吳久純，耿詩(shī)洋，谷芳秋，何韶衡，張慧云，劉敬禹*

1錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧錦州 121001；2錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心，遼寧錦州 121001；3錦州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，遼寧錦州 121001

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)都屬于慢性氣道炎癥性疾病，也是臨床上常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病。流行病學(xué)研究顯示，哮喘與COPD的發(fā)病率分別為17.6%和47.1%，但哮喘合并COPD的發(fā)病率則高達(dá)35%并呈逐年上升趨勢(shì)[1]。全球哮喘防治倡議(global asthma initiative，GINA)/慢性阻塞性肺疾病全球倡議(global initiative on chronic obstructive pulmonary disease，GOLD) (2017版)指出，哮喘-慢性阻塞性肺疾病重疊(asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap，ACO)表現(xiàn)為氣道持續(xù)性氣流受限，同時(shí)表現(xiàn)出哮喘和COPD的癥狀，可能是由不同病理生理基礎(chǔ)導(dǎo)致的不同臨床表現(xiàn)的氣道炎癥反應(yīng)[2]。截至目前，ACO的病因尚未明確，早期便有荷蘭假說(shuō)、英國(guó)假說(shuō)對(duì)ACO的發(fā)病機(jī)制做了詳盡闡述，但這些假說(shuō)的有效性仍存在爭(zhēng)議[3]。遺傳、肺發(fā)育不全、病毒感染、氣道高反應(yīng)性等可能是ACO的高危因素。起初，哮喘癥狀即反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急是ACO的主要癥狀，而后隨即出現(xiàn)COPD癥狀，表明ACO的一般特征是先出現(xiàn)哮喘癥狀而后出現(xiàn)COPD癥狀[4]。哮喘多數(shù)是由過(guò)敏原引起的IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病，哮喘晚期，嗜堿性粒細(xì)胞迅速滲入受影響的肺組織中，然后被內(nèi)源性激動(dòng)劑激活，從而釋放相關(guān)細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)[5]。嗜堿性粒細(xì)胞和組織中的肥大細(xì)胞是參與變態(tài)反應(yīng)性疾病的核心效應(yīng)細(xì)胞[6]，但嗜堿性粒細(xì)胞在健康人外周血中含量極低[7]，易被忽視。研究發(fā)現(xiàn)，人嗜堿性粒細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物包括CD203c、CD13、CD63、CD164等，其在疾病發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[7]。然而，目前對(duì)人嗜堿性粒細(xì)胞CD16和CD32在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用研究甚少。本研究探討了血液嗜堿性粒細(xì)胞CD16和CD32在ACO、COPD中的表達(dá)及其臨床意義，以期為臨床尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及儀器 PE標(biāo)記小鼠抗人CCR3抗體、FITC標(biāo)記小鼠抗人CD123抗體、PerCP標(biāo)記小鼠抗人HLA-DR抗體、APC/Cy7標(biāo)記小鼠抗人CD16抗體、APC標(biāo)記小鼠抗人CD32抗體、APC/Cy7標(biāo)記小鼠IgG1 κ同型抗體、APC標(biāo)記小鼠IgG2b κ同型抗體、去死細(xì)胞染料、FcR受體阻斷劑、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；人TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。FACS Verse流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；水浴恒溫振蕩器購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 研究對(duì)象 選取2019年12月－2020年12月就診于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院的COPD、ACO患者以及招募的健康志愿者作為研究對(duì)象，分別設(shè)為COPD組、ACO組和健康對(duì)照組。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；至少1個(gè)月內(nèi)未發(fā)生過(guò)呼吸道感染，未使用全身糖皮質(zhì)激素、支氣管擴(kuò)張劑、抗生素及免疫抑制劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：病情較重，因呼吸衰竭等疾病無(wú)法完成肺功能檢測(cè)；患有肝炎、結(jié)核等傳染性疾病及其他嚴(yán)重全身性疾病。COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2017年GOLD指南[8]，即有長(zhǎng)年咳嗽、咳痰及喘息等癥狀，吸煙、職業(yè)粉塵接觸等相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素，肺功能提示吸入支氣管舒張劑后第1秒用力呼氣末容積(forced end-expiratory volume at 1 second，F(xiàn)EV1)/用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)固定比率＜0.7。ACO診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2017年西班牙發(fā)布的COPD指南(Spanish COPD Guidelines，GesCOPD)[9]，符合COPD相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)且支氣管舒張?jiān)囼?yàn)為陽(yáng)性[10]，即有咳、痰、喘等相關(guān)呼吸道癥狀，肺功能提示吸入支氣管舒張劑后FEV1/FVC＜0.7、FEV1較用藥前增高≥12%且其絕對(duì)值增高≥200 ml。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，本研究獲得錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(JYDSY-KXYJIEC-2020-012)。

1.3 資料收集 收集研究對(duì)象的性別、年齡、病史、發(fā)病年齡、體重指數(shù)(body mass index，BMI)及吸煙史等一般資料，并采集10 ml外周血于EDTA抗凝真空采血管中。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血嗜堿性粒細(xì)胞富集群中CD16和CD32的表達(dá) 取外周血2 ml，1500 r/min離心10 min，血漿用于ELISA檢測(cè)，然后用含2%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基補(bǔ)全，吹打混勻，取120 μl于流式管中，加入1 μl去死細(xì)胞染料及3 μl人FcR受體阻斷劑，室溫避光孵育15 min；加入5 μl FITC標(biāo)記小鼠抗人CD123抗體(1:4)、PerCP標(biāo)記小鼠抗人HLA-DR抗體(1:4)、PE標(biāo)記小鼠抗人CCR3抗體(1:4)、APC/Cy7標(biāo)記小鼠抗人CD16抗體(1:4)、APC標(biāo)記小鼠抗人CD32抗體(1:4)，室溫避光孵育15 min；加入1.5 ml紅細(xì)胞裂解液吹打混勻，室溫避光孵育12 min；1200 r/min離心6 min，棄上清；加入1 ml PBS，用移液槍吹打混勻；1200 r/min離心6 min，棄上清，加入300 μl PBS，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)嗜堿性粒細(xì)胞富集群中CD16和CD32細(xì)胞的比例及平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)，采用Flowjo 10.0軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 ELISA檢測(cè)血漿中TNF-α含量 根據(jù)TNF-α ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)血漿中TNF-α含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析(F檢驗(yàn))或非參數(shù)Kruskal-WallisH分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組一般資料比較 共納入13名健康志愿者、11例COPD患者和28例ACO患者。三組性別、年齡、病史、發(fā)病年齡、BMI及吸煙史等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

表1 三組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data among three groups

2.2 三組外周血嗜堿性粒細(xì)胞富集群中CD16和CD32的表達(dá)情況 采用3種方法標(biāo)記嗜堿性粒細(xì)胞，分別檢測(cè)CD16和CD32在粒細(xì)胞群和單個(gè)核細(xì)胞群中的表達(dá)，結(jié)果顯示，三組外周血粒細(xì)胞群中3種方法標(biāo)記的CD16+嗜堿性粒細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。與健康對(duì)照組相比，ACO組、COPD組外周血單個(gè)核細(xì)胞群中CD16+CCR3+細(xì)胞比例分別增高2.18倍和1.68倍(Z=-2.998，P=0.002；Z=-2.637，P=0.007)，CD16+CD123+HLA-DR細(xì)胞比例分別增高1.13倍和0.96倍(Z=-3.026，P=0.002；Z=-2.868，P=0.003)，CD16+CCR3+CD123+HLADR-細(xì)胞比例分別增高3.67倍和2.26倍(Z=-3.278，P=0.001；Z=-2.521，P=0.011，圖1)。

圖1 三組不同標(biāo)記方法下外周血粒細(xì)胞群和單個(gè)核細(xì)胞群中CD16+細(xì)胞比例Fig.1 Proportion of CD16+ cells in peripheral blood granulocyte population and mononuclear cell population in three groups with different labeling methods

與健康對(duì)照組相比，COPD組外周血粒細(xì)胞群中CD32+CCR3+細(xì)胞、CD32+CCR3+CD123+HLADR-細(xì)胞比例分別增高4.67倍和3.79%(Z=-3.187，P=0.001；Z=-2.498，P=0.011)，單個(gè)核細(xì)胞群中CD32+CD123+HLA-DR-細(xì)胞、CD32+CCR3+CD123+HLA-DR-細(xì)胞比例分別增高3.70%和3.33%(Z=-2.871，P=0.003；Z=-2.180，P=0.030)，ACO組外周血粒細(xì)胞群中CD32+CD123+HLA-DR-細(xì)胞和CD32+CCR3+CD123+HLA-DR-細(xì)胞比例分別下降18.57%和20.89%(Z=-2.311，P=0.019；Z=-2.144，P=0.031，圖2)。

圖2 三組不同標(biāo)記方法下外周血粒細(xì)胞群和單個(gè)核細(xì)胞群中CD32+細(xì)胞比例Fig.2 Proportion of CD32+ cells in peripheral blood granulocyte population and mononuclear cell population in three groups with different labeling methods

2.3 三組外周血嗜堿性粒細(xì)胞中CD16和CD32 MFI比較 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在粒細(xì)胞群和單個(gè)核細(xì)胞群中，COPD組3種標(biāo)記方法標(biāo)記的CD16和CD32 MFI與健康對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖3－4)。ACO組外周血粒細(xì)胞群中CCR3+細(xì)胞和CCR3+CD123+HLA-DR-細(xì)胞的CD32 MFI分別較健康對(duì)照組降低30.7%和37.31%(Z=-2.718，P=0.006；Z=-1.975，P=0.047，圖4)。

圖3 三組不同標(biāo)記方法下外周血單個(gè)核細(xì)胞群中嗜堿性粒細(xì)胞中CD16和CD32 MFIFig.3 MFI of basophil granulocyte CD16 and CD32 in peripheral blood mononuclear cell population of three groups with different labeling methods

圖4 三組不同標(biāo)記方法下外周血粒細(xì)胞群中嗜堿性粒細(xì)胞中CD16和CD32 MFIFig.4 MFI of basophil granulocyte CD16 and CD32 in peripheral blood granulocytes population in three groups with different labeling methods

2.4 三組血漿TNF-α表達(dá)水平比較 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，ACO組血漿TNF-α表達(dá)水平增高2.02倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.078，P=0.036)；COPD組與健康對(duì)照組血漿TNF-α表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖5)。

圖5 三組血漿TNF-α表達(dá)水平比較Fig.5 Expression level of plasma TNF-α in ACO, COPD patients and healthy control subjects

3 討 論

嗜堿性粒細(xì)胞由骨髓造血多能干細(xì)胞分化而來(lái)，逐漸成熟后進(jìn)入血液循環(huán)，雖然所占比例不到1%，但在過(guò)敏性疾病中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]。據(jù)報(bào)道，嗜堿性粒細(xì)胞可以表達(dá)多種受體，如補(bǔ)體、白細(xì)胞介素受體、前列腺素(prostaglandin，PG)受體、趨化因子以及免疫球蛋白Fc受體[11]。但目前對(duì)于嗜堿性粒細(xì)胞表面CD16和CD32的表達(dá)情況了解較少。本研究采用CCR3+[12]、CD123+HLADR-[13]和CCR3+CD123+HLA-DR-[14]3種方法標(biāo)記嗜堿性粒細(xì)胞：其中CCR3+CD123+HLA-DR-標(biāo)記的細(xì)胞為嗜堿性粒細(xì)胞[14]；CCR3+在粒細(xì)胞群中標(biāo)記嗜堿性粒細(xì)胞，在單個(gè)核細(xì)胞群中可標(biāo)記少部分淋巴細(xì)胞[15]；CD123+HLA-DR-在單個(gè)核細(xì)胞群中僅標(biāo)記嗜堿性粒細(xì)胞[16]，但在粒細(xì)胞群中可標(biāo)記髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)[17]。最近研究發(fā)現(xiàn)，CD16是由兩個(gè)同源亞單位ζ和γ通過(guò)二硫鍵連接形成的二聚體，與高親和力的CD16受體特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，清除免疫復(fù)合物[18]。本研究結(jié)果顯示，ACO、COPD患者血液中CCR3+、CD123+HLA-DR-、CCR3+CD123+HLA-DR-單個(gè)核細(xì)胞群中CD16+細(xì)胞比例升高，而在粒細(xì)胞群中3種方法標(biāo)記的CD16+細(xì)胞比例無(wú)明顯差異。ACO、COPD患者單個(gè)核細(xì)胞群中CD16+CCR3+細(xì)胞比例分別增高2.18倍和1.68倍，可能源于淋巴細(xì)胞(而非嗜堿性粒細(xì)胞)CD16表達(dá)升高，但CD16+CD123+HLADR-和CD16+CCR3+CD123+HLA-DR-細(xì)胞比例明顯升高，表明ACO、COPD兩種疾病很可能通過(guò)嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)CD16而誘導(dǎo)發(fā)病，提示嗜堿性粒細(xì)胞可能是CD16拮抗劑發(fā)揮作用的靶細(xì)胞，這為后續(xù)ACO、COPD的臨床治療提供了新的方向。

嗜堿性粒細(xì)胞源的CD32是一種低親和力的IgG受體(FcγRⅡ)，包括FcγRⅡA、FcγRⅡB和FcγRⅡC 3個(gè)亞型，其中FcγRⅡA、FcγRⅡC為激活受體，F(xiàn)cγRⅡB為抑制受體[19]，可以抑制IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)[20]。本研究結(jié)果顯示，COPD患者血液中CD32+CD123+HLA-DR-細(xì)胞、CD32+CCR3+CD123+HLA-DR-細(xì)胞比例在單個(gè)核細(xì)胞群中增高，CD32+CCR3+細(xì)胞、CD32+CCR3+CD123+HLA-DR-細(xì)胞比例在粒細(xì)胞群中增高；ACO患者血液中CD32+CD123+HLA-DR-細(xì)胞和CD32+CCR3+CD123+HLA-DR-細(xì)胞比例在粒細(xì)胞群中降低，表明CD32在ACO、COPD中差異性表達(dá)，考慮原因?yàn)槭葔A性粒細(xì)胞可能通過(guò)表達(dá)不同亞型的CD32而致病。在粒細(xì)胞群和單個(gè)核細(xì)胞群中，COPD患者3種方法標(biāo)記的嗜堿性粒細(xì)胞CD32 MFI與健康對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，而ACO患者血液粒細(xì)胞群中CCR3+細(xì)胞和CCR3+CD123+HLA-DR-細(xì)胞的CD32 MFI降低，進(jìn)一步證實(shí)嗜堿性粒細(xì)胞CD32在不同疾病中的表達(dá)不同。因此，檢測(cè)血液嗜堿性粒細(xì)胞CD32的表達(dá)可能有助于ACO、COPD的鑒別診斷，利于指導(dǎo)臨床治療。此外，ACO起初出現(xiàn)哮喘癥狀，而哮喘癥狀多因接觸過(guò)敏原、冷空氣后發(fā)生變態(tài)反應(yīng)所致，考慮嗜堿性粒細(xì)胞通過(guò)表達(dá)CD32可能抑制該過(guò)敏反應(yīng)，提示哮喘可能在ACO中占主導(dǎo)作用，本研究結(jié)果有助于理解嗜堿性粒細(xì)胞參與ACO、COPD發(fā)病的機(jī)制，進(jìn)一步研究可建立小鼠模型探討具體致病通路。

TNF-α是一種可以對(duì)炎癥、感染和損傷迅速做出反應(yīng)的細(xì)胞因子，早期參與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)進(jìn)程，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[21]。遲春天等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是預(yù)測(cè)慢性炎癥性疾病嚴(yán)重程度的潛在標(biāo)志物，高水平的TNF-α可導(dǎo)致體內(nèi)炎癥加劇。ACO發(fā)病可能是由氣道炎癥反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性及氣道結(jié)構(gòu)破壞等多種因素共同導(dǎo)致的，其主要表現(xiàn)是同時(shí)具有COPD和哮喘相關(guān)的特征，但ACO患者較單純COPD、哮喘患者臨床癥狀重、合并癥多且急性加重頻繁[23]。本研究結(jié)果顯示，ACO患者血漿中TNF-α水平明顯升高，考慮ACO相關(guān)臨床表現(xiàn)與血漿中TNF-α水平升高有關(guān)，從而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，這對(duì)ACO的早期診斷與治療具有重要意義。

本研究存在一定的局限性：受新冠肺炎疫情的影響，樣本收集困難，實(shí)驗(yàn)進(jìn)展緩慢，研究對(duì)象相對(duì)較少，研究結(jié)果有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以驗(yàn)證；CD16和CD32參與ACO、COPD發(fā)病的機(jī)制尚不明確，后續(xù)需建立動(dòng)物模型進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，嗜堿性粒細(xì)胞源的CD16和CD32以及TNF-α等生物標(biāo)志物可能在ACO、COPD發(fā)病中起著重要作用，且CD16和CD32可作為預(yù)防和治療ACO、COPD的重要靶點(diǎn)，為慢性氣道炎癥性疾病的預(yù)防與治療提供了新方向。