宋 聰，汪大圓，沈明武，史向陽

(東華大學 化學化工與生物工程學院, 上海 201620)

1 前言

樹狀大分子，特別是被人們譽為“人工蛋白”的聚酰胺-胺[poly(amidoamine)，PAMAM]樹狀大分子，自20世紀80年代面世以來，其理化性質和生物醫(yī)學應用得到了廣泛的探索和蓬勃的發(fā)展[1]。樹狀大分子是一類具有單分散特性以及高度分支三維結構的納米尺度的合成大分子[2]，因其分子結構猶如樹枝狀而得名。與傳統(tǒng)的線性聚合物相比，樹狀大分子具有穩(wěn)定的結構、豐富的內部空腔、優(yōu)異的水溶性以及易功能化和非免疫原性等特點[3]。在被功能化分子修飾或用于藥物包封后，樹狀大分子已成為納米醫(yī)學領域的最佳選擇之一，被廣泛應用于生物成像[4-5]、基因/藥物治療[6-10]、聯(lián)合治療[11-12]以及診療一體化[13-15]等。

隨著研究的不斷深入，研究者們已陸續(xù)揭示出單代樹狀大分子在納米醫(yī)學領域存在的一些局限性。一般來說，低代樹狀大分子(如第3代(G3)PAMAM 樹狀大分子)雖然合成簡單，成本較低，但有限的載藥能力和較低的基因轉染效率在一定程度上限制了其在納米醫(yī)學中的應用[16-17]，而高代樹狀大分子(超過第5代)雖然擁有更大的分子尺寸、更好的基因轉染效率[17-19]、更強的滲透性[20-22]以及更高的載藥量[10]，但合成步驟繁瑣，純化困難，成本昂貴，納米醫(yī)學應用也受到一定的限制。此外，單代樹狀大分子的尺寸較小，如G8 PAMAM的尺寸仍小于10 nm,而常應用于癌癥醫(yī)學領域的G5 PAMAM樹狀大分子尺寸只有5.4 nm，限制了其基于實體瘤的高通透性和滯留效應的被動靶向功能。另外，除以胱胺為核的PAMAM樹狀大分子具有氧化還原響應特性外[14]，單代樹狀大分子幾乎不顯示對外場的刺激響應性，從而限制了它們在與腫瘤微環(huán)境反應性遞送有關的生物醫(yī)學應用。更重要的是，高代樹狀大分子的載藥量也會因其內部空腔的體積有限而無法與膠束、凝膠、脂質體等制劑的載藥量相比[23]。因此，要想使樹狀大分子更好地應用于生物醫(yī)學，研究者們必須獨辟蹊徑以克服這些局限性。

為了克服單代樹狀大分子的應用局限，使用兩個或多個樹狀大分子作為反應模塊，通過不同類型的相互作用或驅動力構建結構穩(wěn)定的超結構樹狀大分子納米體系(superstructured dendrimeric nanoconstructs, SDNs)，以代替單代樹狀大分子，是可行途徑之一[23]。與高代樹狀大分子的合成相比，SDNs具有結構精確且可控的特性，且更容易制備。SDNs通?？筛鶕?jù)產品結構或合成策略被分為5類，分別是核殼結構樹狀大分子(core-shell tecto dendrimers, CSTDs)[24-26]、“啞鈴型”樹狀大分子[27-29]、樹狀大分子納米團簇[30-31]、樹狀大分子納米凝膠[32-33]以及基于樹狀大分子的雜化納米團簇[34-35]。其中，通過簡單方法合成的以相對高代樹狀大分子為核、低代樹狀大分子為殼的CSTDs不僅具有與高代樹狀大分子相似的優(yōu)異特性，如豐富的末端官能團、疏水的內部結構、高水溶性等，還能夠克服單代樹狀大分子的應用局限。本文基于這一領域的大量文獻，對CSTDs的合成策略及其納米醫(yī)學應用做綜合評述，其中，為清晰起見，表1列出了基于各類樹狀大分子合成的CSTDs及其相關生物醫(yī)學應用。同時，結合納米技術的發(fā)展現(xiàn)狀，分析了CSTDs在生物醫(yī)學應用中的挑戰(zhàn)和未來前景。

表1 CSTDs的合成策略及其生物醫(yī)學應用總結Table 1 Summary of the synthesis and applications of CSTDs

2 CSTDs的合成

以樹狀大分子為反應模塊合成CSTDs的方法主要有兩種，一是高代樹狀大分子和低代樹狀大分子末端基團之間發(fā)生化學反應，原位產生共價鍵而合成CSTDs；另一種是分別在高、低代樹狀大分子表面修飾主、客體分子，進而利用主客體識別的方法進行超分子組裝，合成CSTDs。

2.1 共價鍵合成法

合成步驟繁瑣、純化難度高是高代樹狀大分子合成過程中難以克服的困境。為解決這些問題，Tomalia研究組率先通過原位共價鍵法合成并命名了CSTDs[36-37]。該方法主要是將帶有氨基(-NH2)末端的PAMAM樹狀大分子和過量的帶有羧基(-COOH)末端的PAMAM樹狀大分子混合在氯化鋰(LiCl)水溶液中，破壞兩種樹狀大分子之間的強靜電相互作用，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)以活化羧基基團，從而通過偶聯(lián)反應原位形成酰胺鍵，得到以氨基端樹狀大分子為核、以羧基端樹狀大分子為殼的CSTDs(圖1a)[24, 38]。值得注意的是，如果反應過程中不添加LiCl，將有可能因為核殼組分之間的強電荷作用得到質量分布廣泛、不均一的核殼聚集體。因此，為了獲得單分散的產物，樹狀大分子核、殼組分多在室溫下與適量LiCl(約0.5 wt.%)水溶液中混合進行核-殼反應形成CSTDs。在這種合成方法中，研究者們得到的是具有飽和殼組分的CSTDs，其結構尺寸及理化性能均可與更高代的樹狀大分子相媲美[37]。以形成的G5/G3 CSTDs為例[24]，每個核組分G5.NH2周圍平均被10個G3.COOH殼組分所包圍，而且通過原子力顯微鏡(AFM)成像、梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳、尺寸排阻色譜等實驗結果表明，單個G5/G3 CSTDs的尺寸和分子量大小介于G7 PAMAM與G8 PAMAM樹狀大分子之間。更重要的是，G5/G3 CSTDs是由一步法合成的，方法簡單且產率高達90%，殼層組分飽和度高達75%～83%；而如果通過傳統(tǒng)的發(fā)散法由G5 PAMAM樹狀大分子反應生成G8 PAMAM樹狀大分子，則至少需要6個反應步驟。此外，Schilrreff等人[39]也利用同樣的共價鍵法進行了飽和殼型G5/G2.5 CSTDs的合成。研究結果表明，每個核組分G5.NH2周圍被9～10個G2.5.COOH殼組分所包圍，殼層組分飽和度達60%-67%，而且獲得的G5/G2.5 CSTDs 的水動力尺寸接近G6.5 樹狀大分子。

除利用共價鍵方法合成飽和殼型CSTDs外，Tomalia研究組在2000年還報道合成了以氨基封端的PAMAM樹狀大分子為核、以親電性甲基酯封端的PAMAM樹狀大分子為殼的部分殼填充型CSTDs[36]。通常，部分殼填充型CSTDs是由過量的殼組分樹狀大分子與少量的核組分樹狀大分子在密封管中混合，并于40 ℃條件下加熱25 d直接發(fā)生共價反應后所得(圖1b)。與飽和殼型CSTDs的合成相比，部分殼填充型CSTDs在合成時直接在核和殼之間形成隨機共價鍵，直到所有可接觸的核組分表面空間被填滿。由于核、殼組分之間共價結合是隨機的、無序的，所以核組分的表面區(qū)域始終無法被殼組分樹狀大分子完全填充。與理論上的殼組分飽和度計算值相比，實際上每個CSTDs殼層組分飽和度為40%～66%。近年來，Studzian等人[40]也利用同樣的一步法進行了部分殼填充型G5/G2.5 CSTDs的合成。為了能夠方便應用于生物醫(yī)學，部分殼填充型G5/G2.5 CSTDs的酯表面被tris(2-aminoethyl) amine (TREN)修飾而生成了G5/G3-(TREN) CSTDs。

一般來說，通過原位共價鍵法合成的CSTDs具有一定的缺陷。比如，由于聚集和沉淀相關技術問題的存在，飽和殼型CSTDs必須在LiCl存在的條件下才能合成，而且在相同的反應條件下，如果使用以羧基封端的PAMAM樹狀大分子為核，以過量的氨基封端樹狀大分子為殼，則無法獲得飽和殼型CSTDs[37]；而部分殼填充型CSTDs的合成過程反應性較差，很難得到有序控制[36]。在過去的20年里，盡管研究人員試圖控制CSTDs的合成穩(wěn)定性并努力將其應用于生物醫(yī)學領域，但研究似乎停滯不前。在納米材料飛速發(fā)展的今天，越來越多的實驗證據(jù)顯示，表面具有氨基基團的納米材料(特別是樹狀大分子)更能廣泛應用于納米醫(yī)學，特別是癌癥診療領域。

2.2 超分子主客體識別合成法

近年來，超分子主客體系統(tǒng)被陸續(xù)開發(fā)，為氨基封端CSTDs的合成及其生物醫(yī)學應用帶來了巨大的變革[41]。有研究表明， β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin, β-CD)和金剛烷(adamantane, Ad)之間強烈的超分子主客體識別作用已被廣泛用于構建超分子自組裝納米體系，而且構建的β-CD/Ad超分子系統(tǒng)自身具有非免疫原性和良好的生物相容性[41-43]?；诖耍覀冋n題組利用β-CD和Ad之間的主客體識別作用自組裝合成了氨基封端的CSTDs[25-26, 44]。如圖2所示，首先分別合成Ad修飾的G3.NH2(G3-Ad)和β-CD修飾的G5.NH2(G5-CD)，然后通過β-CD和Ad之間的超分子識別作用，合成了以G5為核、G3為殼的CSTDs。與共價鍵法合成的飽和型CSTDs相比，主客體識別法合成的CSTDs中每個核組分G5-CD周圍最多可被12個G3-Ad殼組分所包圍，在二維核磁共振氫譜(2D NOESY)的3.5～4.0 ppm和1.5～1.7 ppm處能明顯觀察出相關質子交叉信號，說明了β-CD和Ad基團之間存在強主-客體相互作用。同時，AFM成像也確定了G5-CD/Ad-G3 CSTDs具有單分散性良好的球型形態(tài)，測得的高度約為9 nm左右，高于單獨的G3-Ad(3 nm)和 G5-CD (5 nm)，這也從側面說明了CSTDs已通過超分子主-客體組裝成功合成。

圖1 飽和殼型CSTDs(a)和部分殼填充型CSTDs(b)的合成[16]Fig 1 Synthesis of the saturated shell CSTDs(a) and partial shell-filled CSTDs(b)[16]

雖然β-CD/Ad超分子系統(tǒng)成功構建出的氨基封端CSTDs已經能夠更好地應用于生物醫(yī)學領域，但是β-CD/Ad超分子系統(tǒng)不具有響應性特征，難以利用腫瘤微環(huán)境(如腫瘤微環(huán)境多呈弱酸性)對癌癥進行更好的診斷或治療。為進一步擴大CSTDs的應用范疇，本課題組選用β-CD/苯并咪唑(BM)超分子系統(tǒng)構建了CSTDs[45]。該超分子主客體系統(tǒng)除具有高效的主客體識別作用外，還具有pH響應性，即在pH=7.4的生理條件下，BM可通過主客體識別作用進入β-CD的空腔，合成BM/β-CD主客體納米體系；而在pH<6的微酸性條件下，BM由于質子化會從β-CD的空腔中脫離。因此，根據(jù)β-CD/BM的優(yōu)勢，合成的G5-CD/BM-G3 CSTDs載藥后，會在酸性條件下分解CSTDs為單獨的樹狀大分子，進而加速藥物的釋放，從而有望利用腫瘤弱酸環(huán)境增強癌癥治療效果。

3 CSTDs的生物醫(yī)學應用

CSTDs作為一種既能保持樹狀大分子優(yōu)良特性又能克服樹狀大分子合成和應用局限的納米材料，近年來被越來越多地應用于生物醫(yī)學研究，特別是癌癥診療領域，包括生物學成像[46-47]、化療[45, 48]、基因遞送[25, 49]及聯(lián)合治療[50]等。

3.1 生物學成像

生物學成像是在分子或細胞水平上觀測生物過程的關鍵?；诩{米平臺的生物成像已成為腫瘤或疾病診斷不可或缺的技術之一[51]。CSTDs經過熒光染料或其他成像試劑修飾后，可用于不同目的的生物學成像[44, 46]。例如，共價鍵法合成的G5/G2.5 CSTDs 可用異硫氰酸熒光素(FITC)染料進行熒光標記，從而可通過熒光顯微鏡觀察FITC-G5/G2.5 CSTDs被各種膠質細胞吞噬的能力和時間依賴性變化[47]。通過體外熒光成像結果分析，膠質細胞對FITC-G5/G2.5 CSTDs的攝取在6 h后達到了最高，而膠質細胞對用FITC標記的G6.5樹狀大分子的吞噬則在1 h就達到了攝取瓶頸，說明與單代樹狀大分子相比，G5/G2.5 CSTDs能夠促進細胞對材料的攝取。此外，Studzian等人[40]研究了哺乳動物細胞對G5/G3-(TREN) CSTDs的攝取，研究結果表明，G5/G3-(TREN) CSTDs易于進入細胞，并表現(xiàn)出獨特的無毒陽離子特性和強烈的非傳統(tǒng)固有熒光發(fā)射特性，適用于直接生物成像。

圖2 G5-CD/Ad-G3 CSTDs的合成[44]Fig 2 Synthesis of G5-CD/Ad-G3 CSTDs[44]

除熒光成像外，氨基封端的CSTDs經修飾后也可以用于其他方面的生物學成像。有研究表明，更高分子量的高代樹狀大分子負載的釓(Gd)螯合物縱向弛豫率(r1)和磁共振(magnetic resonance, MR)成像靈敏度更高[51-53]。基于此，我們課題組設計了螯合釓離子的 CSTDs 納米平臺，并探索了其基于尺寸或分子量的因素下在腫瘤微環(huán)境中的通透性及改善腫瘤MR成像的能力[44]。首先，合成G5.NH2-CD/Ad-G3.NH2CSTDs，并在此基礎上與四氮雜環(huán)十二烷四乙酸 (DOTA)-Gd(Ⅲ)螯合劑共軛并進一步乙?；?，得到產物CSTD.NHAc-DOTA(Gd)復合物。同時，利用相同方法合成G5.NHAc-DOTA(Gd)復合物。研究結果表明，與 G5.NHAc-DOTA(Gd)復合物相比，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)復合物具有更高分子量和體積，因而具有更長的旋轉相關時間，測得r1為7.34 mM-1s-1，是G5.NHAc-DOTA(Gd)弛豫率(4.92 mM-1s-1)的1.5 倍，也是臨床釓劑Magnevist弛豫率(4.56 mM-1s-1)的1.6倍。更重要的是，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)復合物在體外3D細胞球熒光成像實驗中呈現(xiàn)出比G5.NHAc-DOTA(Gd) 復合物更好的滲透性(EPR效應)。在體內MR成像實驗中，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)復合物也顯示出更好的腫瘤MR成像能力(圖3)，也就是說，與G5.NHAc-DOTA(Gd) 復合物相比，開發(fā)的CSTD.NHAc-DOTA(Gd)復合物擁有腫瘤EPR和弛豫率雙重增強的T1加權MR成像能力。

此外，CSTDs經過功能化修飾后，不僅具有抗蛋白吸附功能，還可以用于靶向腫瘤的雙模態(tài)成像[26, 54]。例如，先在G5-CD內部包裹金納米顆粒，然后利用CD/Ad的主客體識別作用構建包裹金納米顆粒的核-殼結構樹狀大分子(Au CSTDs)。以Au CSTDs為納米平臺，在其氨基表面依次修飾RGD肽、Gd螯合劑(DTPA-Gd)以及兩性離子1,3-丙磺酸內酯(1,3-PS)，得到多功能RGD-Gd@Au CSTD-PS納米探針。研究表明，該探針不僅具有抗蛋白吸附性能，還具有特異性靶向乳腺癌細胞(表面αvβ3整合素過表達)的能力，并且可作為CT/MR雙模態(tài)成像造影劑應用于乳腺癌腫瘤模型的雙模態(tài)成像，達到腫瘤精準診斷的目的[54]。

圖3 在4T1皮下瘤模型中瘤周注射CSTD.NHAc-DOTA(Gd)(a)或G5.NHAc-DOTA(Gd)(b)前后不同時間點的體內MR成像圖和信噪比(SNR)統(tǒng)計圖(c)。白色箭頭指向腫瘤部位；注射的材料均溶解在PBS中，[Gd]=5 mmol/L，用量100 μL/每只[44]

3.2 化療

延長血液循環(huán)時間，減少對正常組織的毒副作用，提高抗癌藥物的治療效果，是開發(fā)藥物遞送系統(tǒng)的初衷，也是化療的關鍵[10]。與單代樹狀大分子相比，CSTDs因具有更大的內部空腔結構、分子尺寸以及更豐富的表面基團而顯示出更高的載藥效率和巨大的藥物遞送應用潛力。早在2012年，Schilrreff等人[39]發(fā)現(xiàn)共價鍵法合成的G5/G2.5 CSTDs對黑色素瘤細胞有選擇性的細胞毒性，卻在體外不會損害健康的角質形成細胞。為了增強腫瘤細胞殺傷效果，他們進一步將6個甲氨蝶呤(MTX)藥物分子和31個唑來膦酸(ZOL)分子分別裝載在G5.NH2的疏水空腔內部，然后再通過共價鍵法連接G2.5.COOH殼層[48]。合成的CSTDs載藥體系對癌細胞殺傷效果明顯高于單獨藥物或單獨CSTDs，而且在一定的MTX濃度下(如50 μmol/L)，合成的CSTDs載藥體系可以在不損傷角質形成細胞的前提下顯著抑制Sk-Mel-28細胞的生長。

在基于主客體自組裝合成的CSTDs應用于藥物輸送和癌癥化療方面，我們發(fā)現(xiàn)具有pH 響應性的乙?；鵊5.NHAc-CD/BM-G3.NHAc CSTDs 可用于抗癌藥物阿霉素(DOX)的遞送。在這項研究中[51]，每個G5.NHAc-CD/BM-G3.NHAc CSTD平均可負載9.2個DOX分子，載藥效率達82.76%；更重要的是，所形成的CSTD/DOX復合物可被癌細胞吞噬并在酸性條件下解離形成單代樹狀大分子，從而達到酸響應條件下DOX快速釋放的目的。我們還通過 3D 細胞球實驗體外評估了CSTDs/DOX復合物的藥物滲透能力和腫瘤治療效果。與pH不敏感的CSTD/DOX(即 G5.NHAc-CD/Ad-G3.NHAc/DOX)復合物相比，pH敏感的CSTD/DOX復合物表現(xiàn)出相對較強的腫瘤滲透能力(圖4a～b)和腫瘤生長抑制能力(圖4c～d)。

3.3 基因遞送和聯(lián)合治療

帶正電荷的樹狀大分子常通過靜電壓縮作用與核酸形成復合物，從而實現(xiàn)高效的基因遞送。因此，氨基封端的CSTDs也可被用作基因遞送載體。例如，Chen等[25]將G5-CD/Ad-G3 CSTDs作為納米載體通過靜電壓縮作用遞送質粒DNA(pDNA)。結果表明，所構建的G5-CD/Ad-G3 CSTDs對編碼熒光素酶(luciferase，Luc)質粒DNA(pDNA)的轉染效率分別是單獨G3-Ad和G5-CD轉染效率的170倍和20倍，原因可能是由于分子體積的增大和電荷/質量比的降低，使得pDNA能夠被有效地壓縮以增強基因遞送。在最近的一項研究中，Wang等[49]構建了具有不同剛性內核的兩種氨基封端的CSTDs，以探索分子剛性對基因遞送效率的影響。在這項研究中，一方面以具有剛性分子骨架、表面為醛基的含磷第2.5代(P-G2.5)樹狀大分子為核，以表面為氨基的G3 PAMAM樹狀大分子為殼，通過化學鍵合法形成P-G2.5/G3 CSTDs；另一方面以Ad修飾的G3(G3-Ad)為殼和β-CD修飾的G3 (G3-CD)為核，通過超分子主客體自組裝合成具有柔性內核的G3-CD/Ad-G3 CSTDs。這兩種CSTDs表面基團均為氨基，可以用來壓縮質粒DNA (pDNA) 形成載體/基因復合物。研究結果表明，具有剛性內核的P-G2.5/G3 CSTDs顯示出更好的基因壓縮能力和更強的細胞攝取。更重要的是，P-G2.5/G3 CSTDs對編碼增強型綠色熒光蛋白(EGFP)和Luc pDNA 的轉染效率分別是G3-CD/Ad-G3 CSTDs轉染效率的1.7倍和4.1倍。

圖4 用G5.NHAc-CD/BM-G3.NHAc/DOX、G5.NHAc-CD/Ad-G3.NHAc/DOX 或 free DOX孵育HeLa 3D細胞球不同時間后的細胞球熒光成像圖(a)及其熒光強度分布統(tǒng)計圖(b)，其中，比例尺為100 μm；用PBS、G5.NHAc-CD/BM-G3.NHAc/DOX、G5.NHAc-CD/Ad-G3.NHAc/DOX或 free DOX孵育HeLa 3D細胞球不同時間后的細胞球治療圖(c)及其直徑變化統(tǒng)計圖(d),其中，比例尺為100 μm[51]

CSTDs也被用于功能性基因和抗癌藥物的胞內共傳遞，即將CSTDs作為載體，物理包裹抗癌藥物DOX，并通過靜電壓縮miR-21抑制劑(miR-21i)，用于體外三陰性乳腺癌細胞(MDA-MB-231)的化療/基因治療的聯(lián)合治療[50]。在這項研究中，首先對G5-CD/Ad-G3 CSTDs在MDA-MB-231細胞中的功能性基因轉染能力進行了探索。結果顯示，當?shù)妆葹?0時，CSTDs轉染miR-21i的效果最佳，而且G5-CD/Ad-G3/miR-21i復合物(N/P=10)能夠顯著抑制癌細胞的遷移(圖5a～b)，顯著調節(jié)相關靶基因、凋亡基因的表達(圖5c～d)。如果在G5-CD/Ad-G3 CSTDs中負載了DOX，然后在N/P=10的條件下進行miR-21i的壓縮，即可實現(xiàn)基因和藥物的共遞送，得到了比僅負載藥物的CSTDs/DOX復合物更好的體外癌細胞殺傷效果。

圖5 用CSTDs/miR-21i復合物轉染MDA-MB-231 細胞0、12、24 和 48 h后的刮傷愈合試驗圖(a)和遷移區(qū)域統(tǒng)計圖(b)；用PBS、miR-21i或 CSTDs/miR-21i轉染細胞后蛋白質定量分析圖(c)及其印跡圖(d)。1代表對照組；2代表miR-21i組；3代表CSTDs/miR-21i 復合物組[50]

4 結論

CSTDs主要是通過共價鍵形成和超分子自組裝這兩種方式合成。與單代的樹狀大分子相比，CSTDs不但擁有更高的分子量和更大的內部空腔，電荷/質量比降低，而且還可實現(xiàn)環(huán)境響應性，對于探索或擴大CSTDs的生物醫(yī)學應用具有重要意義。近年來，基于CSTDs的納米平臺已被應用于生物醫(yī)學領域，特別是熒光成像、MR成像、雙模態(tài)成像以及基因遞送、化療或是化療/基因治療的聯(lián)合治療等。雖然CSTDs的合成和生物醫(yī)學應用已初見成效，但仍有待更多的研究。一方面，應開發(fā)更多反應類型或組裝策略以合成多樣的CSTDs；另一方面，可基于CSTDs自身性質，結合不同的治療/成像元素，擴展CSTDs在納米醫(yī)學領域的應用。總之，CSTDs的合成方法及其在分子成像、靶向藥物傳遞、腫瘤診療或其他疾病診療方面的應用研究極具廣闊的應用前景，是一個值得探索的開放式研究領域。