禁食暫養(yǎng)對卵形鯧鲹有水?；钌眄憫挠绊?/h1>
2022-01-19 02:40周結(jié)倩1范秀萍1帥1孫欽秀1夏秋瑜1劉書成1
廣東海洋大學學報 2022年1期
張 坤，周結(jié)倩1,，范秀萍1,,3，魏 帥1,,3，孫欽秀1,,3，夏秋瑜1,,3，劉書成1,,3
禁食暫養(yǎng)對卵形鯧鲹有水?；钌眄憫挠绊?/p>
張 坤2，周結(jié)倩1,2，范秀萍1,2,3，魏 帥1,2,3，孫欽秀1,2,3，夏秋瑜1,2,3，劉書成1,2,3
（1. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江），廣東 湛江 524025；2. 廣東海洋大學食品科技學院 // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室 // 廣東省海洋食品工程技術研發(fā)中心 // 廣東省海洋生物制品工程重點實驗室 //水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088；3. 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學，遼寧 大連 116034）
【目的】探究禁食暫養(yǎng)對卵形鯧鲹有水保活生理響應的影響，為卵形鯧鲹的?；钸\輸?shù)於ɑA?！痉椒ā客ㄟ^測定暫養(yǎng)過程中水體的總氨氮和pH值、卵形鯧鲹血液生理生化指標、肌肉氧化應激指標等的變化，分析確定卵形鯧鲹有水?；畹慕硶吼B(yǎng)條件?！窘Y(jié)果與結(jié)論】禁食暫養(yǎng)過程中，隨著暫養(yǎng)時間的延長，水體總氨氮含量與pH值顯著上升，但在禁食暫養(yǎng)時間為6 h時，其總氨氮質(zhì)量濃度為3.22 mg/L和pH值為7.80；禁食暫養(yǎng)6 h可以降低或減少卵形鯧鲹的應激，使血液中乳酸脫氫酶（LDH）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性以及皮質(zhì)醇（Cortisol）、血糖（GLU）、尿素氮（BUN）和總膽固醇（T-CHO）含量處于較低水平，分別為2 785.53 U/L、19.04 U/L、158.72 ng/mL、2.98 mmol/L、4.35 mmol/L和4.96 mmol/L；同時減輕了應激帶來的肌肉組織氧化損失，使過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量維持在較低水平，分別為6.34 U/L和5.86 mmol/L；卵形鯧鲹適宜的暫養(yǎng)條件為在魚水比魚∶水=1∶20 和（25±1）℃的潔凈海水中暫養(yǎng)6 h。
禁食暫養(yǎng)；卵形鯧鲹；應激；有水?；?；生理響應
卵形鯧鲹（）屬硬骨魚綱、鱸形目鲹科鯧鲹屬，俗名黃臘鯧、金鯧，是我國南方沿海名貴經(jīng)濟魚類之一[1]。近年來，由于育苗和養(yǎng)殖技術的成熟，卵形鯧鲹成為南方沿海深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要魚種。2020年我國卵形鯧鲹養(yǎng)殖產(chǎn)量約為16 ～ 17萬t，產(chǎn)值達200多億元[2]。卵形鯧鲹魚肉細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)價值高、無肌間小刺，深受消費者喜愛[3]。活鮮是卵形鯧鲹銷售的主要形式之一，經(jīng)濟效益較高，而因卵形鯧鲹是暖水性海水魚類，捕撈后應激反應強烈，在低溫（<13 ℃）下容死亡[4]，造成運輸保活困難。因此，研究卵形鯧鲹的?；钸\輸關鍵技術對于解決活鮮銷售問題具有重要意義。
運輸前的暫養(yǎng)是?；钸\輸?shù)年P鍵技術之一。暫養(yǎng)是將魚類從養(yǎng)殖區(qū)捕撈后放入暫養(yǎng)池中停餌養(yǎng)殖一段時間，本質(zhì)是在維持魚類生存環(huán)境條件下實施適度饑餓脅迫[5-7]。適度饑餓脅迫可以調(diào)節(jié)能量代謝和降低氧化應激等提高機體的抗逆能力，同時可以加速魚體內(nèi)代謝物的排泄，減少新陳代謝和耗氧量，減少捕撈導致的應激反應，延長?；顣r間，提高存活率[8]。本研究以卵形鯧鲹為研究對象，研究禁食暫養(yǎng)過程中卵形鯧鲹生理響應的變化，確定卵形鯧鲹?；詈线m的暫養(yǎng)條件，為卵形鯧鲹保活運輸前的準備提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
卵形鯧鲹（），平均體質(zhì)量（500 ± 50）g，體質(zhì)健康，無傷，鱗片完整，購于廣東省湛江市東風水產(chǎn)市場。
1.2 主要試劑與儀器
谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、葡萄糖（Glucose，GLU）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）、總膽固醇（Total cholesterol，T-CHO）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）等檢測試劑盒，南京建成生物科技有限公司；蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒，上海生工生物工程有限公司；皮質(zhì)醇（Cortisol）檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；水質(zhì)總氨氮含量測定試劑，解析科技（深圳）有限公司。
SG68便攜式pH/離子/溶氧多參數(shù)測試儀，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；MD5-100-G低溫恒溫循環(huán)槽，蘇州吉米諾儀器有限公司；PR-100SA數(shù)顯折射計（鹽度計），廣州市愛宕科學儀器有限公司；BJPX-150微生物恒溫培養(yǎng)箱山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；YC109便攜式氨氮測定儀解析科技（深圳）有限公司；Varioskan全自動酶標儀美國ThermoFisher公司；UV-2550紫外可見分光光度計日本島津公司；JIDI-20R高速冷凍離心機廣州吉迪儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 暫養(yǎng)和低溫?；钐幚?將從市場購置運送至實驗室（約40 min）卵形鯧鲹隨機分為4組，每組5條魚，按照魚水比魚∶水=1∶20分別放入水箱中，禁食暫養(yǎng)進行饑餓脅迫，控制暫養(yǎng)溫度（25 ± 1）℃，暫養(yǎng)期間持續(xù)供氧和水循環(huán)，保證暫養(yǎng)海水中溶解氧充足和過濾除去不溶于水的代謝廢物。
在禁食暫養(yǎng)0、6、12、24、48 h后，分別從每組中隨機撈出1條，共4條，放入溫度為（25±1）℃的新鮮海水中進行梯度降溫。梯度降溫程序如下：當水溫高于20 ℃時，以3 ℃/h的速率逐漸降溫；當水溫在16 ～ 20 ℃之間時，以2 ℃/h的速率逐漸降溫；水溫低于16 ℃時，以1 ℃/h的速率逐漸降溫[9]。
降溫結(jié)束魚逐漸進入休眠狀態(tài)，將其轉(zhuǎn)移到（15±0.5）℃?；钏渲斜；睿~水比為魚∶水=1∶10，每4 h觀察1次。實驗重復3次，魚鰓部有呼吸、魚體表面無損傷視為活體，反復刺激無反應或魚體全身充血、呼吸極不規(guī)律視為死亡。記錄每條魚的存活時間，計算每組的平均存活時間。
1.3.2 水質(zhì)測定 在卵形鯧鲹禁食暫養(yǎng)0、6、12、24、48 h時，分別采集暫養(yǎng)水箱的海水，將海水置于50 mL的聚乙烯離心管中，并加蓋密封。用F2手持pH計測海水pH值，用YC109便攜式氨氮測定儀測海水中總氨氮含量，用SG68便攜式離子/溶氧多參數(shù)測試儀測海水中的溶解氧。
1.3.3 代謝指標測定 經(jīng)過1.3.1節(jié)處理?；?2 h的卵形鯧鲹迅速從?；钏渲袚瞥觯诺?50 mg/L的MS-222麻醉液中快速麻醉。用10 mL的注射器從卵形鯧鲹的尾靜脈抽血，去掉針頭將血液注入10 mL的離心管中，全血不加抗凝劑，在4 ℃放置2 h，待血液明顯分層后以5 000 r/min離心20 min，收集魚的血清，置于-80 ℃的冰箱保存[10]。分別用微板法、比色法、酶聯(lián)免疫法測定AST、LDH、皮質(zhì)醇；分別用葡萄糖氧化酶法、脲酶法、分光光度法測定GLU、BUN、T-CHO。
1.3.4 氧化應激指標測定 取卵形鯧鲹背部肌肉，按照肌∶水=1∶9加入生理鹽水，在冰水浴條件下制成質(zhì)量濃度10%的組織勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液用于測定CAT活性和MDA。用過氧化氫酶試劑盒測檢測CAT活性，CAT分解過氧化氫的反應因加入鉬酸銨立即中止，剩下過氧化氫與鉬氨酸作用產(chǎn)生淡黃色絡合物，在405 nm處具有較高吸收能力[11]。用丙二醛試劑盒檢測MDA的含量，過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有較高吸收能力[12]。
1.3.5 數(shù)據(jù)處理 實驗重復3次，試驗結(jié)果用平均值±標準差表示，用JMP軟件進行單因素方差分析和TurkeyHSD多重比較，< 0.05 表示組間差異顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 暫養(yǎng)時間對卵形鯧鲹存活能力的影響
卵形鯧鲹從水產(chǎn)市場運輸至實驗室后未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）直接進行梯度降溫和保活，存活時間為32 h；暫養(yǎng)6 h后再進行梯度降溫和?；?，卵形鯧鲹可以存活38 h，顯著長于未經(jīng)暫養(yǎng)的（0 h）（< 0.05）（圖1）。因為卵形鯧鲹從水產(chǎn)市場運輸至實驗室未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）直接進行梯度降溫和?；?，運輸過程和低溫都會使魚體產(chǎn)生強烈應激，魚體對外界環(huán)境的抵抗力降低，免疫力下降，抗病能力減弱，同時強烈應激也會產(chǎn)生大量代謝廢物使水質(zhì)變差[13]。當卵形鯧鲹暫養(yǎng)時間分別為12、24、48 h時再進行梯度降溫和?；睿浯婊顣r間又變短（< 0.05）。暫養(yǎng)過程是禁食的，會產(chǎn)生饑餓脅迫。適度饑餓脅迫可以調(diào)節(jié)能量代謝和降低氧化應激等提高機體的抗逆能力，同時可以加速魚體內(nèi)代謝物的排泄，減少新陳代謝和耗氧量，減少捕撈導致的應激反應，延長保活時間，提高存活率[8]；但是饑餓脅迫時間長，魚體會加速對自身營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，使后期?；钸^程中營養(yǎng)物質(zhì)供應不足，同時魚體產(chǎn)生代謝廢物也增加，對暫養(yǎng)中的魚體造成氨氮脅迫而再次應激。不同魚類需要暫養(yǎng)的時間是有顯著差異的，這與魚的種類和生活習性有密切關系。珍珠龍膽石斑魚在禁食暫養(yǎng)48 h后進行梯度降溫和保活，其存活時間最長[14]。卵形鯧鲹適宜的禁食暫養(yǎng)時間是6 h。
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
2.2 暫養(yǎng)過程中水質(zhì)的變化
暫養(yǎng)使用海水是經(jīng)過充分曝氣的新鮮海水，新鮮海水的總氨氮含量為零。從圖2可以看出，隨著卵形鯧鲹暫養(yǎng)時間增加，水體的總氨氮含量呈上升趨勢。暫養(yǎng)24 h時，水體中總氨氮含量達到12.8 mg/L，水質(zhì)逐漸變渾濁與微黃；暫養(yǎng)48 h時，水體中總氨氮含量接近20 mg/L，水質(zhì)變黃會對魚體造成脅迫，威脅魚體生命。因為外界環(huán)境總氨氮含量過高，會使魚體血液中的氨氮不能排出，血液中氨氮濃度升高，血液pH值也會升高，多種酶活性受到抑制，同時血液運輸氧能力降低，導致魚類窒息[15]。
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
從圖3可以看出，隨著卵形鯧鲹暫養(yǎng)時間的增加，水體pH值呈上升趨勢，而溶解氧質(zhì)量濃度并無顯著變化（> 0.05）。在暫養(yǎng)過程中水體一直由打氧泵不停供氧，可以使水體中溶氧與魚體消耗氧達到動態(tài)平衡。隨著暫養(yǎng)時間增加，由于魚體代謝排泄氨氮廢物，會使水體pH值有所增加，但是變化范圍較小，仍然在卵形鯧鲹適宜生存的pH值范圍[16]。
2.3 暫養(yǎng)時間對卵形鯧鲹?；钸^程中應激的影響
由圖4可見，暫養(yǎng)0 h的皮質(zhì)醇含量顯著高于（< 0.05）其它暫養(yǎng)組；當暫養(yǎng)6 h時，魚體血液中皮質(zhì)醇含量顯著降低（< 0.05）；暫養(yǎng)時間12 h，血液皮質(zhì)醇含量又顯著升高（< 0.05）。皮質(zhì)醇（Cortisol）被作為應激反應的敏感指標，可以反映魚類應激的強弱，當魚類受到應激后，下丘腦一垂體一腎間組織軸會迅速作用促進促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，從而導致頭腎細胞皮質(zhì)醇激素的合成與釋放[17]。卵形鯧鲹從市場購置運送到實驗室經(jīng)過短途運輸，魚體受到運輸應激導致血液中皮質(zhì)醇含量增加。經(jīng)過6 h暫養(yǎng)，短途運輸帶來的應激已經(jīng)消除，魚體血液中皮質(zhì)醇含量降低；暫養(yǎng)12 h血液皮質(zhì)醇含量升高，水體中氨氮含量增加使水質(zhì)變差，氨氮脅迫也會使魚體產(chǎn)生應激[18]。暫養(yǎng)24 h時，血液皮質(zhì)醇含量又顯著降低（< 0.05），這是由于暫養(yǎng)時間較長，魚體自我調(diào)節(jié)能力使之逐漸適應水體環(huán)境。
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
由圖5可見，卵形鯧鲹不經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）時，血糖含量處于比較高的水平，即短暫的“高血糖”癥狀。這是因為血糖（GLU）也是反映魚體應激的指標之一。當魚體發(fā)生因為短途運輸產(chǎn)生應激反應時，生命活動變得劇烈，新陳代謝旺盛會使魚體血糖濃度上升[19]。當卵形鯧鲹暫養(yǎng)6 ～ 12 h之后，血糖含量顯著下降（< 0.05），這說明禁食暫養(yǎng)（饑餓脅迫）可以有效降低捕撈運輸帶來的應激效應；再延長暫養(yǎng)時間（24 ～ 48 h），血糖含量還會持續(xù)下降（< 0.05），這可能是因為魚體禁食而沒有能量來源，魚體需不斷消耗能量以維持自身的生命活動，則魚體內(nèi)的血糖就會被分解用以能量的供給[20]。
2.4 禁食暫養(yǎng)時間對卵形鯧鲹保活過程中物質(zhì)代謝影響
從表1可見，未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）卵形鯧鲹的LDH活性處于較高水平，顯著高于暫養(yǎng)6、12和24 h的（< 0.05）。乳酸脫氫酶（LDH）能夠催化丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化，是糖代謝酵解途徑的關鍵酶之一，當魚體受到外界環(huán)境脅迫時會引起LDH活性升高[21]。本研究中，從市場購置的卵形鯧鲹運到實驗室，短途運輸使魚體產(chǎn)生應激而使LDH活性升高，促進糖的代謝；經(jīng)過禁食暫養(yǎng)6、12和24 h，魚體應激逐漸消除，LDH活性也逐漸恢復。卵形鯧鲹暫養(yǎng)48 h時LDH活性又顯著升高（< 0.05），這是由于禁食暫養(yǎng)時間延長，魚體產(chǎn)生代謝廢物使水體中總氨氮含量升高，氨氮和饑餓脅迫都會使魚體受到外界環(huán)境變差而使LDH活性增加[18, 22]。
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
正常情況下，血液中AST的活性較低且穩(wěn)定，當魚體受到脅迫或者肝臟受到損傷時，AST活性升高[23]。從表1可以看出，卵形鯧鲹暫養(yǎng)6 h和12 h時AST活性顯著低于其他暫養(yǎng)組（< 0.05），這也說明適度禁食暫養(yǎng)（饑餓脅迫）可以減少魚體應激。未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）卵形鯧鲹的AST活性較高，是因為受到短途運輸帶來的應激所造成。暫養(yǎng)24 h和48 h卵形鯧鲹的AST活性較高，是因為受到氨氮脅迫和饑餓脅迫帶來的應激，甚至使魚體肝臟受損。尤宏爭等[22]也發(fā)現(xiàn)珍珠龍膽石斑魚（♀×♂）經(jīng)30 min的運輸脅迫后AST活性顯著上升（< 0.05），暫養(yǎng)一段時間后AST活性又恢復至運輸前水平。
從表1可以看出，隨著暫養(yǎng)時間增加，卵形鯧鲹血液的BUN含量顯著升高（< 0.05）。與未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）的相比，暫養(yǎng)48 h后卵形鯧鲹血液的BUN含量增加了4倍。這可能是因為尿素氮（BUN）是蛋白質(zhì)代謝終產(chǎn)物，是反映腎功能代謝的重要指標，未經(jīng)暫養(yǎng)的卵形鯧鲹僅受短途運輸應激，對腎臟影響較小，代謝的BUN可以及時排出體外；隨著暫養(yǎng)時間延長，受到水體氨氮和饑餓的雙重脅迫，魚體腎臟可能受到損傷，魚體代謝廢物積累不能及時排出體外，使血液中BUN含量增加[24]。
從表1可以看出，隨暫養(yǎng)時間增加，卵形鯧鲹血液總膽固醇含量逐漸上升（< 0.05）。由于暫養(yǎng)過程是禁食的，卵形鯧鲹在暫養(yǎng)早期以消耗糖原供能為主，隨著暫養(yǎng)時間延長，體內(nèi)糖原含量顯著下降，不能滿足魚體代謝能量需要，逐漸消耗脂肪維持生命活動而生產(chǎn)膽固醇。且糖異生作用因為長時間禁食而加強，使血清中起運輸功能的膽固醇也會明顯增多[25]。
表1 暫養(yǎng)過程中卵形鯧鲹物質(zhì)代謝的變化
注：同列的不同小寫字母表示差異顯著（< 0.05）
Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant difference（< 0.05）
2.5 暫養(yǎng)時間對卵形鯧鲹氧化應激的影響
從圖6和圖7可以看出，暫養(yǎng)時間對卵形鯧鲹的CAT活性和MDA含量（氧化應激指標）均有顯著影響（< 0.05）。未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）卵形鯧鲹的CAT活性和MDA含量均處于較高水平，因為卵形鯧鲹經(jīng)過捕撈操作和短距離運輸產(chǎn)生應激，使其受到了氧化損傷[26-27]。肌肉組織中的CAT活性和MDA含量顯著下降（< 0.05）；與未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）的相比，卵形鯧鲹暫養(yǎng)6 h后CAT活性下降了24.0％、MDA含量下降了21.0％，說明適度的禁食暫養(yǎng)（饑餓脅迫）可以減少應激帶來的氧化損傷。隨著暫養(yǎng)時間延長，卵形鯧鲹肌肉組織中的CAT活性和MDA含量又有所升高（< 0.05），同樣是因為受到水體氨氮和饑餓的雙重脅迫，魚體再次受到氧化損傷。
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
3 結(jié)論
研究禁食暫養(yǎng)對卵形鯧鲹有水?；钌眄憫挠绊懀_定了適宜的暫養(yǎng)時間，結(jié)論如下：1）禁食暫養(yǎng)過程中水體總氨氮含量與pH值顯著上升，溶解氧含量無顯著變化；2）禁食暫養(yǎng)6 h可以降低或減少卵形鯧鲹的應激，使血液中LDH和AST活性以及皮質(zhì)醇、GLU、BUN和T-CHO含量處于較低水平，同時減輕應激帶來的肌肉組織氧化損失，使CAT活性和MDA含量維持在較低水平；3）當暫養(yǎng)條件為（25±1）℃、魚水比魚∶水=1∶20的潔凈海水中暫養(yǎng)時，暫養(yǎng)6 h最為合適。
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Effects of Fasting Acclimation on the Physiological Response to Water Preservation of
ZHANG Kun2, ZHOU Jie-qian1,2, FAN Xiu-ping1,2,3, WEI Shuai1,2,3, SUN Qin-xiu1,2,3, XIA Qiu-yu1,2,3, LIU Shu-cheng1,2,3
（1.,524025,; 2.,////////,524088,; 3.,,116034,）
【Objectives】To explore the effect of fasting acclimation on the physiological response to water preservation of golden pompano,in order to lay down the foundation for the preservation and transportation of golden pompano.【Methods】By measuring the changes of total ammonia nitrogen and pH value of the water body, the blood physiological and biochemical indexes of golden pompano, and the oxidative stress index of muscle during the fasting acclimation process. The fasting acclimation conditions of golden pompano were analyzed and determined.【Results and Conclusions】The results showed that during the fasting acclimation, with the extension of fasting acclimation time, the total ammonia nitrogen content and pH value of the water body increased significantly. When the fasting acclimation time was 6 h, the total ammonia nitrogen content was 3.22 mg/L and the pH value was 7.80, the fasting acclimation for 6 hours can reduce or reduce the stress of the golden pompano, make the blood lactate dehydrogenase (LDH) and aspartate aminotransferase (AST) activity and the content of cortisol, blood sugar (GLU), blood urine nitrogen (BUN) and total cholesterol (T-CHO) at a lower level,Its activity and content are 2785.53 U/L, 19.04 U/L, 158.72 ng/mL, 2.98 mmol/L, 4.35 mmol/L and 4.96 mmol/L, respectively; at the same time, it reduces the oxidative loss of muscle tissue caused by stress, so that catalase (CAT) activity and malondialdehyde (MDA) content are maintained at a low level, Its activity and content are 6.34 U/L and 5.86 mmol/L; the suitable fasting acclimation conditions for golden pompano are the fish-water ratio offishtowater1∶20 and (25 ± 1) ℃ of clean seawater for 6 hours.
fasting acclimation;; stress; keeping alive with water; physiological response
Q981.1
A
1673-9159（2022）01-0044-06
10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.007
張坤，周結(jié)倩，范秀萍，等. 禁食暫養(yǎng)對卵形鯧鲹有水?；钌眄憫挠绊慬J]. 廣東海洋大學學報，2022，42（1）：44-49.
2021-09-08
南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江）資助（ZJW-2019-06）；廣東普通高等學校海洋食品綠色加工技術研究團隊（2019KCXTD011）
張 坤（1996－），男，碩士研究生，研究方向為海洋食品加工新技術。E-mail：2546381595@qq.com
范秀萍（1979－），女，副教授，研究方向為魚類?；钸\輸。E-mail：fanxp08@163.com
劉書成（1977－），男，教授，研究方向為海洋食品加工新技術。E-mail：Lsc771017@163.com
（責任編輯：劉嶺）
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張 坤，周結(jié)倩1,，范秀萍1,,3，魏 帥1,,3，孫欽秀1,,3，夏秋瑜1,,3，劉書成1,,3
禁食暫養(yǎng)對卵形鯧鲹有水?；钌眄憫挠绊?/p>
張 坤2，周結(jié)倩1,2，范秀萍1,2,3，魏 帥1,2,3，孫欽秀1,2,3，夏秋瑜1,2,3，劉書成1,2,3
（1. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江），廣東 湛江 524025；2. 廣東海洋大學食品科技學院 // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室 // 廣東省海洋食品工程技術研發(fā)中心 // 廣東省海洋生物制品工程重點實驗室 //水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088；3. 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學，遼寧 大連 116034）
【目的】探究禁食暫養(yǎng)對卵形鯧鲹有水保活生理響應的影響，為卵形鯧鲹的?；钸\輸?shù)於ɑA?！痉椒ā客ㄟ^測定暫養(yǎng)過程中水體的總氨氮和pH值、卵形鯧鲹血液生理生化指標、肌肉氧化應激指標等的變化，分析確定卵形鯧鲹有水?；畹慕硶吼B(yǎng)條件?！窘Y(jié)果與結(jié)論】禁食暫養(yǎng)過程中，隨著暫養(yǎng)時間的延長，水體總氨氮含量與pH值顯著上升，但在禁食暫養(yǎng)時間為6 h時，其總氨氮質(zhì)量濃度為3.22 mg/L和pH值為7.80；禁食暫養(yǎng)6 h可以降低或減少卵形鯧鲹的應激，使血液中乳酸脫氫酶（LDH）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性以及皮質(zhì)醇（Cortisol）、血糖（GLU）、尿素氮（BUN）和總膽固醇（T-CHO）含量處于較低水平，分別為2 785.53 U/L、19.04 U/L、158.72 ng/mL、2.98 mmol/L、4.35 mmol/L和4.96 mmol/L；同時減輕了應激帶來的肌肉組織氧化損失，使過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量維持在較低水平，分別為6.34 U/L和5.86 mmol/L；卵形鯧鲹適宜的暫養(yǎng)條件為在魚水比魚∶水=1∶20 和（25±1）℃的潔凈海水中暫養(yǎng)6 h。
禁食暫養(yǎng)；卵形鯧鲹；應激；有水?；?；生理響應
卵形鯧鲹（）屬硬骨魚綱、鱸形目鲹科鯧鲹屬，俗名黃臘鯧、金鯧，是我國南方沿海名貴經(jīng)濟魚類之一[1]。近年來，由于育苗和養(yǎng)殖技術的成熟，卵形鯧鲹成為南方沿海深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要魚種。2020年我國卵形鯧鲹養(yǎng)殖產(chǎn)量約為16 ～ 17萬t，產(chǎn)值達200多億元[2]。卵形鯧鲹魚肉細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)價值高、無肌間小刺，深受消費者喜愛[3]。活鮮是卵形鯧鲹銷售的主要形式之一，經(jīng)濟效益較高，而因卵形鯧鲹是暖水性海水魚類，捕撈后應激反應強烈，在低溫（<13 ℃）下容死亡[4]，造成運輸保活困難。因此，研究卵形鯧鲹的?；钸\輸關鍵技術對于解決活鮮銷售問題具有重要意義。
運輸前的暫養(yǎng)是?；钸\輸?shù)年P鍵技術之一。暫養(yǎng)是將魚類從養(yǎng)殖區(qū)捕撈后放入暫養(yǎng)池中停餌養(yǎng)殖一段時間，本質(zhì)是在維持魚類生存環(huán)境條件下實施適度饑餓脅迫[5-7]。適度饑餓脅迫可以調(diào)節(jié)能量代謝和降低氧化應激等提高機體的抗逆能力，同時可以加速魚體內(nèi)代謝物的排泄，減少新陳代謝和耗氧量，減少捕撈導致的應激反應，延長?；顣r間，提高存活率[8]。本研究以卵形鯧鲹為研究對象，研究禁食暫養(yǎng)過程中卵形鯧鲹生理響應的變化，確定卵形鯧鲹?；詈线m的暫養(yǎng)條件，為卵形鯧鲹保活運輸前的準備提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
卵形鯧鲹（），平均體質(zhì)量（500 ± 50）g，體質(zhì)健康，無傷，鱗片完整，購于廣東省湛江市東風水產(chǎn)市場。
1.2 主要試劑與儀器
谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、葡萄糖（Glucose，GLU）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）、總膽固醇（Total cholesterol，T-CHO）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）等檢測試劑盒，南京建成生物科技有限公司；蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒，上海生工生物工程有限公司；皮質(zhì)醇（Cortisol）檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；水質(zhì)總氨氮含量測定試劑，解析科技（深圳）有限公司。
SG68便攜式pH/離子/溶氧多參數(shù)測試儀，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；MD5-100-G低溫恒溫循環(huán)槽，蘇州吉米諾儀器有限公司；PR-100SA數(shù)顯折射計（鹽度計），廣州市愛宕科學儀器有限公司；BJPX-150微生物恒溫培養(yǎng)箱山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；YC109便攜式氨氮測定儀解析科技（深圳）有限公司；Varioskan全自動酶標儀美國ThermoFisher公司；UV-2550紫外可見分光光度計日本島津公司；JIDI-20R高速冷凍離心機廣州吉迪儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 暫養(yǎng)和低溫?；钐幚?將從市場購置運送至實驗室（約40 min）卵形鯧鲹隨機分為4組，每組5條魚，按照魚水比魚∶水=1∶20分別放入水箱中，禁食暫養(yǎng)進行饑餓脅迫，控制暫養(yǎng)溫度（25 ± 1）℃，暫養(yǎng)期間持續(xù)供氧和水循環(huán)，保證暫養(yǎng)海水中溶解氧充足和過濾除去不溶于水的代謝廢物。
在禁食暫養(yǎng)0、6、12、24、48 h后，分別從每組中隨機撈出1條，共4條，放入溫度為（25±1）℃的新鮮海水中進行梯度降溫。梯度降溫程序如下：當水溫高于20 ℃時，以3 ℃/h的速率逐漸降溫；當水溫在16 ～ 20 ℃之間時，以2 ℃/h的速率逐漸降溫；水溫低于16 ℃時，以1 ℃/h的速率逐漸降溫[9]。
降溫結(jié)束魚逐漸進入休眠狀態(tài)，將其轉(zhuǎn)移到（15±0.5）℃?；钏渲斜；睿~水比為魚∶水=1∶10，每4 h觀察1次。實驗重復3次，魚鰓部有呼吸、魚體表面無損傷視為活體，反復刺激無反應或魚體全身充血、呼吸極不規(guī)律視為死亡。記錄每條魚的存活時間，計算每組的平均存活時間。
1.3.2 水質(zhì)測定 在卵形鯧鲹禁食暫養(yǎng)0、6、12、24、48 h時，分別采集暫養(yǎng)水箱的海水，將海水置于50 mL的聚乙烯離心管中，并加蓋密封。用F2手持pH計測海水pH值，用YC109便攜式氨氮測定儀測海水中總氨氮含量，用SG68便攜式離子/溶氧多參數(shù)測試儀測海水中的溶解氧。
1.3.3 代謝指標測定 經(jīng)過1.3.1節(jié)處理?；?2 h的卵形鯧鲹迅速從?；钏渲袚瞥觯诺?50 mg/L的MS-222麻醉液中快速麻醉。用10 mL的注射器從卵形鯧鲹的尾靜脈抽血，去掉針頭將血液注入10 mL的離心管中，全血不加抗凝劑，在4 ℃放置2 h，待血液明顯分層后以5 000 r/min離心20 min，收集魚的血清，置于-80 ℃的冰箱保存[10]。分別用微板法、比色法、酶聯(lián)免疫法測定AST、LDH、皮質(zhì)醇；分別用葡萄糖氧化酶法、脲酶法、分光光度法測定GLU、BUN、T-CHO。
1.3.4 氧化應激指標測定 取卵形鯧鲹背部肌肉，按照肌∶水=1∶9加入生理鹽水，在冰水浴條件下制成質(zhì)量濃度10%的組織勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液用于測定CAT活性和MDA。用過氧化氫酶試劑盒測檢測CAT活性，CAT分解過氧化氫的反應因加入鉬酸銨立即中止，剩下過氧化氫與鉬氨酸作用產(chǎn)生淡黃色絡合物，在405 nm處具有較高吸收能力[11]。用丙二醛試劑盒檢測MDA的含量，過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有較高吸收能力[12]。
1.3.5 數(shù)據(jù)處理 實驗重復3次，試驗結(jié)果用平均值±標準差表示，用JMP軟件進行單因素方差分析和TurkeyHSD多重比較，< 0.05 表示組間差異顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 暫養(yǎng)時間對卵形鯧鲹存活能力的影響
卵形鯧鲹從水產(chǎn)市場運輸至實驗室后未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）直接進行梯度降溫和保活，存活時間為32 h；暫養(yǎng)6 h后再進行梯度降溫和?；?，卵形鯧鲹可以存活38 h，顯著長于未經(jīng)暫養(yǎng)的（0 h）（< 0.05）（圖1）。因為卵形鯧鲹從水產(chǎn)市場運輸至實驗室未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）直接進行梯度降溫和?；?，運輸過程和低溫都會使魚體產(chǎn)生強烈應激，魚體對外界環(huán)境的抵抗力降低，免疫力下降，抗病能力減弱，同時強烈應激也會產(chǎn)生大量代謝廢物使水質(zhì)變差[13]。當卵形鯧鲹暫養(yǎng)時間分別為12、24、48 h時再進行梯度降溫和?；睿浯婊顣r間又變短（< 0.05）。暫養(yǎng)過程是禁食的，會產(chǎn)生饑餓脅迫。適度饑餓脅迫可以調(diào)節(jié)能量代謝和降低氧化應激等提高機體的抗逆能力，同時可以加速魚體內(nèi)代謝物的排泄，減少新陳代謝和耗氧量，減少捕撈導致的應激反應，延長保活時間，提高存活率[8]；但是饑餓脅迫時間長，魚體會加速對自身營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，使后期?；钸^程中營養(yǎng)物質(zhì)供應不足，同時魚體產(chǎn)生代謝廢物也增加，對暫養(yǎng)中的魚體造成氨氮脅迫而再次應激。不同魚類需要暫養(yǎng)的時間是有顯著差異的，這與魚的種類和生活習性有密切關系。珍珠龍膽石斑魚在禁食暫養(yǎng)48 h后進行梯度降溫和保活，其存活時間最長[14]。卵形鯧鲹適宜的禁食暫養(yǎng)時間是6 h。
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
2.2 暫養(yǎng)過程中水質(zhì)的變化
暫養(yǎng)使用海水是經(jīng)過充分曝氣的新鮮海水，新鮮海水的總氨氮含量為零。從圖2可以看出，隨著卵形鯧鲹暫養(yǎng)時間增加，水體的總氨氮含量呈上升趨勢。暫養(yǎng)24 h時，水體中總氨氮含量達到12.8 mg/L，水質(zhì)逐漸變渾濁與微黃；暫養(yǎng)48 h時，水體中總氨氮含量接近20 mg/L，水質(zhì)變黃會對魚體造成脅迫，威脅魚體生命。因為外界環(huán)境總氨氮含量過高，會使魚體血液中的氨氮不能排出，血液中氨氮濃度升高，血液pH值也會升高，多種酶活性受到抑制，同時血液運輸氧能力降低，導致魚類窒息[15]。
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
從圖3可以看出，隨著卵形鯧鲹暫養(yǎng)時間的增加，水體pH值呈上升趨勢，而溶解氧質(zhì)量濃度并無顯著變化（> 0.05）。在暫養(yǎng)過程中水體一直由打氧泵不停供氧，可以使水體中溶氧與魚體消耗氧達到動態(tài)平衡。隨著暫養(yǎng)時間增加，由于魚體代謝排泄氨氮廢物，會使水體pH值有所增加，但是變化范圍較小，仍然在卵形鯧鲹適宜生存的pH值范圍[16]。
2.3 暫養(yǎng)時間對卵形鯧鲹?；钸^程中應激的影響
由圖4可見，暫養(yǎng)0 h的皮質(zhì)醇含量顯著高于（< 0.05）其它暫養(yǎng)組；當暫養(yǎng)6 h時，魚體血液中皮質(zhì)醇含量顯著降低（< 0.05）；暫養(yǎng)時間12 h，血液皮質(zhì)醇含量又顯著升高（< 0.05）。皮質(zhì)醇（Cortisol）被作為應激反應的敏感指標，可以反映魚類應激的強弱，當魚類受到應激后，下丘腦一垂體一腎間組織軸會迅速作用促進促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，從而導致頭腎細胞皮質(zhì)醇激素的合成與釋放[17]。卵形鯧鲹從市場購置運送到實驗室經(jīng)過短途運輸，魚體受到運輸應激導致血液中皮質(zhì)醇含量增加。經(jīng)過6 h暫養(yǎng)，短途運輸帶來的應激已經(jīng)消除，魚體血液中皮質(zhì)醇含量降低；暫養(yǎng)12 h血液皮質(zhì)醇含量升高，水體中氨氮含量增加使水質(zhì)變差，氨氮脅迫也會使魚體產(chǎn)生應激[18]。暫養(yǎng)24 h時，血液皮質(zhì)醇含量又顯著降低（< 0.05），這是由于暫養(yǎng)時間較長，魚體自我調(diào)節(jié)能力使之逐漸適應水體環(huán)境。
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
由圖5可見，卵形鯧鲹不經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）時，血糖含量處于比較高的水平，即短暫的“高血糖”癥狀。這是因為血糖（GLU）也是反映魚體應激的指標之一。當魚體發(fā)生因為短途運輸產(chǎn)生應激反應時，生命活動變得劇烈，新陳代謝旺盛會使魚體血糖濃度上升[19]。當卵形鯧鲹暫養(yǎng)6 ～ 12 h之后，血糖含量顯著下降（< 0.05），這說明禁食暫養(yǎng)（饑餓脅迫）可以有效降低捕撈運輸帶來的應激效應；再延長暫養(yǎng)時間（24 ～ 48 h），血糖含量還會持續(xù)下降（< 0.05），這可能是因為魚體禁食而沒有能量來源，魚體需不斷消耗能量以維持自身的生命活動，則魚體內(nèi)的血糖就會被分解用以能量的供給[20]。
2.4 禁食暫養(yǎng)時間對卵形鯧鲹保活過程中物質(zhì)代謝影響
從表1可見，未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）卵形鯧鲹的LDH活性處于較高水平，顯著高于暫養(yǎng)6、12和24 h的（< 0.05）。乳酸脫氫酶（LDH）能夠催化丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化，是糖代謝酵解途徑的關鍵酶之一，當魚體受到外界環(huán)境脅迫時會引起LDH活性升高[21]。本研究中，從市場購置的卵形鯧鲹運到實驗室，短途運輸使魚體產(chǎn)生應激而使LDH活性升高，促進糖的代謝；經(jīng)過禁食暫養(yǎng)6、12和24 h，魚體應激逐漸消除，LDH活性也逐漸恢復。卵形鯧鲹暫養(yǎng)48 h時LDH活性又顯著升高（< 0.05），這是由于禁食暫養(yǎng)時間延長，魚體產(chǎn)生代謝廢物使水體中總氨氮含量升高，氨氮和饑餓脅迫都會使魚體受到外界環(huán)境變差而使LDH活性增加[18, 22]。
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
正常情況下，血液中AST的活性較低且穩(wěn)定，當魚體受到脅迫或者肝臟受到損傷時，AST活性升高[23]。從表1可以看出，卵形鯧鲹暫養(yǎng)6 h和12 h時AST活性顯著低于其他暫養(yǎng)組（< 0.05），這也說明適度禁食暫養(yǎng)（饑餓脅迫）可以減少魚體應激。未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）卵形鯧鲹的AST活性較高，是因為受到短途運輸帶來的應激所造成。暫養(yǎng)24 h和48 h卵形鯧鲹的AST活性較高，是因為受到氨氮脅迫和饑餓脅迫帶來的應激，甚至使魚體肝臟受損。尤宏爭等[22]也發(fā)現(xiàn)珍珠龍膽石斑魚（♀×♂）經(jīng)30 min的運輸脅迫后AST活性顯著上升（< 0.05），暫養(yǎng)一段時間后AST活性又恢復至運輸前水平。
從表1可以看出，隨著暫養(yǎng)時間增加，卵形鯧鲹血液的BUN含量顯著升高（< 0.05）。與未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）的相比，暫養(yǎng)48 h后卵形鯧鲹血液的BUN含量增加了4倍。這可能是因為尿素氮（BUN）是蛋白質(zhì)代謝終產(chǎn)物，是反映腎功能代謝的重要指標，未經(jīng)暫養(yǎng)的卵形鯧鲹僅受短途運輸應激，對腎臟影響較小，代謝的BUN可以及時排出體外；隨著暫養(yǎng)時間延長，受到水體氨氮和饑餓的雙重脅迫，魚體腎臟可能受到損傷，魚體代謝廢物積累不能及時排出體外，使血液中BUN含量增加[24]。
從表1可以看出，隨暫養(yǎng)時間增加，卵形鯧鲹血液總膽固醇含量逐漸上升（< 0.05）。由于暫養(yǎng)過程是禁食的，卵形鯧鲹在暫養(yǎng)早期以消耗糖原供能為主，隨著暫養(yǎng)時間延長，體內(nèi)糖原含量顯著下降，不能滿足魚體代謝能量需要，逐漸消耗脂肪維持生命活動而生產(chǎn)膽固醇。且糖異生作用因為長時間禁食而加強，使血清中起運輸功能的膽固醇也會明顯增多[25]。
表1 暫養(yǎng)過程中卵形鯧鲹物質(zhì)代謝的變化
注：同列的不同小寫字母表示差異顯著（< 0.05）
Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant difference（< 0.05）
2.5 暫養(yǎng)時間對卵形鯧鲹氧化應激的影響
從圖6和圖7可以看出，暫養(yǎng)時間對卵形鯧鲹的CAT活性和MDA含量（氧化應激指標）均有顯著影響（< 0.05）。未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）卵形鯧鲹的CAT活性和MDA含量均處于較高水平，因為卵形鯧鲹經(jīng)過捕撈操作和短距離運輸產(chǎn)生應激，使其受到了氧化損傷[26-27]。肌肉組織中的CAT活性和MDA含量顯著下降（< 0.05）；與未經(jīng)暫養(yǎng)（0 h）的相比，卵形鯧鲹暫養(yǎng)6 h后CAT活性下降了24.0％、MDA含量下降了21.0％，說明適度的禁食暫養(yǎng)（饑餓脅迫）可以減少應激帶來的氧化損傷。隨著暫養(yǎng)時間延長，卵形鯧鲹肌肉組織中的CAT活性和MDA含量又有所升高（< 0.05），同樣是因為受到水體氨氮和饑餓的雙重脅迫，魚體再次受到氧化損傷。
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
標注不同字母表示差異顯著（P < 0.05）
3 結(jié)論
研究禁食暫養(yǎng)對卵形鯧鲹有水?；钌眄憫挠绊懀_定了適宜的暫養(yǎng)時間，結(jié)論如下：1）禁食暫養(yǎng)過程中水體總氨氮含量與pH值顯著上升，溶解氧含量無顯著變化；2）禁食暫養(yǎng)6 h可以降低或減少卵形鯧鲹的應激，使血液中LDH和AST活性以及皮質(zhì)醇、GLU、BUN和T-CHO含量處于較低水平，同時減輕應激帶來的肌肉組織氧化損失，使CAT活性和MDA含量維持在較低水平；3）當暫養(yǎng)條件為（25±1）℃、魚水比魚∶水=1∶20的潔凈海水中暫養(yǎng)時，暫養(yǎng)6 h最為合適。
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Effects of Fasting Acclimation on the Physiological Response to Water Preservation of
ZHANG Kun2, ZHOU Jie-qian1,2, FAN Xiu-ping1,2,3, WEI Shuai1,2,3, SUN Qin-xiu1,2,3, XIA Qiu-yu1,2,3, LIU Shu-cheng1,2,3
（1.,524025,; 2.,////////,524088,; 3.,,116034,）
【Objectives】To explore the effect of fasting acclimation on the physiological response to water preservation of golden pompano,in order to lay down the foundation for the preservation and transportation of golden pompano.【Methods】By measuring the changes of total ammonia nitrogen and pH value of the water body, the blood physiological and biochemical indexes of golden pompano, and the oxidative stress index of muscle during the fasting acclimation process. The fasting acclimation conditions of golden pompano were analyzed and determined.【Results and Conclusions】The results showed that during the fasting acclimation, with the extension of fasting acclimation time, the total ammonia nitrogen content and pH value of the water body increased significantly. When the fasting acclimation time was 6 h, the total ammonia nitrogen content was 3.22 mg/L and the pH value was 7.80, the fasting acclimation for 6 hours can reduce or reduce the stress of the golden pompano, make the blood lactate dehydrogenase (LDH) and aspartate aminotransferase (AST) activity and the content of cortisol, blood sugar (GLU), blood urine nitrogen (BUN) and total cholesterol (T-CHO) at a lower level,Its activity and content are 2785.53 U/L, 19.04 U/L, 158.72 ng/mL, 2.98 mmol/L, 4.35 mmol/L and 4.96 mmol/L, respectively; at the same time, it reduces the oxidative loss of muscle tissue caused by stress, so that catalase (CAT) activity and malondialdehyde (MDA) content are maintained at a low level, Its activity and content are 6.34 U/L and 5.86 mmol/L; the suitable fasting acclimation conditions for golden pompano are the fish-water ratio offishtowater1∶20 and (25 ± 1) ℃ of clean seawater for 6 hours.
fasting acclimation;; stress; keeping alive with water; physiological response
Q981.1
A
1673-9159（2022）01-0044-06
10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.007
張坤，周結(jié)倩，范秀萍，等. 禁食暫養(yǎng)對卵形鯧鲹有水?；钌眄憫挠绊慬J]. 廣東海洋大學學報，2022，42（1）：44-49.
2021-09-08
南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江）資助（ZJW-2019-06）；廣東普通高等學校海洋食品綠色加工技術研究團隊（2019KCXTD011）
張 坤（1996－），男，碩士研究生，研究方向為海洋食品加工新技術。E-mail：2546381595@qq.com
范秀萍（1979－），女，副教授，研究方向為魚類?；钸\輸。E-mail：fanxp08@163.com
劉書成（1977－），男，教授，研究方向為海洋食品加工新技術。E-mail：Lsc771017@163.com
（責任編輯：劉嶺）
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