張振良，郭延華，劉長(zhǎng)彬，盧守亮，萬鵬程，劉昱成，倪建宏

（省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000）

超數(shù)排卵（簡(jiǎn)稱超排）是通過高劑量的促性腺激素刺激供體的卵巢一次排出多枚卵子，并使其受精；胚胎移植是將供體受精后的多個(gè)胚胎取出，移植到生理周期相同的受體子宮內(nèi)，并使其發(fā)育成個(gè)體。超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)是快速擴(kuò)繁家畜的有效技術(shù)手段，在綿羊快速繁育中起到重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年9—10月在新疆英吉沙縣領(lǐng)頭羊有限公司的基地進(jìn)行。

1.2 供體母羊的選擇

分別選擇健康、膘情適中、體型相同、繁殖機(jī)能正常的三個(gè)品種經(jīng)產(chǎn)羊：薩?？搜?7只，其中首次超排的11只，重復(fù)超排的36只；白杜泊羊16只（首次超排）；黑杜泊7只（首次超排）。試驗(yàn)開始前一周，在正常管理的前提下給參試羊增加一些能量飼料和干苜蓿草。

1.3 試驗(yàn)材料

藥品：孕酮陰道栓（CIDR，澳大利亞生產(chǎn)）；促卵泡素（FSH，500單位·瓶-1，寧波第二激素廠）；前列腺素（PG，0.2mg·支-1，上海計(jì)勝生物科技有限公司）；注射用促黃體素釋放激素（A3，25μg·支-1，寧波三生生物科技有限公司）；沖胚液（PBS，1000mL·袋-1，新西蘭生產(chǎn)）；胚胎保存液（Holding，100mL·袋-1，新西蘭生產(chǎn)）；生理鹽水；新潔爾滅；5%碘酒；75%酒精；靜松靈；青霉素。

器械：放栓槍；5mL注射器；10mL注射器；羊用保定架；手術(shù)刀；剪毛剪；體視顯微鏡；沖胚管；10cm培養(yǎng)皿；四孔培養(yǎng)皿；縫合針；縫合線；紗布；創(chuàng)凈布。

1.4 供體超排處理方法

任意一天在供體母羊陰道內(nèi)放置CIDR，其后第10d下午開始按照6針劑量依次遞減的方法注射FSH，第13d早上注射最后一針FSH；第12d下午取出供體羊陰道內(nèi)的CIDR，同時(shí)注射1mL PG，第13天早上再注射1mL PG，撤栓后24h試情，發(fā)情羊進(jìn)行第一次配種，并注射12.5μg A3。間隔10—12h后進(jìn)行第2次配種，重復(fù)2～3次。

1.5 胚胎的收集

供體母羊發(fā)情配種后的第7d開始手術(shù)沖胚，供體母羊術(shù)前空腹24h。首先將母羊放在保定架上保定好，刮去腹部手術(shù)部位腹毛，并用5%碘酒消毒，75%酒精脫碘，肌肉注射0.2mg靜松靈；待供體羊進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，用手術(shù)刀在其乳房前側(cè)順著頭的方向逐層切開皮膚、脂肪層、肌肉層和腹膜，切口長(zhǎng)度5～6cm，注意避開血管；取出子宮和卵巢，觀察卵巢的排卵情況，并記錄左右兩側(cè)卵巢上的黃體數(shù)；對(duì)重復(fù)超排供體羊的卵巢和子宮粘連情況進(jìn)行觀察并記錄；然后用器械在子宮體扎一小洞，放入沖胚管；用子宮鉗夾住一側(cè)子宮體，在子宮角處插入接胚管，管外端接培養(yǎng)皿；用注射器通過沖胚管將沖胚液注入子宮進(jìn)行沖胚，過程中保證沖胚液均勻緩慢的流過子宮，用接胚管外端的培養(yǎng)皿接沖胚液完成沖胚；沖胚完成后在顯微鏡下觀察培養(yǎng)皿，找到收集到的胚胎，并按照形態(tài)特征將其分為A、B、C三個(gè)等級(jí)和未受精的卵子。

1.6 供體羊的術(shù)后處理

供體羊沖胚結(jié)束后，用37℃生理鹽水沖洗其子宮體、卵巢和輸卵管上的血跡，并用紗布擦拭干凈，將再次噴灑生理鹽水后的子宮緩慢放入供體羊腹腔內(nèi)，并向腹腔內(nèi)灌注300～500mL的37℃生理鹽水。術(shù)后縫合時(shí)，先用可吸收縫合線縫合腹膜和肌肉層，縫合中應(yīng)注意不要將內(nèi)臟與肌肉縫合在一起；縫合好肌肉層后，再縫合皮膚層，縫合皮膚層時(shí)要將皮膚層與肌肉層一起縫合，同樣注意不要與內(nèi)臟縫合在一起，皮膚層縫合3～4針即可，保證傷口平整對(duì)齊，有利于傷口愈合。用碘酒對(duì)縫合后傷口消毒，給供體羊肌肉注射160萬單位青霉素后，將其從保定架上緩慢放下。術(shù)后48h內(nèi)持續(xù)關(guān)注母羊恢復(fù)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Excel整理后，再用SPSS 21.0進(jìn)行方差分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種羊超排效果

如表1所列可知，白杜泊的平均回收胚胎數(shù)為

表1 不同品種羊超排效果比較Table 1 Comparison of superovulation effects of different breeds of sheep

11.16枚，高于薩福克的7.45枚和黑杜泊的7.29枚；白杜泊的胚胎回收率最高，為85.56%，薩?？藶?7.91%，黑杜泊最低為66.29%；各品種的A級(jí)胚數(shù)，薩?？俗畹停瑸?.00枚、黑杜泊為6.29枚，白杜泊最高，為7.56枚；薩?？撕桶锥挪吹腂級(jí)胚數(shù)相差不大，分別為1.55枚和1.56枚，黑杜泊僅為0.57枚；未受精卵數(shù)分別為0.64、1.94和0.14枚；胚胎移植中，可用胚是指A級(jí)胚和B級(jí)胚，C級(jí)及以下的胚胎為不可用胚，薩?？撕桶锥挪吹目捎门呗瘦^接近，分別是84.55%和83.88%，黑杜泊最高，為92.87%；薩?？恕锥挪春秃诙挪绰殉采系钠骄S體數(shù)分別為10.27、13.13和11.14個(gè)，三個(gè)品種間以上各指標(biāo)雖有差異，但差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 重復(fù)超排對(duì)薩?？搜蚺怕研Ч挠绊?/h3>

如表2所列可知，對(duì)薩?？诉M(jìn)行4次重復(fù)超排后，第二次超排回收胚胎數(shù)高于其他三次，第一、二和三次超排間差異不顯著（P＞0.05），但第一、二次超排顯著高于第四次超排（P＜0.05）。第二次超排獲得A級(jí)胚數(shù)顯著多于第四次超排（P＜0.05），其余各次間差異均不顯著（P＞0.05）；4次超排獲得的B級(jí)胚數(shù)和未受精胚數(shù)間差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 薩福克羊重復(fù)超排效果比較Table 2 Comparison of the effect of repeated superovulation of black-headed Suffolk sheep

3 討論

3.1 不同品種羊超排效果和胚胎質(zhì)量的分析

隨著胚胎移植技術(shù)不斷改進(jìn)和完善，目前該技術(shù)已廣泛運(yùn)用到家畜的品種改良和快速擴(kuò)繁中。胚胎移植技術(shù)中的超排是一個(gè)復(fù)雜的過程，其效果受到品種、激素、個(gè)體營(yíng)養(yǎng)狀況、飼養(yǎng)管理、超排方案、環(huán)境、季節(jié)等諸多因素的影響。趙霞[3]研究德國(guó)美利奴羊和無角陶賽特羊的超排效果，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種間的排卵數(shù)和可用胚數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）；唐大為等[4]對(duì)無角陶塞特、特克塞爾和薩福克進(jìn)行超排對(duì)比，結(jié)果顯示三個(gè)品種間平均黃體數(shù)、平均回收胚胎數(shù)和平均可用胚胎數(shù)差異均不顯著。本研究針對(duì)三個(gè)品種的羊進(jìn)行超排試驗(yàn)，結(jié)果顯示三個(gè)品種間的回收胚胎數(shù)、A級(jí)胚數(shù)、B級(jí)胚數(shù)和未受精胚數(shù)差異均不顯著（P＞0.05），這與前人研究結(jié)果相似。易金云等[5]對(duì)薩福克和杜泊進(jìn)行超排試驗(yàn)，兩個(gè)品種的羊沖胚數(shù)都在10枚以上，且兩者間差異不顯著（P＞0.05），本研究中薩福克和黑杜泊的沖胚數(shù)在7枚左右，但黃體數(shù)大于10枚，可能是沖胚人員經(jīng)驗(yàn)不足，導(dǎo)致胚胎沒有全部沖出。徐鵬舉等[6]對(duì)薩?？搜蜻M(jìn)行超排，其平均回收胚胎數(shù)7.96枚，平均可用胚胎數(shù)6.56枚，與本研究結(jié)果相似。

本研究中，不同品種羊的黃體數(shù)與可用胚數(shù)薩福克為10.27個(gè)和6.55枚，白杜泊為13.13個(gè)和9.13枚，黑杜泊為11.14個(gè)和6.68枚，這與張秀陶等[7]同一時(shí)間不同品種綿羊的超排試驗(yàn)，得到的黃體數(shù)和可用胚數(shù)白頭薩福克羊10.8個(gè)和7.5枚，東弗里生羊10.8個(gè)和3.6枚，陶賽特羊9.2個(gè)和4.3枚及特克塞爾羊8.8個(gè)和3.5枚的試驗(yàn)結(jié)果相似。張璐等[8]對(duì)5個(gè)不同品種的綿羊進(jìn)行超排，結(jié)果顯示羊的平均黃體數(shù)6～16個(gè)不等，平均可用胚數(shù)3～7枚不等，由此可看出不同品種羊的超排效果間存在一定差異，可能是由于不同品種的羊?qū)に氐挠昧看嬖诓煌哪褪苄?。不同的季?jié)對(duì)超排也有很大的影響。茍想珍等[9]在春秋兩季對(duì)薩?？诉M(jìn)行超排試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)秋季羊的平均回收胚胎數(shù)和平均可用胚胎數(shù)顯著高于春季（P＜0.05），本研究在秋季進(jìn)行，其春季超排情況有待進(jìn)一步研究，但綿羊作為季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物，秋季超排效果應(yīng)該相對(duì)較好。

3.2 重復(fù)超排對(duì)排卵效果的影響

重復(fù)超排的目的是充分挖掘良種母畜的遺傳潛力，發(fā)揮其最大價(jià)值，由此給養(yǎng)殖戶和社會(huì)帶來更多經(jīng)濟(jì)效益。本研究中，對(duì)薩?？搜蛑貜?fù)超排4次后，其第一、二次回收胚胎數(shù)顯著高于第四次（P＜0.05），第二次超排獲得的A級(jí)胚數(shù)顯著高于第四次（P＜0.05），這說明對(duì)薩?？搜蜻M(jìn)行四次超排，會(huì)顯著影響獲得的胚胎數(shù)和胚胎質(zhì)量。張果平等[10]對(duì)杜泊羊重復(fù)超排處理，第三次回收的胚胎數(shù)顯著低于第一、二次（P＜0.05），與本研究結(jié)果稍有不同，可能是由于品種不同造成的差別；王峰等[11]對(duì)陶賽特羊重復(fù)超排，第二次超排獲得可用胚數(shù)最多，然后依次減少，整體趨勢(shì)與本研究結(jié)果一致；柴孟龍等[12]對(duì)薩福克羊兩次重復(fù)超排，兩次超排間差異不顯著（P＞0.05），這與本研究中的前兩次超排結(jié)果一致。陳童等[13]對(duì)細(xì)毛羊兩次重復(fù)超排，兩次超排后卵泡發(fā)育數(shù)大幅減少，與初次超排相比差異極顯著（P＜0.01），但可用胚胎數(shù)沒有明顯減少（P＞0.05）。由此可見，重復(fù)超排受品種、激素劑量、體況、生殖器官狀態(tài)和季節(jié)等因素影響。

朱芳賢等[14]認(rèn)為重復(fù)超排應(yīng)在手術(shù)時(shí)防止出血及術(shù)后嚴(yán)格管理來防止子宮粘連。在實(shí)際生產(chǎn)中，手術(shù)減少出血是必要的，同時(shí)還可通過延長(zhǎng)兩次沖胚的間隔時(shí)間或兩次沖胚間讓母羊自然生產(chǎn)一次及在術(shù)后受體腹腔內(nèi)灌注生理鹽水的措施來防止子宮粘連。同時(shí)還需在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)一步驗(yàn)證以獲得更好的方法。

4 結(jié)論

通過對(duì)薩?？恕锥挪春秃诙挪催@三個(gè)品種的羊進(jìn)行超排試驗(yàn)，三者間的回收胚胎數(shù)、A級(jí)胚數(shù)、B級(jí)胚數(shù)、黃體數(shù)和可用胚胎數(shù)差異均不顯著（P＞0.05），說明同一超排方案對(duì)三個(gè)不同品種的羊影響不大；對(duì)薩?？诉M(jìn)行4次重復(fù)超排，隨超排次數(shù)的增加，子宮粘連愈發(fā)嚴(yán)重，特別是輸卵管傘粘連后無法包裹卵巢，卵子無法進(jìn)入輸卵管，導(dǎo)致胚胎回收率低。