楊鎮(zhèn)偉， 林琪， 吳振， 劉智陽， 王立強

(1. 華僑大學 生物醫(yī)學學院， 福建 泉州 362021；2. 廈門大學 藥學院， 福建 廈門 361102；3. 中銘生物(深圳)集團有限公司， 廣東 深圳 518101)

米諾膦酸(minodronic acid)是一種雙膦酸鹽化合物，為日本小野藥品株式會社和日本Astellas制藥株式會社共同研究開發(fā)，可用于治療原發(fā)性和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[1].作為第三代雙磷酸鹽類抗骨吸收劑，米諾膦酸能夠抑制破骨細胞法尼焦磷酸合成酶(FPP)的活性，降低骨轉(zhuǎn)換，進而防治骨質(zhì)疏松[2-4].據(jù)文獻報道，其抑制骨吸收的體外活性約為依地膦酸鹽的10 000倍，阿侖膦酸鹽的10～100倍[5].在諸多藥物的合成過程中需使用有機溶劑，這些有機溶劑對人體存在不同程度的毒性，當原料藥及制劑中殘留有機溶劑超過安全水平，則會對人體造成損害.因此，為了提高藥物的安全性，對原料藥及制劑中殘留溶劑的檢測至關重要.

目前，國內(nèi)已有對米諾膦酸含量測定及有關物質(zhì)測定的報道[6-8]，米諾膦酸也有多種合成路線[9-10].然而，有關米諾膦酸中殘留溶劑檢測的報道僅有吳素平等[11]，即對四氫呋喃、乙酸乙酯、甲醇、乙腈和甲苯等5種殘留溶劑進行檢測，其檢測限分別為0.16，0.10，1.19，0.22，0.02 μg·mL-1.甲醇、二氯甲烷和甲苯屬于第二類有機溶劑，乙醇屬第三類有機溶劑，目前尚無長期毒性試驗結果.關于藥物中乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯等殘留溶劑檢測的報道有許多，如張巍等[12]對依帕司他中有機殘留溶劑的檢測，裴麗娟等[13]對布南色林原料藥中9種有機殘留溶劑的檢測等.但這些對乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等殘留溶劑的檢測限均較高.本文采用袁淑杰米諾膦酸合成新工藝制備米諾膦酸原料藥[14]，并對合成過程中使用的乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等4種有機殘留溶劑進行定量分析.

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

毛細管氣相色譜儀(氫火焰離子檢測器，浙江福立分析儀器股份有限公司)；電子天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；超聲波清洗儀(河南省鞏義市予華儀器有限責任公司)

1.2 實驗材料

乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯均為色譜級，水為超純水，其余試劑均為市售分析純.

1.2 實驗方法

1.1.1 色譜條件 采用安捷倫DB-624(0.32 mm×30 m， 3 μm)色譜柱；固定液為6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷；初始溫度為40 ℃，保持3 min，以15 ℃·min-1持續(xù)升溫至200 ℃，并保持10 min；檢測器溫度為200 ℃，進樣口溫度為250 ℃，載氣為N2，柱流量為1.5 mL·min-1；采用直接進樣法測定.

1.1.2 溶液的配制 1) 供試品溶液的配制.分別精密稱取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，置于100 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺分別稀釋制備成濃度為0.500，0.300，0.060和0.089 mg·mL-1的溶液，作為峰定位試驗的供試品溶液.2) 線性母液的配制.分別精密稱取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，用N，N-二甲基甲酰胺分別稀釋制備成濃度為50.0，30.0，6.0和8.9 mg·mL-1的溶液，作為線性母液.3) 混合溶液的配制.分別精密稱取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋制備成濃度分別為50.0，30.0，6.0和8.9 mg·mL-1的混合溶液.4) 對照品母液的配制.分別精密稱取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，用N，N-二甲基甲酰胺分別稀釋制備成濃度為5.00，3.00，0.60和0.89 mg·mL-1的溶液，作為對照品母液.

2 實驗結果與分析

2.1 系統(tǒng)適應性考察

分別精密量取1 μL供試品溶液及N，N-二甲基甲酰胺，注入毛細管氣相色譜儀，其毛細管氣相色譜(GC)圖如圖1(a)～(e)所示.圖1(a)～(e)中：A為峰面積；t為洗脫時間，下同略.由圖1(a)～(e)可知：乙醇的保留時間為5.116 min，甲醇的保留時間為4.359 min，二氯甲烷的保留時間為6.130 min，甲苯的保留時間為11.138 min，N，N-二甲基甲酰胺的保留時間為12.405 min.

精密量取1 mL混合溶液于容量瓶，用N，N-二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，取1 μL注入毛細管氣相色譜儀，其毛細管氣相色譜(GC)圖如圖1(f)所示.由圖1(f)可知：本品各主峰之間的分離度均符合規(guī)定.因此，上述毛細管氣相色譜條件，可用于本品的溶劑殘留檢查.

(a) 空白溶劑 (b) 乙醇

(c) 甲醇 (d) 二氯甲烷

(e) 甲苯 (f) 混合溶液圖1 不同溶液的毛細管氣相色譜圖Fig.1 Capillary gas chromatograms of different solutions

2.2 線性關系和檢出限的考察

分別精密量取0.2，0.5，1.0，2.0和4.0 mL的中線性母液，放置于100 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋定容，并振蕩搖勻，作為線性溶液.然后，分別精密量取1 μL線性溶液，進樣，記錄色譜圖及峰面積.以各個峰面積(A)作為縱坐標，以線性溶液的濃度(c)作為橫坐標，進行線性回歸，計算線性回歸方程及相關系數(shù)(R2).4種溶劑分別用N，N-二甲基甲酰胺稀釋直至峰高與基線噪音的比值約為3時，記錄樣品濃度即檢測限，結果見表1所示.

表1 不同溶劑的線性關系及其檢出限Tab.1 Linear relationship of different solvents and their detection limits

2.3 精密度試驗

分別精密量取1 mL混合溶液，放置于100 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋定容，并振蕩搖勻.精密量取上述溶液1 μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算峰面積的相對標準偏差(RSD)，結果如表2所示.表2中:DRS為相對標準偏差.從表2可知：精密度試驗結果良好.

表2 精密度試驗結果Tab.2 Results of precision test

2.4 回收率試驗

1) 本底值測定供試品溶液的制備.精密稱取米諾膦酸約1.0 g，溶解并放置于10 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋定容，振蕩搖勻，即得.2) 回收率供試品溶液的制備.分別精密稱取米諾膦酸6份，溶解并放置于10 mL量瓶中，加入1 mL的對照品母液，用N，N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋定容，振蕩搖勻，即得.3) 對照品溶液的制備.精密量取對照品母液1 mL，放置于10 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋定容，振蕩搖勻，即得.

分別精密量取對照品溶液、本底值測定供試品溶液和回收率供試品溶液各1 μL，進樣，記錄色譜圖及峰面積，按照外標法計算測得量.計算樣品的回收率，結果如表3所示.表3中：m1為加入量；m2為測定量；η為回收率；DRS為相對標準偏差.從表3可知：本品的回收率試驗結果良好.

表3 回收率試驗結果Tab.3 Recovery test results

2.5 小試3批樣品的殘留溶劑測定

根據(jù)人用藥物注冊技術要求，以及國際協(xié)調(diào)會(ICH)[15]和《中華人民共和國藥典： 四部(2020年版)》[16]中甲醇的限量不超過0.3%，乙醇的限量不超過0.5%，二氯甲烷的限量不超過0.06%，甲苯的限量不超過0.089%.按照色譜條件對本品3批小試樣品進行溶劑殘留測定，如表4所示.從表4可知：3批小試樣品中均未檢出4種殘留溶劑，表明小試3批樣品的上述溶劑殘留均符合規(guī)定.

表4 小試3批樣品殘留溶劑測定結果Tab.4 Determination results of residual solvent in 3 batches of small test samples

2.6 溶劑選擇

為了精確檢測米諾膦酸原料藥中殘留溶劑的含量，需選擇一種合適的溶劑，既能完全溶解米諾膦酸又可完全溶解有機溶劑.因此，對二甲基亞砜、水、氫氧化鈉溶液、N，N-二甲基甲酰胺等溶劑進行考察，結果顯示米諾膦酸在二甲基亞砜中幾乎不溶，在水中微溶，在氫氧化鈉溶液中易溶，在N，N-二甲基甲酰胺中溶解.然而，由于堿性溶液直接進樣會污染內(nèi)襯管，容易損壞色譜柱，且米諾膦酸在N，N-二甲基甲酰胺溶液中回收率能達到95%以上.因此，文中選擇N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑進行實驗.

2.7 進樣方式選擇

根據(jù)《中華人民共和國藥典： 四部(2020年版)》[16]中殘留溶劑測試方法，選擇直接進樣法.溶液直接進樣法無需前處理過程，簡單快速、精密度高，且重復性好.實驗過程中測定4種有機溶劑的檢測限，乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯的檢測限分別為0.029，0.052，0.051，0.051 ng.結果表明，該方法檢測限低，靈敏度高，因此可選擇溶液直接進樣法進行實驗.

2.8 色譜柱選擇

(a) DB-1701色譜柱

(b) DB-1301色譜柱 (c) DB-624色譜柱圖2 不同毛細管色譜柱的GC圖譜Fig.2 GC spectra of different capillary columns

DB-1701毛細管色譜柱是一款(14% 氰丙基-苯基)-甲基聚硅氧烷色譜柱，DB-1301 毛細管色譜柱與DB-1701毛細管色譜柱類似，是一款(6% 氰丙基-苯基)-甲基聚硅氧烷色譜柱，二者均具有較低至中等極性；DB-624毛細管色譜柱則是一款高惰性色譜柱，該色譜柱可用于快速 GC/MS分析，專門為了分析揮發(fā)性物質(zhì)和殘留溶劑而設計的，對活性化合物具備優(yōu)良的惰性.3種色譜柱均經(jīng)過鍵合交聯(lián)，均可使用溶劑沖洗.

采用進樣混合溶液，分別考察安捷倫DB-624，DB-1701，DB-1301等3種毛細管色譜柱的分離效果，結果如圖2所示.由圖2可知：采用安捷倫DB-1701色譜柱得到的色譜圖峰型差、靈敏度低；采用DB-1301色譜柱得到的色譜圖峰型較好，但靈敏度同樣較低；采用安捷倫DB-624色譜柱分離得到的峰型較好，且靈敏度高、出峰時間短、分離度好.因此，選用安捷倫DB-624色譜柱作為實驗色譜柱.

3 結束語

實驗建立了米諾膦酸中乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等4種殘留溶劑的含量測定方法.該方法精密度好、準確度高，可為米諾膦酸原料藥及米諾膦酸片劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù).通過對3批米諾膦酸原料藥的小試樣品進行殘留溶劑的檢測，結果表明，3批米諾膦酸原料藥中均未檢出乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等4種殘留溶劑，符合《中華人民共和國藥典： 四部(2020年版)》[16]的原料藥質(zhì)量要求.接下來的研究將會測試采集到的車間生產(chǎn)樣品，進一步考察該方法的實際可行性和適用性.