童洋萍 黃超平 王 振 唐建生 徐 偉 李芳毅 胡 玨

南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙中心醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004

卒中是全球第二大死亡原因，也是致殘的主要原因，在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率越來越高［1］，給經(jīng)濟(jì)及社會(huì)發(fā)展帶來沉重負(fù)擔(dān)。研究表明，87%的卒中是缺血性卒中［2-3］，缺血性腦卒中發(fā)病過程中伴隨多個(gè)基因表達(dá)的改變，這些基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸起重要作用［4-5］，因而從分子水平揭示缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制成為治療該病的研究重點(diǎn)［6］。而目前臨床尚未有分子標(biāo)志物或基因可以準(zhǔn)確反映腦卒中的發(fā)病機(jī)制或預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后結(jié)局，因此，發(fā)現(xiàn)某一基因或分子標(biāo)志物能夠反映腦卒中的具體進(jìn)展過程，成為亟需解決的課題。研究發(fā)現(xiàn)PADI4 基因與缺血性腦卒中的發(fā)病密切相關(guān)，但尚未檢索到PADI4 在腦卒中作用的報(bào)道。肽基精氨酸脫亞胺酶（peptidyl arginine deiminase，PAD 或PADI）是一類介導(dǎo)修飾翻譯后蛋白質(zhì)瓜氨酸化的鈣依賴性半胱氨酸水解酶家族［7-8］，包含5種同工酶，表達(dá)于特異性組織和作用于不同的靶蛋白，與炎癥性疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病和基因調(diào)控有關(guān)。肽酰精氨酸脫亞胺酶-4（PADI4）是其中的一員，主要表達(dá)于造血組織，如外周血的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞［9-10］，在中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用［11］，參與了感染性疾病、自身免疫性疾病和缺血性疾病等發(fā)病過程［12-14］。多項(xiàng)研究報(bào)道抑制PADI4可以保護(hù)某些器官免受缺血性損傷。DU等［15］研究發(fā)現(xiàn)特異性抑制PADI4 可能是減輕腎缺血-再灌注損傷并發(fā)遠(yuǎn)端肺損傷的有效策略；LANGE 等［8］研究發(fā)現(xiàn)藥理抑制PADI4 能顯著減輕新生兒缺氧缺血性腦損傷。盡管目前有關(guān)PADI4 在缺血性疾病中的研究逐漸增加，但絕大多數(shù)局限在動(dòng)物研究模型，且部分動(dòng)物研究結(jié)果關(guān)于PADI4 在缺血性疾病中的作用存在沖突。DU 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，特異抑制PADI4 可減少急性心肌梗死誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、中性粒細(xì)胞細(xì)胞外陷阱（neutrophil extracellular，NETs）、炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡。而EGHBALZADEH 等［16］研究表明PADI4缺乏加重心肌梗死后急性炎癥，增加組織損傷。因此，本研究從臨床上研究腦梗死患者和非腦梗死患者PADI4 的變化情況，希望從分子水平方面為腦梗死的治療提供可供參考的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020-03—10 南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治住院的40例急性腦梗死患者，男30例，女10例，年齡64（56～69）歲；均符合《2018 中國(guó)急性缺血性卒中診治指南》制定的腦梗死標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡30～80 歲，發(fā)病24 h 內(nèi)入院；（2）TOAST 分型為大動(dòng)脈粥樣硬化型或小血管閉塞型患者；（3）3 個(gè)月后電話隨訪無失聯(lián)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在其他神經(jīng)系統(tǒng)合并疾病，如顱腦外傷或腦腫瘤者；（2）感染或有嚴(yán)重肝、腎功能障礙者；（3）存在惡性腫瘤、風(fēng)濕免疫性疾病、冠心病或周圍血管閉塞性疾病患者。對(duì)照組為40例同期收治住院的與病例組年齡相匹配的非腦梗死患者，同樣按照上述剔除標(biāo)準(zhǔn)篩選，其中男17 例，女23 例，年齡57（50～65）歲。該項(xiàng)檢測(cè)經(jīng)院倫理委員會(huì)認(rèn)可，均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.2.1 臨床資料：記錄病例組及對(duì)照組的臨床基線資料、病例組影像學(xué)檢查（梗死部位、顱內(nèi)外血管情況確定TOAST分型）、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)（血脂、血同型半胱氨酸、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)等）以及病例組NIHSS評(píng)分、90 d mRS評(píng)分（將mRS評(píng)分0～1分定義為預(yù)后良好，mRS評(píng)分≥2分定義為預(yù)后不良）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法：入院當(dāng)天抽取外周靜脈血2 mL，用紅細(xì)胞裂解法提取白細(xì)胞（北京索萊寶科技有限公司），提取白細(xì)胞內(nèi)的總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（北京全式金生物公司），再用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)PADI4 的相對(duì)表達(dá)量（Real-Time PCR System 為美國(guó)ABI 公司）。PADI4 和內(nèi)參GAPDH 的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。具體序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers for Real-Time quantitative PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距描述，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，必要時(shí)使用Fisher 確切概率法；多因素分析采用二元Logistic回歸分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。診斷試驗(yàn)效能的評(píng)價(jià)采用ROC 曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 2 組臨床資料比較病例組與對(duì)照組性別、高血壓、血同型半胱氨酸、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2 組年齡、吸煙史、飲酒史、糖尿病、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 病例組與對(duì)照組基線資料比較Table 2 Comparison of baseline data of case group and control group

2.2 PADI4 相對(duì)表達(dá)量在2 組中的表達(dá)情況及與腦梗死預(yù)后的關(guān)系

2.2.1 PADI4 在2 組的表達(dá)情況：PADI4 在病例組中的相對(duì)表達(dá)量為1.06（0.91～1.21），對(duì)照組為0.86（0.80～0.95）。病例組的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖1。2.2.2 Logistic 回歸分析：采用二元Logistic 回歸分析，分別納入PADI4相對(duì)表達(dá)量、性別、原發(fā)性高血壓、血同型半胱氨酸、糖尿病、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)等相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示病例組PADI4 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（OR=42.33，95% CI：2.293～778.013，P=0.012），同時(shí)血同型半胱氨酸和糖尿病高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2 組性別、原發(fā)性高血壓、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 PADI4在病例組和對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量Figure 1 The relative expression of PADI4 in the stroke group and control group

表3 Logistic回歸分析Table 3 Logistic regression analysis

2.2.3 病例組PADI4 相對(duì)表達(dá)量與預(yù)后的關(guān)系：PADI4 在預(yù)后良好組（mRS 0～1）的相對(duì)表達(dá)量為1.07（0.97～1.25），預(yù)后不良組（mRS≥2）的相對(duì)表達(dá)量為0.99（0.85～1.10），兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.133）。

2.3 PADI4 相對(duì)表達(dá)量的ROC 曲線分析繪制PADI4 相對(duì)表達(dá)量的ROC 曲線，進(jìn)行診斷試驗(yàn)效能的評(píng)價(jià)，AUC為0.759，PADI4用于診斷腦梗死的敏感度為70.0%，特異度為82.5%，P＜0.001。見圖2。

圖2 PADI4相對(duì)表達(dá)量在腦梗死中的診斷價(jià)值Figure 2 Diagnostic value relative expression of PADI4 in cerebral infarction

3 討論

腦梗死是腦卒中的主要類型，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致殘率高、病死率高等特點(diǎn)［17-18］，病理生理機(jī)制復(fù)雜，環(huán)境及遺傳因素均參與其發(fā)病過程［19］。盡管目前缺血性腦卒中的病理生理學(xué)及其導(dǎo)致缺血性損傷的潛在機(jī)制已經(jīng)取得相當(dāng)大的進(jìn)展，但仍存在治療困難等問題。研究報(bào)道PADI4 基因與缺血性腦卒中的發(fā)病密切相關(guān)，但尚未檢索到關(guān)于PADI4在腦卒中的作用報(bào)道。本研究首次對(duì)腦梗死患者血液中的PADI4相對(duì)表達(dá)量展開研究，以評(píng)估其在腦梗死過程中的作用，并嘗試分析其分子機(jī)制，希望為腦梗死的治療提供理論依據(jù)。

研究顯示，PADI4在缺血等各種病理?xiàng)l件下引起的炎癥反應(yīng)和NETs的形成中起關(guān)鍵作用［20-21］。研究顯示，PADI4 是不依賴NADPH的NETs所必需的酶，PADI4能將蛋白質(zhì)、自身抗體和組蛋白H3 和H4 上的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸化，而組蛋白H3和H4的瓜氨酸化與NET的釋放特別相關(guān)，能迅速形成NETs［22］，反映了NETs 的出現(xiàn)情況［23］。有證據(jù)表明NETs 作用于靜脈和動(dòng)脈血栓的形成，在動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成中起決定性作用［24-27］。NETs通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和凋亡以及形成一種纖維蛋白樣的堿基使血小板黏附、激活和聚集等促進(jìn)血栓形成［25］，其提供了炎癥、血栓形成、氧化應(yīng)激和心血管疾病之間先前未知的聯(lián)系。LIU 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，PADI4 基因敲除的小鼠患動(dòng)脈粥樣硬化的概率相對(duì)更低。LING等［29］研究發(fā)現(xiàn)Nets可促進(jìn)冠狀動(dòng)脈微血栓形成，采用PADI4抑制劑可降低心肌梗死和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率。本研究發(fā)現(xiàn)PADI4 在病例組中的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高，由于腦梗死的發(fā)病與高血壓、性別、糖尿病等危險(xiǎn)因素相關(guān)，因此，通過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，PADI4相對(duì)表達(dá)量與腦梗死的發(fā)生獨(dú)立相關(guān)，提示PADI4在腦梗死的發(fā)生過程中可能充當(dāng)危險(xiǎn)因子，推測(cè)通過抑制PADI4的形成或降低PADI4的水平可以抑制NETs的形成而預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的形成或減少輕動(dòng)脈粥樣硬化的程度，起到腦卒中的一級(jí)預(yù)防作用。KANG等［30］在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，缺血腦組織中存在PADI4的上調(diào)，PADI4的過度表達(dá)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞胞外網(wǎng)狀陷阱形成增加，伴隨著新生血管的減少和血-腦脊液屏障損傷的增加。同樣RABADI 等［31］在腎缺血/再灌注損傷動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)PADI4 上調(diào)的情況。本研究發(fā)現(xiàn)PADI4 相對(duì)表達(dá)量在病例組中明顯升高，從側(cè)面驗(yàn)證了臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)具有一定的一致性，PADI4基因的上調(diào)促進(jìn)了腦梗死的發(fā)生。腦梗死后的病理生理機(jī)制包括興奮性氨基酸毒性、鈣超載、神經(jīng)元凋亡、炎癥反應(yīng)等。腦梗死發(fā)生后伴隨細(xì)胞內(nèi)鈣水平增加［32-33］，而PADI4 是一種Ca2+依賴酶，需要提高Ca2+水平來激活［34］，因此推測(cè)腦梗死后可能伴隨PADI4活性的增強(qiáng)，鈣拮抗劑治療可降低PADI4的活性，從而抑制梗死后炎癥反應(yīng)的程度。

SHIMONAGA 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，PADI4 反映NETs 的出現(xiàn)情況，在不穩(wěn)定性頸動(dòng)脈斑塊中有較高的表達(dá)。KIM等［35］動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死后PADI4 在腦實(shí)質(zhì)和血中性粒細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng)，誘導(dǎo)組蛋白中的瓜氨酸酸化并釋放NETs，加重炎癥和腦損傷。VAIBHAV 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷性腦損傷患者中，PADI4 介導(dǎo)的NETs會(huì)加重急性神經(jīng)損傷和腦血管功能障礙，靶向治療可改善患者預(yù)后。因此，推測(cè)PADI4可能通過NETs的形成參與腦梗死的發(fā)展及加重腦損傷，PADI4 抑制劑或抑制NETs的形成可作為臨床上治療腦梗死的一種可選手段。

研究表明炎癥-免疫參與了腦梗死的病理生理過程，腦梗死發(fā)生后血-腦脊液屏障被破壞，炎癥細(xì)胞侵入缺血腦組織，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞因子和黏附分子，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成腦組織損傷；免疫介質(zhì)能促炎癥發(fā)展，促進(jìn)缺血影響區(qū)域內(nèi)眾多炎癥細(xì)胞類型，包括各種亞型T細(xì)胞、單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等的滲透，這個(gè)過程導(dǎo)致大腦進(jìn)一步的缺血性損傷［37］。最新一些關(guān)于腦梗死后的后期分子機(jī)制研究進(jìn)一步闡述了分子信號(hào)通路在腦梗死后發(fā)揮重要作用，如IL-6/STAT3 通路的激活以及VEGF-A/MMP-9信號(hào)的衰減與尿素影響卒中后的神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡相關(guān)［38］；下調(diào)TLR4、p-NF-κB、pro-Caspase-1、Caspase-1 等TLR4/NF-κB/NLRP3 信號(hào)通路相關(guān)蛋白可增加缺血性腦卒中后新生神經(jīng)元數(shù)量和腦微血管密度［39］。雖然隨著炎癥分子及信號(hào)通路等各方面的研究不斷深入，對(duì)理解腦梗死后的分子機(jī)制越來越深刻，但反映臨床病程進(jìn)展的分子標(biāo)志物尚未明確證實(shí)。WU 等［40］通過一項(xiàng)19 873人的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，TNF-α的基因多態(tài)性和循環(huán)水平與缺血性腦卒中有關(guān)，可能作為分子標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)PADI4 在腦梗死患者中高表達(dá)，推測(cè)PADI4可能是研究腦梗死病理機(jī)制的一種新的生物學(xué)標(biāo)志物。

關(guān)于腦梗死的預(yù)后分析顯示，PADI4相對(duì)表達(dá)量在預(yù)后良好組與預(yù)后不良組中無明顯差異。分析產(chǎn)生陰性結(jié)局的原因有樣本量較小、納入分析的腦梗死患者初始發(fā)病神經(jīng)功能缺損癥狀較輕，90 d mRS 差異較小等。以非腦梗死患者為參照繪制ROC 曲線，顯示PADI4 相對(duì)表達(dá)量對(duì)腦梗死有較好的診斷效能，可作為腦梗死發(fā)病機(jī)制的一種新的診斷標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)PADI4 相對(duì)表達(dá)量與腦梗死的發(fā)生獨(dú)立相關(guān)，對(duì)腦梗死的發(fā)病有一定的診斷效能，其可能參與了腦梗死的發(fā)生及發(fā)展。PADI4 可能通過NETs 對(duì)腦梗死造成損傷，可作為研究腦梗死病理機(jī)制的一種新的生物學(xué)標(biāo)志物。