)構(gòu)基因主要編碼LKT原蛋白(LktA)；基因lktC編碼轉(zhuǎn)酰酶，翻譯后通過脂肪酸?；揎棽换钴S的LKT原蛋白，從而將其轉(zhuǎn)化為具有生物活性的LKT(LktA)。在酰化過程中，脂肪酸基團被添加到位于lktA上的賴氨酸殘基上，這是LktA去電荷、增加親水性的關(guān)鍵步驟，使LktA能夠插入宿主細胞，形成跨膜孔。最終由lktB和lktD基因產(chǎn)物將其由細菌胞漿運輸?shù)酵猸h(huán)境中[20]。

Davies等[21]對31株綿羊和牛的溶血性曼氏桿菌的lktA基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)了8種lktA主要的等位基因亞型：lktA1～lktA3和lktA6～lktA10亞型。通過對比不同血清型的溶血性曼氏桿菌的lktA基因亞型，發(fā)現(xiàn)不同血清型之間lktA基因亞型不同。如：lktA2亞型僅出現(xiàn)在A2血清型之中；lktA6、lktA7和lktA9亞型分別只出現(xiàn)在A13、A16和A14血清型之中。同時發(fā)現(xiàn)，lktA基因亞型和宿主特異性相關(guān)，如：lktA1.1亞型僅出現(xiàn)在牛源溶血性曼氏桿菌分離株中，而lktA1.2和lktA1.3基因亞型主要存在于綿羊源溶血性曼氏桿菌中。此外，Davies等[22]研究發(fā)現(xiàn)，牛源溶血性曼氏桿菌分離株的lktA1.1亞型與綿羊源lktA1.2亞型和lktA1.3亞型對相同細胞類型(即對牛或綿羊中性粒細胞)的細胞毒性存在明顯差異。

雖然LKT可以結(jié)合宿主的多種細胞,但細胞溶解需要與特定靶細胞上的特定受體發(fā)生特異性結(jié)合[20]。宿主特異性源于LKT與宿主細胞上面的β2整合素LFa-1(淋巴細胞功能相關(guān)抗原1)的相互作用[2]。目前發(fā)現(xiàn)LKT作用受體主要為β2整合素的LFa-1(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)以及CR4(CD11c/CD18)3種[23-24]。

同時，LKT作為高度不穩(wěn)定的細胞外分泌蛋白，常常在作用于反芻動物白細胞時表現(xiàn)出劑量依賴性[4]。在低濃度時，LKT通過與β2整合素受體的相互作用可以激活白細胞，引起白細胞呼吸暴發(fā)和脫顆粒，活化的中性粒細胞和肺泡巨噬細胞釋放促炎細胞因子，肥大細胞釋放組胺，導(dǎo)致炎癥細胞在肺部積聚；在高濃度時，LKT通過外源性和內(nèi)源性機制誘導(dǎo)宿主白細胞凋亡，使細菌通過破壞固有免疫反應(yīng)(巨噬細胞和中性粒細胞)和增強炎癥過程來逃避宿主免疫監(jiān)視；在最高濃度時，LKT誘導(dǎo)白細胞跨膜孔的形成，引起靶細胞壞死，最終導(dǎo)致肺部損傷[15]。因此，上述LKT對反芻動物白細胞的損傷作用可能使溶血性曼氏桿菌逃避宿主的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，削弱肺的主要免疫防御機制，并進一步引起肺部炎癥和組織損傷[14]。

3.2 脂多糖 脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是溶血性曼氏桿菌另一重要的毒力因子[2]。作為革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，LPS的脂質(zhì)A具有內(nèi)毒素活性。LPS可以使細菌逃避宿主的免疫屏障從而在肺部進行增殖，誘導(dǎo)炎性細胞因子應(yīng)答，裂解中性粒細胞和肺泡巨噬細胞，最終加強對肺部的損傷。LPS的毒性可通過與肺表面活性物質(zhì)中的磷脂結(jié)合而增強，從而使LPS在肺中持續(xù)存在并引發(fā)炎癥。此外，LPS引起的全身效應(yīng)包括發(fā)熱和肝臟產(chǎn)生急性期蛋白，導(dǎo)致被感染動物出現(xiàn)低血壓和敗血癥的臨床癥狀[2]。

LPS對白細胞的作用也呈劑量依賴性。低濃度時，LPS降低了中性粒細胞的吞噬能力；而高濃度時，LPS則增強中性粒細胞的吞噬能力[2]。

LPS的病理效應(yīng)是通過與LPS結(jié)合蛋白的結(jié)合完成的，進一步的相互作用很可能是通過CD14介導(dǎo)的[2]。當(dāng)LPS被釋放進入血液循環(huán)，就會被一種稱為LPS結(jié)合蛋白(LBP)的血清蛋白所識別，并形成LBP-LPS復(fù)合物。LBP不僅可以識別LPS，還能將LPS轉(zhuǎn)移到單核細胞或者是巨噬細胞的細胞表面受體CD14(mCD14)上，通過形成LPS-CD14復(fù)合物從而激活細胞。LPS-CD14復(fù)合物能夠通過與另一膜蛋白Toll樣受體4(TLR4)相互作用來啟動細胞內(nèi)信號。TLR4是一種跨膜蛋白，它可以識別特殊的配體LPS。信號通路又能誘導(dǎo)促炎細胞因子的釋放，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、NO和活性氧(ROS)[25]，這些炎性因子的過度表達會導(dǎo)致肺部的損傷，并最終導(dǎo)致嚴重的肺炎[26]。然而，LPS也可以在沒有LBP的情況下激活單核吞噬細胞，從而猜測：CD14依賴通路可能不是LPS與巨噬細胞和單核細胞相互作用的唯一途徑[2]。

綜上所述，LPS通過多種復(fù)雜的機制導(dǎo)致肺部病變。此外，溶血性曼氏桿菌的LPS能夠增強LKT對靶細胞的毒害作用。體外研究顯示，與分別受到LKT和LPS攻擊的細胞相比，同時受到LKT和LPS攻擊的牛肺泡巨噬細胞能夠產(chǎn)生更多的腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素8(IL-8)[2]。

3.3 外膜蛋白 溶血性曼氏桿菌具有多種外膜蛋白。研究表明，在溶血性曼氏桿菌中，其外膜蛋白和脂蛋白在一定程度上具有宿主和血清型特異性，并且是重要的保護性抗原，針對這些抗原的抗體能夠誘導(dǎo)吞噬作用和補體介導(dǎo)的殺傷作用[27]，因此作為潛在的疫苗候選物一直被研究。此外，Iovane等[28]證明,外膜蛋白對中性粒細胞具有趨化作用，并能夠抑制其吞噬作用和細菌殺傷作用，因此有利于溶血性曼氏桿菌在肺部的定植。

在所有外膜蛋白中最主要的是外膜蛋白OmpA，其是高度保守的蛋白，該蛋白有助于細菌結(jié)合到宿主上呼吸道細胞的特異性受體上，在溶血性曼氏桿菌黏附、定植[2]和選擇特異性宿主細胞中發(fā)揮重要作用[5]。Kisiela等[29]在研究溶血性曼氏桿菌對牛上皮細胞的黏附研究中發(fā)現(xiàn)，溶血性曼氏桿菌的外膜蛋白A(OmpA)和脂蛋白1(Lpp1，也稱為PlpA)有助于溶血性曼氏桿菌對牛支氣管上皮細胞的黏附。此外，在外膜蛋白中，還有一類脂蛋白同樣重要。研究發(fā)現(xiàn)，在溶血性曼氏桿菌所有血清型中均發(fā)現(xiàn)了一種外膜脂蛋白為PlpE，在接種疫苗后PlpE能夠提供免疫性保護[30]。并且，針對A1血清型的PlpE的抗體能夠提供針對A6血清型的交叉保護，并促進吞噬作用和補體介導(dǎo)的細菌殺滅作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，外膜脂蛋白PlpE也具有良好的免疫原性[30]。

除了上述外膜蛋白和脂蛋白，溶血性曼氏桿菌還產(chǎn)生一類外膜蛋白以獲取鐵，被稱為鐵調(diào)節(jié)的外膜蛋白(IROMPs)。IROMPs對鐵具有高度親和力，能直接從轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白中攝取鐵，同時能抑制中性粒細胞的吞噬作用，從而保證溶血性曼氏桿菌在體內(nèi)的生長繁殖。研究發(fā)現(xiàn)，IROMPs能夠被恢復(fù)期的牛(綿羊)的血清所識別，表明它們能夠作為保護性抗原在體內(nèi)表達[11]。目前，至少有3種溶血性曼氏桿菌A1血清型IROMP已經(jīng)被鑒定，大小分別為71、77 kDa和100 kDa[30]。

3.4 莢膜多糖 根據(jù)莢膜多糖表面抗原的不同，溶血性曼氏桿菌分為12個血清型(A1、A2、A5～A9、A12～A14、A16和A17)[7]。莢膜多糖在許多革蘭陰性菌的致病過程中起作用，這些作用包括黏附、抵抗宿主免疫防御和掩蔽細菌逃脫免疫反應(yīng)[2]。溶血性曼氏桿菌的莢膜多糖同樣參與了溶血性曼氏桿菌的致病過程，已有研究表明，溶血性曼氏桿菌的莢膜可能與肺表面活性物質(zhì)相互作用，從而促進機體與不同的宿主細胞的局部黏附。

3.5 菌毛和黏附素 黏附是呼吸道病原體感染并定殖于宿主的首要條件，溶血性曼氏桿菌對宿主呼吸道上皮細胞的黏附主要是由菌毛和黏附素介導(dǎo)的。

目前，通過免疫印跡等方法已經(jīng)鑒定出多種黏附素及其在宿主內(nèi)的靶細胞，其中包括上面述及的多種外膜蛋白，如：外膜蛋白A(OmpA)和脂蛋白1(Lpp1，也稱為PlpA)在溶血性曼氏桿菌對牛上皮細胞的黏附過程中發(fā)揮重要作用。此外，還發(fā)現(xiàn)外膜蛋白A(OmpA)可能有助于溶血性曼氏桿菌在羊的呼吸道定植。Mora等[31]還發(fā)現(xiàn)了1個68 kDa分子，可以作為黏附素與培養(yǎng)的氣管上皮細胞結(jié)合。

另外，溶血性曼氏桿菌的菌毛上可能存在黏附素分子，并通過結(jié)合呼吸道上皮細胞的唾液酸糖蛋白受體來介導(dǎo)黏附作用[32]。

3.6 神經(jīng)氨酸酶 在其他細菌性呼吸道病原體中，神經(jīng)氨酸酶可以使唾液糖蛋白脫水，從而使病原體逃避口咽中的防御系統(tǒng)。神經(jīng)氨酸酶在溶血性曼氏桿菌的定植中也發(fā)揮作用，神經(jīng)氨酸酶可以通過暴露潛在的細胞受體來增強生物膜的形成，并通過裂解唾液糖蛋白來逃避宿主局部的先天性免疫[2]。此外，神經(jīng)氨酸酶能夠降低呼吸道黏液的黏度，增強溶血性曼氏桿菌的黏附性，使溶血性曼氏桿菌更緊密地附著在細胞表面。

3.7 糖蛋白酶 溶血性曼氏桿菌具有多種糖蛋白酶[2]。雖然它們的生物學(xué)特征和致病過程中所發(fā)揮的作用尚不完全清楚，但已經(jīng)證明它們有利于細菌定植及肺部感染的形成。研究表明，從培養(yǎng)的溶血性曼氏桿菌的上清液中獲得的糖蛋白酶可以選擇性地水解IgG1，從而抑制調(diào)理素誘導(dǎo)的吞噬作用和細菌殺滅作用。Shewen等[33]研究證明，用重組糖蛋白酶對小牛進行疫苗接種后，可產(chǎn)生顯著的血清抗體應(yīng)答，且能保護小牛免受溶血性曼氏桿菌血清A1型的試驗感染。

此外，溶血性曼氏桿菌所有血清型都可以產(chǎn)生一種糖蛋白酶—鋅金屬蛋白酶(Zinc metalloproteinase)[34]。Nyarko等[35]研究發(fā)現(xiàn)，鋅金屬蛋白酶能夠作用于宿主上皮細胞表面增強其黏附力。此外，其還能引起肺泡中血小板的聚集。在體外可通過與LKT共孵育而增強糖蛋白酶活性[36]。

4 展望

溶血性曼氏桿菌作為一種嚴重威脅牛、羊養(yǎng)殖的重要呼吸道病原[2]，全面掌握其分子生物學(xué)特征以及感染與免疫的機制等是開發(fā)安全、有效的疫苗和采取綜合防治措施的前提[4]。因此，近年來國內(nèi)外學(xué)者針對溶血性曼氏桿菌的功能蛋白和毒力因子展開了大量的研究[5]。

毒力因子是決定細菌致病性的關(guān)鍵[13]。如本文所述，目前對溶血性曼氏桿菌的重要毒力因子已進行了鑒定，對其分子結(jié)構(gòu)以及在溶血性曼氏桿菌感染和致病過程中所發(fā)揮的作用也進行了大量的研究[16]。相關(guān)研究結(jié)果也有效促進了新型疫苗的研制工作，例如基于重組LKT[26]、PlpE的亞單位疫苗，以及LKT等功能蛋白增強的滅活疫苗等[13,27]，均表現(xiàn)出良好的免疫保護效果。

盡管如此，對溶血性曼氏桿菌毒力因子及其致病機制的了解尚不全面。此外，溶血性曼氏桿菌對牛表現(xiàn)出一定的宿主特異性，但決定這種特異性的分子尚不清楚，這對于溶血性曼氏桿菌的綜合防控不利，仍需進一步研究。