黃萍萍，葛 莉*，繆海燕，于紅虹，吳冬梅，賴玉婷，江心泳，王冠東，陳 凡

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院,福建 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期最常見(jiàn)的代謝紊亂。2019 年數(shù)據(jù)顯示，全球約有15.8%的孕婦存在不同程度的高血糖，其中GDM 占83.6%[1]。持續(xù)增長(zhǎng)的GDM 患病率對(duì)世界公共衛(wèi)生問(wèn)題構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，不僅對(duì)孕產(chǎn)婦與子代的近遠(yuǎn)期健康具有潛在的影響[2-4]，還給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。由于GDM 篩查診斷主要在妊娠中晚期，使得早期防護(hù)缺乏針對(duì)性，一旦確診則干預(yù)治療的時(shí)間有限[6]，且目前尚未篩選出公認(rèn)具有臨床價(jià)值的生物標(biāo)志物。因此，獲知GDM 的發(fā)病機(jī)制，尋求靈敏度高、特異性強(qiáng)的生物標(biāo)志物用于早期篩查已經(jīng)成為產(chǎn)科領(lǐng)域研究的一個(gè)重點(diǎn)。已知GDM 是胎盤起源的疾病，本課題組前期通過(guò)同位素標(biāo)記的相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)的定量蛋白組學(xué)結(jié)合平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(parallel reaction monitoring，PRM)技術(shù)篩選與驗(yàn)證出外血小板溶素1(epiplakin，EPPK1)、冷誘導(dǎo)RNA 結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRBP)、不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，HNRNPA2B1)、不均一核糖核蛋白AB(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B，HNRNPAB)、不均一核糖核蛋白L(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，HNRNPL)、RAS 癌基因家族成員RAB21(ras-related protein Rab-21，RAB21)、RAS癌基因家族成員RAB3B(ras-related protein Rab-3b，RAB3B)7 個(gè)蛋白在GDM 組胎盤組織中表達(dá)顯著上調(diào)。由于胎盤蛋白與GDM 的發(fā)生發(fā)展緊密聯(lián)系[7-8]，妊娠期間母體外周血循環(huán)中存在與胎盤相關(guān)和(或)胎盤組織釋放入血的蛋白[9]，且關(guān)于胎盤蛋白的GDM 早期篩查指標(biāo)的研究處于起步階段。因此，本研究通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)這7 個(gè)胎盤蛋白是否在孕婦外周血清中有表達(dá)且是否與在胎盤中的表達(dá)趨勢(shì)一致，從而篩選出候選生物標(biāo)志物，為后續(xù)臨床縱向隊(duì)列驗(yàn)證和生物標(biāo)志物開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019 年7 月—2019 年10 月在福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院產(chǎn)科門診常規(guī)產(chǎn)檢及住院分娩的GDM 孕婦30 例為病例組(GDM 組)，同期選取年齡、孕周等指標(biāo)與GDM 組相匹配的正常糖耐量孕婦30 例為對(duì)照組。本研究通過(guò)福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：2018-KL024-02），并且所有的研究對(duì)象均簽署紙質(zhì)版知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合GDM 診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]的妊娠37～42 周的孕婦；②無(wú)其他妊娠合并癥；③經(jīng)產(chǎn)婦既往無(wú)GDM 病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕前有高血壓、先天性心臟病及肝腎功能不全病史；②合并多囊卵巢綜合征及垂體、腎上腺及甲狀腺等功能異常的內(nèi)分泌疾??；③多胎妊娠、早產(chǎn)、胎兒畸形、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限或死胎；④使用皮質(zhì)激素類藥物或近1 周使用影響糖脂代謝的藥物；⑤產(chǎn)前發(fā)熱或近期有炎癥、感染及創(chuàng)傷等其他應(yīng)激狀態(tài)；⑥產(chǎn)檢及分娩資料不完整的孕產(chǎn)婦或既往有煙酒不良嗜好的孕產(chǎn)婦。

1.2 資料收集

1.2.1 一般指標(biāo) 記錄兩組研究對(duì)象24～28 周口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）血糖值、糖化血紅蛋白(HbA1c)值、年齡、孕次、產(chǎn)次、分娩方式等指標(biāo)，由專人測(cè)量研究對(duì)象產(chǎn)前體重、身高，計(jì)算產(chǎn)前體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)。

1.2.2 外周血標(biāo)本 所有孕婦均于孕37～42 周入院待產(chǎn)期間抽取清晨空腹肘靜脈血2 mL 置促凝管中，血標(biāo)本于1 h 內(nèi)在4 ℃下3 000 r/min 離心10 min，將1 mL 血清分裝為4 管后置于—80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.3 ELISA 檢測(cè)篩選候選生物標(biāo)志物 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；設(shè)置空白孔(不加樣品和酶標(biāo)試劑)、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)孔內(nèi)加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣品孔先后加入樣本稀釋液40 μL 和樣品10 μL；用封板膜封板后于37 ℃孵育30 min；棄掉液體拍干并加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去、拍干，重復(fù)5 次；除空白孔外，其他加入酶標(biāo)試劑50 μL 后37 ℃孵育30 min；再次洗滌5 次后，每孔加入顯色劑A、顯色劑B各50 μL，37 ℃避光顯色10 min；每孔加入終止液50 μL，在15 min 內(nèi)用450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Graph Pad Prism 8 作繪圖分析。定量資料符合正態(tài)分布時(shí)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布時(shí)先進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，若仍然呈非正態(tài)分布則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用中位數(shù)(M)、四分位數(shù)間距(IQR)表示。對(duì)非等級(jí)定性資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。對(duì)篩選出的候選生物標(biāo)志物指標(biāo)進(jìn)行二元Logistic 回歸分析，選擇對(duì)GDM 發(fā)生有顯著影響的蛋白指標(biāo)，用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析其對(duì)診斷GDM 的敏感性、特異性和截?cái)嘀?。P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象臨床資料比較 GDM 組孕婦在孕24～28 周進(jìn)行75 g OGTT 檢測(cè)血糖的0 h、1 h、2 h血糖值和HbA1c 均顯著高于對(duì)照組，年齡、產(chǎn)前BMI、孕次、產(chǎn)次、分娩方式、居住地、文化程度及職業(yè)等臨床資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象臨床資料比較

2.2 兩組孕婦外周血清EPPK1、CIRBP、HNRNPA2B1、HNRNPAB、HNRNPL、RAB21、RAB3B 表達(dá)水平比較 由于在檢測(cè)過(guò)程中GDM 組有1 例樣本的每個(gè)指標(biāo)均出現(xiàn)極大值，本研究經(jīng)核對(duì)孕婦基本資料與病史并未發(fā)現(xiàn)有特殊之處，故將該樣本數(shù)據(jù)予以剔除后進(jìn)行分析。ELISA 結(jié)果顯示GDM 組EPPK1、CIRBP、HNRNPAB 和RAB3B 表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而其余3個(gè)蛋白HNRNPA2B1、HNRNPL、RAB21 在GDM 組和對(duì)照組血清中的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果詳見(jiàn)圖1和表2。

表2 兩組孕婦血清EPPK1、CIRBP、HNRNPA2B1、HNRNPAB、HNRNPL、RAB21、RAB3B 表達(dá)水平比較[M(IQR)]單位：pg/mL

圖1 兩組EPPK1、CIRBP、HNRNPAB、RAB3B、HNRNPA2B1、HNRNPL、RAB21 表達(dá)比較的箱式圖(A 為EPPK1；B 為CIRBP；C 為HNRNPAB；D 為RAB3B；E 為HNRNPA2B1；F 為HNRNPL；G 為RAB21)

2.3 GDM 發(fā)生影響因素的二元Logistic 回歸分析 以是否GDM 為因變量，EPPK1、CIRBP、RAB3B和HNRNPAB 表達(dá)水平為協(xié)變量進(jìn)行二元Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示EPPK1 和RAB3B 高表達(dá)是GDM發(fā)生的影響因素。見(jiàn)表3。

表3 GDM 發(fā)生影響因素的二元Logistic 回歸分析

2.4 EPPK1 和RAB3B 對(duì)GDM 的檢驗(yàn)效能分析 為評(píng)價(jià)EPPK1和RAB3B在GDM診斷中的價(jià)值，以EPPK1繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，截?cái)嘀禐?50.0 pg/mL，曲線下面積(AUC)為0.885，靈敏度為0.931，特異度為0.733，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以RAB3B 繪制ROC 曲線，則截?cái)嘀禐?33.1 pg/mL，AUC 為0.779，靈敏度為0.966，特異度為0.633，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖2 EPPK1 和RAB3B 檢驗(yàn)GDM 效能的ROC 曲線(A 為EPPK1;B 為RAB3B)

3 討論

GDM 是全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，它增加了妊娠期高血壓、羊水過(guò)多、產(chǎn)后出血、巨大兒、產(chǎn)傷、新生兒低血糖的發(fā)生率和母兒遠(yuǎn)期患2 型糖尿病、代謝綜合征及心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2-4]。研究表明，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療GDM 能夠有效改善妊娠結(jié)局[11]。生物標(biāo)志物在臨床上可以用來(lái)預(yù)測(cè)或診斷疾病，洞察疾病的病理生理過(guò)程，并可用于對(duì)治療干預(yù)的藥理學(xué)反應(yīng)的監(jiān)測(cè)或臨床結(jié)局的預(yù)測(cè)[12]。因而，關(guān)于GDM 的早期篩查生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)受到了廣泛關(guān)注。

目前，臨床上對(duì)于GDM 的診斷和治療過(guò)程的效果判斷均以監(jiān)測(cè)血糖為主，但現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)即使嚴(yán)格治療使血糖達(dá)到目標(biāo)水平，GDM 病人胎盤的形態(tài)與功能依然會(huì)發(fā)生改變[13-14]，其母嬰并發(fā)癥的發(fā)生率仍高于正常孕婦[15]。故僅依靠血糖監(jiān)測(cè)不足以很好地達(dá)到預(yù)測(cè)和防治GDM 及其并發(fā)癥的目的。迄今為止，已報(bào)道的GDM 早期預(yù)測(cè)因子包括一些血糖標(biāo)志物[16-18]、炎癥標(biāo)志物[16]、胰島素抵抗標(biāo)志物[19]、脂肪細(xì)胞衍生標(biāo)志物[20]和胎盤衍生標(biāo)志物[21-22]等，但這些指標(biāo)存在諸多不足之處，如有的研究結(jié)果不一致、有的特異性或敏感性較差、有的沒(méi)有臨床可用的閾值、有的預(yù)測(cè)能力較低等，且大多數(shù)為小樣本病例對(duì)照研究，也沒(méi)有進(jìn)行成本效益分析[23]。因此，目前臨床上尚缺乏方便、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、特異性和敏感性高的早期篩查指標(biāo)。

本研究ELISA 結(jié)果顯示，GDM 組血清EPPK1、CIRBP、HNRNPAB 和RAB3B 表達(dá)水平均高于對(duì)照組，與前期胎盤組織iTRAQ 和PRM 蛋白組學(xué)的研究結(jié)果一致，說(shuō)明這4 個(gè)蛋白在GDM 中的表達(dá)呈現(xiàn)穩(wěn)定上調(diào)的趨勢(shì)，可能對(duì)GDM 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程具有重要作用。Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，EPPK1 和RAB3B 高表達(dá)是GDM 發(fā)生的影響因素；進(jìn)一步分別以EPPK1 和RAB3B 指標(biāo)繪制ROC 曲線，當(dāng)EPPK1 截?cái)嘀禐?50.0 pg/mL 時(shí)，其對(duì)GDM 檢驗(yàn)效能的靈敏度為0.931，特異度為0.733，AUC 為0.885；當(dāng)RAB3B 截?cái)嘀禐?33.1 pg/mL 時(shí)，RAB3B 對(duì)GDM 檢驗(yàn)效能的靈敏度為0.966，特異度為0.633，AUC 為0.779。提示臨床上應(yīng)該對(duì)血清EPPK1＞550.0 pg/mL 和RAB3B＞333.1 pg/mL 的孕婦實(shí)行嚴(yán)格的妊娠期血糖監(jiān)測(cè)，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)血糖異常并進(jìn)行干預(yù)。因此，前期iTRAQ、PRM 和本研究ELISA 多重組合檢測(cè)結(jié)果一致，結(jié)合ROC 曲線分析結(jié)果，本研究認(rèn)為EPPK1 和RAB3B 可以作為GDM 的候選生物標(biāo)志物。

因?yàn)槔硐氲纳飿?biāo)志物應(yīng)在生物體中穩(wěn)定表達(dá)、檢測(cè)的樣本容易獲得、對(duì)疾病狀態(tài)的相關(guān)變化敏感，能夠在臨床癥狀出現(xiàn)之前對(duì)疾病進(jìn)行早期檢測(cè)，具有區(qū)分疾病病理的能力，并具有成本效益和重復(fù)性[24-25]。故本研究的重要意義主要在于篩選出了GDM 潛在的生物標(biāo)志物，為新型生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)提供了方向與思路。至于EPPK1 和RAB3B 能否成為具有臨床可用性的標(biāo)志物，還需要對(duì)不同人群進(jìn)行大樣本的前瞻性隊(duì)列研究。由于本研究是病例對(duì)照設(shè)計(jì)研究，僅收集妊娠晚期孕婦的血清進(jìn)行蛋白表達(dá)水平檢測(cè)，未能明確和比較這些蛋白指標(biāo)在發(fā)展為GDM 和未發(fā)展為GDM 的孕婦整個(gè)孕期的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化過(guò)程。因此，未來(lái)研究可采用縱向隊(duì)列研究，檢測(cè)與對(duì)比EPPK1、CIRBP、 HNRNPA2B1、 HNRNPAB、 HNRNPL、RAB21 和RAB3B 在GDM 和正常孕婦妊娠早、中、晚期血清中的表達(dá)情況，并進(jìn)行ROC 曲線分析了解其對(duì)GDM 的預(yù)測(cè)能力及價(jià)值。相信隨著今后對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究日益展開(kāi)和臨床大樣本研究的驗(yàn)證，能夠揭示這些蛋白在GDM 發(fā)病中的因果關(guān)系和具體作用途徑與機(jī)制，并有望成為該病的新型生物標(biāo)志物，在GDM 的早期篩查、預(yù)防及早期的治療干預(yù)中具有重要價(jià)值。

4 小結(jié)

EPPK1、CIRBP、HNRNPAB 和RAB3B 在GDM孕婦血清中高表達(dá)，EPPK1 與RAB3B 對(duì)GDM 具有較好的診斷效力，可作為GDM 的候選生物標(biāo)志物。但這些蛋白在GDM 中的具體作用和是否具有臨床應(yīng)用價(jià)值，有待進(jìn)一步研究。