李廷慧，李彬鈺，馬錫惠，何秀云,2*

1解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心皮膚科，北京 100091；2解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心泌尿外科醫(yī)學(xué)部，北京 100039

卡介苗(Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin，BCG)是目前唯一被批準(zhǔn)用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗。但對(duì)于感染結(jié)核桿菌(MTB)、患免疫缺陷癥、先天及后天免疫不全的嬰兒或兒童，臨床上禁止接種BCG。熱滅活BCG(hBCG)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答弱于BCG，但仍具備BCG的生物學(xué)功能，且消除了MTB等分枝桿菌活菌產(chǎn)生的不良反應(yīng)[1]，其抗MTB感染的作用可被佐劑增強(qiáng)[2-3]。BCG的細(xì)胞壁、含CpG基序的核酸(BCG-CpG-DNA)、多糖等均可作用于不同的Toll樣受體(toll-like recepter，TLR)，從而啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答。因此，BCG、hBCG及其組分常作為疫苗佐劑，也可用于肺癌、惡性淋巴瘤根治手術(shù)或化療后的輔助治療[4-8]。

1997年，意大利首次批準(zhǔn)將含角鯊烯的MF59佐劑流感疫苗用于臨床[9]。MF59通過TLR非依賴的MyD88信號(hào)通路啟動(dòng)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，BCG可激活TLR-MyD88信號(hào)通路啟動(dòng)天然免疫，因此，MF59與hBCG可通過共同的MyD88信號(hào)通路產(chǎn)生協(xié)同作用。鑒于商品化的MF59價(jià)格偏貴，但其制備材料較便宜，本課題組前期制備了含角鯊烯的水包油納米乳劑(SE)并開展研究，發(fā)現(xiàn)SE與hBCG具有協(xié)同作用，即SE可增強(qiáng)hBCG的免疫原性[10]，而hBCG可增強(qiáng)SE募集巨噬細(xì)胞到注射部位的能力[11]，將SE與hBCG結(jié)合制備的復(fù)合佐劑SE-hBCG能增強(qiáng)重組MTB蛋白特異的免疫應(yīng)答[12]。目前，關(guān)于SE-hBCG對(duì)病毒抗原的輔佐效果仍不清楚，本研究探討了SE-hBCG對(duì)天然及重組病毒蛋白免疫原性的影響，以進(jìn)一步闡明SE-hBCG潛在的廣譜佐劑特性。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠145只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，體重18～20 g。凍干人用狂犬病疫苗(Rab，遼寧成大生物股份有限公司)；小鼠干擾素-γ(IFN-γ)及白細(xì)胞介素(IL)-4酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試劑盒(瑞典Mabtech公司)；角鯊烯、Tween 20、刀豆蛋白A(CoA)及Span85(美國Sigma公司)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗(美國Jackson ImmunoResearch Labtoratories公司)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液、0.5 mg/ml重組巨細(xì)胞病毒糖蛋白B(CgB原液)及廣譜型酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(ELISPOT)專用無血清培養(yǎng)基(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；即用型TMB顯色液(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 SE、hBCG及Rab原液制備 SE及hBCG原液制備參照文獻(xiàn)[12]，1人份凍干Rab疫苗按說明書加入0.5 ml注射用水溶解，多人份溶解的Rab疫苗合并混勻即為Rab原液。

1.2.2 免疫原制備 實(shí)驗(yàn)1免疫原制備：SE原液與等體積PBS混勻?yàn)镾E，SE原液與等體積500 μg/ml的hBCG混勻?yàn)閺?fù)合佐劑SE-hBCG；CgB原液用PBS稀釋至25 μg/ml為CgB，CgB原液用PBS稀釋至50 μg/ml后再與等體積SE混勻?yàn)镾E+CgB；PBS稀釋hBCG原液及CgB原液至終濃度分別為500 μg/ml與50 μg/ml的混合液，再與等體積SE混勻?yàn)镾E-hBCG+CgB。實(shí)驗(yàn)2免疫原制備：0.01 ml Rab原液補(bǔ)加PBS至0.2 ml混勻?yàn)?/50人用劑量Rab(簡稱Rab)，0.01 ml Rab原液補(bǔ)加PBS至0.1 ml，再與0.1 ml SE混勻?yàn)镾E+Rab；0.1 ml Rab和hBCG的混合液(含0.01 ml Rab原液、終濃度為500 μg/ml的hBCG)與0.1 ml SE混勻?yàn)镾E-hBCG+Rab。

1.2.3 小鼠分組及處理 實(shí)驗(yàn)1：取25只小鼠，分成5組：SE組、SE-hBCG組、CgB組、SE+CgB組、SE-hBCG+CgB組，每組5只；每只小鼠分別肌內(nèi)注射SE、SE-hBCG、CgB、SE+CgB、SE-hBCG+CgB各0.2 ml，共免疫3次，每次免疫間隔2周；末次免疫后2周解剖小鼠。實(shí)驗(yàn)2：取120只小鼠，分成4組：PBS組、Rab組、SE+Rab組、SE-hBCG+Rab組，每組30只；每只小鼠分別腹腔注射PBS、Rab、SE+Rab、SE-hBCG+Rab各0.2 ml(各組Rab劑量均為1/50人用劑量)，共免疫2次，每次免疫間隔1周；第1次免疫(初免)后4、8、10、12、14及35 d，各解剖5只小鼠。同時(shí)摘取小鼠眼球取血，離心收集血清用于抗體檢測(cè)；無菌摘取脾臟制備脾淋巴細(xì)胞懸液(除初免后第10天及第12天解剖小鼠外)，用于ELISPOT檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過程符合國家及單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的相關(guān)規(guī)定。

1.2.4 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠血清抗體滴度 用包被液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6)稀釋CgB至5 μg/ml或1:300稀釋Rab原液，每孔包被100 μl，4 ℃過夜；棄包被液，控干，每孔加入200 μl含0.05% Tween 20的PBS(PBST)洗板5 min，洗3次后控干。每孔加入200 μl含1%牛血清白蛋白的PBST(PBSTB)，于37 ℃作用2 h。棄封閉液，控干，同上洗板并控干；每孔加入100 μl PBSTB稀釋的血清(SE或PBS免疫小鼠血清1:100稀釋，其血清按預(yù)實(shí)驗(yàn)確定稀釋度，不少于3個(gè))，于37 ℃孵育2 h。棄血清，控干，同上洗板并控干；每孔加入100 μl PBSTB稀釋的HRP標(biāo)記的二抗(1:20 000)，于37 ℃孵育1 h。棄二抗稀釋液，控干，同上洗板；每孔加入TMB顯色液100 μl，室溫避光放置30 min，加入50 μl濃度為2 mol/L的H2SO4終止顯色，于450 nm波長處測(cè)量光密度值(OD450)。以PBS(實(shí)驗(yàn)2)或SE(實(shí)驗(yàn)1)免疫小鼠血清1:100稀釋檢測(cè)OD450的x±2s作為臨界值，其他免疫原免疫小鼠檢測(cè)OD450大于臨界值的最大稀釋度的倒數(shù)作為抗體滴度。

1.2.5 ELISPOT法檢測(cè)脾細(xì)胞分泌抗原特異的IFN-γ或IL-4的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù) 按小鼠淋巴細(xì)胞分離液說明書制備脾淋巴細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，用ELISPOT專用無血清培養(yǎng)基將脾淋巴細(xì)胞密度調(diào)整至2.5×106個(gè)/ml。取出預(yù)包被抗IFN-γ或IL-4單克隆抗體的96孔板，每孔加200 μl PBS(0.22 μm膜過濾且滅菌)，洗板5次，控干，每孔加入200 μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，室溫孵育30 min。棄去培養(yǎng)基，控干；將調(diào)整好的小鼠淋巴細(xì)胞懸液加入3孔中，100 μl/孔，然后分別加50 μl無血清培養(yǎng)基(陰性孔)、50 μl無血清培養(yǎng)基稀釋的15 μg/ml CgB或Rab(原液按1:50稀釋抗原孔)、50 μl無血清培養(yǎng)基稀釋的15 μg/ml CoA(陽性孔)。將96孔板于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～40 h。取出微孔板，棄液體，每孔加200 μl PBS(0.22 μm膜過濾)洗板5次，控干，每孔加入100 μl檢測(cè)抗體，室溫孵育2 h。棄去孔內(nèi)溶液，同上洗板5次，控干，每孔加入100 μl鏈霉親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物，室溫孵育1 h。棄去孔內(nèi)溶液，同上洗板5次，控干，加入100 μl 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)底物溶液(0.45 μm膜過濾)，室溫避光放置10～30 min，待出現(xiàn)斑點(diǎn)后，用蒸餾水洗滌各孔，將微孔板置通風(fēng)處避光干燥。用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)讀板儀(美國CTL公司)讀板，自動(dòng)分析斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(spot forming cells，SFC)。對(duì)陽性孔SFC＞500的小鼠，計(jì)算抗原特異的分泌IFN-γ或IL-4的SFC(IFN-γ-SFC或IL-4-SFC)。抗原特異的IFN-γ-SFC或IL-4-SFC=抗原孔SFC－陰性孔SFC。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SE-hBCG對(duì)CgB誘導(dǎo)IgG抗體的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與SE-hBCG組(419.7±61.2)及CgB組(3333.0±737.9)比較，SE+CgB組及SE-hBCG+CgB組小鼠血清抗-CgB IgG抗體滴度(分別為21 333.0±2186.0、18 800.0±2396.0)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 小鼠不同免疫原誘導(dǎo)的抗-CgB IgG抗體滴度比較(以SE組血清為臨界值)Fig.1 Comparison of the anti-CgB IgG antibody levels in mice immunized with different immunogens

2.2 SE-hBCG對(duì)CgB誘導(dǎo)IFN-γ-SFC及IL-4-SFC的影響 ELISPOT檢測(cè)結(jié)果顯示，與SE組(104.5±28.8)比較，SE-hBCG組、SE-hBCG+CgB組CgB特異的IFN-γ-SFC(分別為266.0±87.9、440.5±38.4)均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與SE-hBCG+CgB組(440.5±38.4)比較，SE-hBCG組、CgB組、SE+CgB組CgB特異的IFN-γ-SFC(分別為266.0±87.9、189.2±21.4、199.2±38.6)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2A)。與CgB組(149.0±45.8)比較，SE組、SE-hBCG組、SE+CgB組、SE-hBCG+CgB組CgB特異的IL-4-SFC(分別為59.0±14.5、14.0±13.0、56.0±35.9、31.2±11.3)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2B)。

圖2 不同免疫原誘導(dǎo)小鼠CgB特異IFN-γ-SFC (A)及IL-4-SFC (B)的比較Fig.2 CgB-specific IFN-γ-SFC (A) and IL-4-SFC (B) induced by different immunogens of mice

2.3 SE-hBCG對(duì)Rab誘導(dǎo)抗-Rab IgG抗體水平的影響 初免后第4天，與PBS組及Rab組(OD450分別為0.094±0.006、0.096±0.003)比較，SE+Rab組及SE-hBCG+Rab組抗-Rab IgG抗體增加(OD450分別為0.20±0.01、0.15±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3A)。

2.4 SE-hBCG對(duì)Rab誘導(dǎo)抗-Rab IgG抗體水平隨時(shí)間變化的影響 初免后第8～35天，Rab組、SE+Rab組、SE-hBCG+Rab組免疫小鼠產(chǎn)生抗-Rab IgG抗體滴度隨時(shí)間變化趨勢(shì)基本一致，均于初免后第12天達(dá)到峰值(圖3B)；其中Rab組初免后第12天的抗-Rab IgG抗體滴度(16 200.0±6740.9)高于初免后第8、10、14、35天(分別為310.0±97.9、6730.0±1655.4、6000.0±1655.6、4400.0±1655.5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；SE+Rab組初免后第12天的抗-Rab IgG抗體滴度(36 000.0±6595.5)高于初免后第8、10、14、35天(分別為2000.0±273.9、7600.0±979.8、23 000.0±4358.9、12 000.0±2708.0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且初免后第14天的抗-Rab IgG抗體滴度高于初免后第8、10天(P＜0.05)；SE-hBCG+Rab初免后第12天的抗-Rab IgG抗體滴度(37 000.0±6633.2)高于初免后第8、10、14、35天(分別為1700.0±200.0、19 400.0±1661.3、23 000.0±358.9、23 600.0±6 038.2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且初免后第8天的抗-Rab IgG抗體滴度低于初免后第10、12、14、35天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

同一時(shí)間不同組抗-Rab IgG抗體滴度比較結(jié)果顯示，初免后第8、14天，SE+Rab組及SE-hBCG+Rab組抗-Rab IgG抗體滴度均高于Rab組(P＜0.05)；初免后第10天，SE-hBCG+Rab組抗-Rab IgG抗體滴度高于Rab組及SE+Rab組(P＜0.05)；初免后第35天，SE-hBCG+Rab組抗-Rab IgG抗體滴度高于Rab組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3B)。

圖3 SE-hBCG對(duì)Rab誘導(dǎo)抗-Rab IgG抗體水平的影響Fig.3 Influence of SE-hBCG on the anti-Rab IgG antibodies

2.5 SE-hBCG對(duì)Rab誘導(dǎo)Rab特異的IFN-γ-SFC的影響 不同時(shí)間組內(nèi)比較，Rab組、SE+Rab組及SE-hBCG+Rab組誘導(dǎo)Rab特異的IFN-γ-SFC隨時(shí)間變化趨勢(shì)基本一致，即先升高后降低(圖4)。其中Rab組初免后第8天Rab特異的IFN-γ-SFC達(dá)到峰值(243.6±83.3)，明顯高于初免后第4、14及35天(分別為44.6±14.1、61.4±18.2、48.8±7.0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；SE+Rab組初免后第14天的Rab特異的IFN-γ-SFC達(dá)到峰值(250.6±19.3)，明顯高于初免后第4、8及35天(分別為91.6±37.1、109.0±39.4、45.2±16.9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；SE-hBCG+Rab組初免后第8天的Rab特異的IFN-γ-SFC達(dá)到峰值(213.0±29.7)，明顯高于初免后第35天(80.4±36.8)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖4 各組小鼠初免后不同時(shí)間點(diǎn)Rab特異的IFN-γ-SFC水平比較Fig.4 Levels of Rab-specific IFN-γ-secreting spot forming cells of mice in each group after the first immunization

同一時(shí)間組間比較：初免后第4天，與對(duì)照組(6.4±3.5)比較，SE-hBCG+Rab組Rab特異的IFN-γ-SFC(110.8±52.5)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；初免后第8天，與對(duì)照組(32.2±12.9)比較，Rab組、SE-hBCG+Rab組Rab特異的IFN-γ-SFC(分別為243.6±83.3、213.0±29.7)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；初免后第14天，與SE+Rab組(250.6±19.3)比較，對(duì)照組、Rab組、SE-hBCG+Rab組Rab特異的IFN-γ-SFC(分別為11.4±5.1、61.4±18.2、105.2±33.7)明顯減少(P＜0.05)，且與對(duì)照組比較，SE-hBCG+Rab組Rab特異的IFN-γ-SFC明顯增加(P＜0.05)；初免后第35天，與對(duì)照組(4.4±2.5)比較，SE-hBCG+Rab組Rab特異的IFN-γ-SFC(80.4±36.8)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

3 討 論

重組蛋白疫苗可高產(chǎn)、高純度、低成本且安全性更好，但單純重組蛋白的免疫原性一般較差，需要佐劑增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。本研究結(jié)果顯示，SE-hBCG作為重組蛋白CgB佐劑誘導(dǎo)的抗-CgB IgG抗體滴度與SE+CgB組相當(dāng)，但抗原特異的IFN-γ-SFC明顯高于單純CgB組及SE+CgB組，而抗原特異的IL-4-SFC明顯低于單純CgB組，表明SE-hBCG作為重組蛋白CgB佐劑有利于細(xì)胞免疫應(yīng)答偏向Th1型。進(jìn)入臨床研究的MF59佐劑CgB疫苗的免疫原性優(yōu)于氫氧化鋁佐劑CgB疫苗[13]，但免疫保護(hù)效果不理想[14-15]；這是因?yàn)樵撘呙绮荒苷T導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示CgB主要誘導(dǎo)抗原特異的IL-4-SFC，而文獻(xiàn)報(bào)道MF59佐劑疫苗肌內(nèi)注射誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)一般以Th2型免疫為主[17]。因此，通過分析SE、SE-hBCG及MF59作為CgB佐劑誘導(dǎo)的免疫原性特征，推測(cè)SE-hBCG佐劑CgB疫苗的免疫保護(hù)效果優(yōu)于MF59佐劑CgB疫苗及SE佐劑疫苗。

SE-hBCG除了可增強(qiáng)病毒重組蛋白的免疫原性外，還可影響病毒天然蛋白的免疫原性。本研究結(jié)果顯示，SE-hBCG作為狂犬病疫苗的佐劑，可使機(jī)體產(chǎn)生的抗原特異IgG及IFN-γ-SFC免疫應(yīng)答提前且維持時(shí)間較長；除初免后第12天外的其他檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，SE-hBCG佐劑Rab疫苗組抗原特異的IgG抗體滴度均高于單純狂犬病疫苗組。有研究將BCG-CpGDNA作為不同劑量狂犬病疫苗的佐劑免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中和抗體及抗原特異的IFN-γ-SFC及IL-2-SFC均顯著高于單純狂犬病疫苗組[18]，與本研究結(jié)果基本一致。綜合以上結(jié)果，筆者認(rèn)為研制佐劑狂犬病疫苗可降低狂犬病疫苗劑量，減少接種針次，提早產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)遠(yuǎn)期免疫保護(hù)。

SE-hBCG誘導(dǎo)了CgB特異的Th1型免疫反應(yīng)，但本實(shí)驗(yàn)缺乏hBCG免疫小鼠組，因此無法解釋SE-hBCG誘導(dǎo)的CgB特異Th1型免疫反應(yīng)是hBCG的作用還是SE與hBCG協(xié)同作用的結(jié)果。這種現(xiàn)象與BCG免疫訓(xùn)練產(chǎn)生的效果相似，即BCG可通過刺激固有免疫細(xì)胞使其產(chǎn)生免疫記憶，從而產(chǎn)生針對(duì)MTB及其他病原體的免疫反應(yīng)和(或)免疫保護(hù)[19-23]。復(fù)合佐劑SE-hBCG通過激活天然免疫應(yīng)答而增強(qiáng)抗原特異的免疫應(yīng)答，也可通過免疫訓(xùn)練產(chǎn)生CgB蛋白特異的Th1型免疫反應(yīng)，這為SE-hBCG作為廣譜性佐劑提供了理論基礎(chǔ)。此外，本實(shí)驗(yàn)僅驗(yàn)證了兩種病毒抗原，還需要驗(yàn)證多種類型的抗原來闡明SE-hBCG復(fù)合佐劑的廣譜性。

綜上所述，SE-hBCG可增強(qiáng)狂犬病疫苗及重組蛋白CgB的免疫原性，包括增加抗原特異的IgG抗體生成并偏向Th1型免疫應(yīng)答。由于本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的免疫指標(biāo)偏少，尚需要增加免疫指標(biāo)以全面闡明SE-hBCG復(fù)合佐劑增強(qiáng)病毒抗原免疫應(yīng)答的機(jī)制。