卜紅宇，韓 峰，郝美玲，王昆鵬，劉炳茹

(內(nèi)蒙古藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010020)

黃酮化合物是具有C6-C3-C6基本骨架，以結(jié)合態(tài)(黃酮苷)或自由態(tài)(黃酮苷元)兩種形式存在，大部分黃酮化合物以結(jié)合態(tài)(黃酮苷)形式存在食源性植物[1-4]以及藥用植物中，如甘草[5]、山牛蒡[6]、穿心蓮[7]、木蝴蝶[8]等，可分為黃酮、黃酮醇、異黃酮、黃烷酮、黃烷醇、花色素[9]。具有抗氧化性[1，2，10]、抗菌[3，11]、消炎[4，11]、抗癌癥[11]及抑制心血管疾病等生物功能[12]。本文主要闡述類黃酮生物合成的基因調(diào)控及環(huán)境脅迫。植物類黃酮生物合成調(diào)控的研究對(duì)黃酮類化合物生物合成的功能基因挖掘和分子調(diào)控機(jī)制的闡明具有重要的理論意義，對(duì)類黃酮產(chǎn)物合成與積累具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 植物類黃酮的代謝合成途徑

目前，擬南芥[13]等植物中黃酮化合物合成途徑已經(jīng)被闡述清楚，主要涉及苯丙烷生物合成途徑，苯丙氨酸在苯丙氨酸酶(PAL)、肉桂酸4-羥化酶(C4H)及4-香豆酰輔酶A連接酶(4CL)等的作用下形成香豆酰輔酶A。底物進(jìn)一步在查爾酮合酶(CHS)的作用下形成查爾酮，然后分別由查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、柚皮素經(jīng)黃烷酮3-羥化酶(F3H)、類黃酮3′-羥化酶(F3′H)和類黃酮3′，5′-羥化酶(F3′5′H)等酶作用生成黃酮類化合物。黃酮類化合物的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的過程，不僅涉及苯丙烷的生物合成途徑，還涉及許多其他的次生代謝途徑，如黃酮代謝途徑、萜類生物合成途徑、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、植物晝夜節(jié)律途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑[5]。

2 植物類黃酮生物合成途徑中的調(diào)控基因

2.1 CHS酶及基因

1983年首個(gè)植物荷蘭芹的CHS 序列被發(fā)現(xiàn)[14]，之后蕨類[15]以及苔蘚[16]等多種植物中CHS基因也已被克隆。CHS是黃酮類化合物合成途徑中的第1個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，被認(rèn)為是蛋白質(zhì)工程的理想靶點(diǎn)[17]。它催化該途徑的第1步，即將3分子丙二酰輔酶A和1分子4-香豆酰輔酶A結(jié)合形成查爾酮，進(jìn)一步衍生轉(zhuǎn)化為各類黃酮類化合物[18]。然而，CHS也催化產(chǎn)生其他多酮類化合物，如香豆酰三乙酸內(nèi)酯，CHS催化的這種不確定性對(duì)類黃酮生物合成的效率產(chǎn)生了不利影響，Waki 等人[19]研究表明，由陸地植物基因組中普遍存在的基因編碼的查爾酮異構(gòu)樣蛋白(CHILs)與CHS結(jié)合，可以減少香豆酰三乙酸內(nèi)酯的形成，從而糾正CHS混雜的催化作用。這種CHILs功能已在多種陸地植物中得到證實(shí)，是一種促進(jìn)底物從苯丙烷途徑有效進(jìn)入黃酮途徑的保守策略。擬南芥的CHS基因調(diào)控其類黃酮的積累和非生物脅迫耐受性[20]。

2.2 CHI酶及基因

CHI是黃酮類化合物代謝途徑中的第2個(gè)關(guān)鍵酶。目前，黃芪[21]、凹唇姜[22]、青蒿[23]等多種植物CHI基因被成功克隆。Sun等人[24]研究表明CHI是蛇根草花青素生物合成的關(guān)鍵酶。Ren 等人[25]從紅花cDNA文庫(kù)中克隆了一種新的CHI基因，命名為CtCHI-N，其表達(dá)與開花期黃酮類生物合成有關(guān)。Yang等人[26]克隆了藥用植物漆樹的CHI基因，命名為RcCHIc，其DNA序列為1058 bp，包含一個(gè)內(nèi)含子和兩個(gè)外顯子，組織中總黃酮水平與RcCHIc mRNA的組織特異性表達(dá)呈正相關(guān)。而Dare 等人[27]研究表明蘋果中CHI過量表達(dá)降低了根皮苷的合成與積累。

2.3 F3H酶及基因

Martin等人[28]首次分離出F3H基因，F(xiàn)3H是黃酮類化合物代謝途徑中關(guān)鍵酶之一，是花青素生物合成所必需的關(guān)鍵酶[29]。Cheng 等人[30]研究了洋甘菊中F3H家族(CnF3Hs)4個(gè)成員基因CnF3H1-4，發(fā)現(xiàn)CnF3H1-4與其他植物F3H相似性較高，所有基因均包含兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，在類黃酮代謝中起重要作用，在不同組織中的表達(dá)存在顯著差異，CnF3H1-3在花中的表達(dá)量最高，而CnF3H4在根中的表達(dá)量最高。夏堇中F3H基因的表達(dá)影響其花瓣的顏色，表達(dá)量增加時(shí)，白色花瓣可變?yōu)榉奂t色[31]。鄭晟等人[32]成功克隆了檸條錦雞兒的F3H基因，命名為CkF3H，其基因序列與其它植物F3H有較高的一致性。CkF3H在根、莖和葉中均有表達(dá)，沒有組織特異性；CkF3H的表達(dá)受低溫、高溫、干旱和高鹽脅迫的誘導(dǎo)，并且在低溫脅迫下，CkF3H的表達(dá)還受到光周期的影響。

2.4 DFR酶及基因

二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)是花青素合成途徑的關(guān)鍵酶，其選擇性的催化二氫楊梅黃酮、二氫山奈黃酮醇、二氫槲皮黃酮生成無色飛燕草色素、無色天竺葵色素和無色矢車菊色素[33]。DFR基因具有組織表達(dá)特異性，李媛等人[34]從烏頭花中克隆了DFR基因，命名為AcDFR，其cDNA全長(zhǎng)為1233bp，開放閱讀框?yàn)?014bp，預(yù)測(cè)編碼337個(gè)氨基酸；AcDFR在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)結(jié)合區(qū)域和底物結(jié)合區(qū)域都高度保守，屬于NADB Rossmann超家族。AcDFR主要在烏頭的花中表達(dá)，在根、莖、葉中幾乎不表達(dá)，其表達(dá)量與花青素含量的變化呈正相關(guān)。孫海燕等人[35]從三色堇花瓣中克隆了1個(gè)花色素合成結(jié)構(gòu)基因，命名為VwDFR，其cDNA全長(zhǎng)為1340 bp，編碼347個(gè)氨基酸，與胡楊的DFR序列具有較高的一致性。VwDFR 蛋白含有典型的植物DFR蛋白的保守功能結(jié)構(gòu)域，屬于短鏈脫氫/還原酶(SDR)超基因蛋白家族成員。VwDFR 基因在三色堇不同組織中的表達(dá)存在明顯差異，在初花期的花瓣中表達(dá)量最高，且色斑區(qū)高于非色斑區(qū)。Ni 等人[36]從銀杏中分離出3個(gè)新的DFR基因(GbDFR)，這些基因具有相似的結(jié)構(gòu)，與擬南芥DFRs的關(guān)系比之前文獻(xiàn)中報(bào)道的GbDFR更為密切；GbDFR4和GbDFR6分別在葉片和果實(shí)中優(yōu)先表達(dá)；幼齡和成熟期葉片基因表達(dá)模式相似，5月份收獲的果實(shí)中GbDFRs的表達(dá)水平顯著高于6月份收獲的果實(shí)。Mei 等人[37]在茶樹中鑒定出DFR編碼基因(命名為CsDFRa)，并研究了它和另外5個(gè)推測(cè)的在最近的組學(xué)文獻(xiàn)中得到廣泛討論的DFR(命名為CsDFRb1、CsDFRb2、CsDFRb3、CsDFRc和CsDFRd)的功能，結(jié)果表明5個(gè)推測(cè)的CsDFRs序列與CsDFRa存在較大差異，且表達(dá)水平較低，只有CsDFRa在產(chǎn)生花青素和兒茶素的途徑中起作用。但141位單氨基酸突變修飾了CsDFRa對(duì)二氫槲皮素和二氫楊梅素的調(diào)控，也削弱了其穩(wěn)定性。

2.5 其它酶及基因

黃酮類化合物的生物合成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，許多對(duì)生物合成至關(guān)重要的酶及基因還有待不斷研究。如最新研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖苷酶基因(GLU)、松柏醛脫氫酶基因(CADH)和過氧化物酶基因(POD)表達(dá)的下調(diào)使生物合成底物向類黃酮合成途徑分流[5]。番茄紅素合酶基因(CS1)表達(dá)的下調(diào)可能有利于類胡蘿卜素的生物合成，促進(jìn)類黃酮的積累[38]。Wang等人[39]研究表明，花青素合成酶(ANS)與黃酮醇合酶(FLS)、F3H都屬于依賴2-氧化戊二酸(2ODD)氧合酶家族，在類黃酮的生物合成中發(fā)揮著重要的作用。從煙草基因組中鑒定了2個(gè)ANS基因、2個(gè)FLS基因和4個(gè)F3H基因。編碼煙草2ODD氧合酶的基因在黃酮類生物合成中并不能決定黃酮類化合物在各組織中的積累模式，但會(huì)強(qiáng)烈影響煙草組織中黃酮類化合物的濃度。當(dāng)ANS基因被抑制，更多的碳源流向黃酮醇生物合成，而當(dāng)FLS基因被抑制時(shí)，花青素積累更多。王毅等人[40]從滇牡丹中成功克隆了類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(F3GT)基因，命名為PdF3GT1，其在花蕾，花瓣中大量表達(dá)，在葉和花芽中有微弱表達(dá)；在根和莖中沒有表達(dá)。肖繼坪等人[41]研究發(fā)現(xiàn)花色苷的積累與F3GT的表達(dá)正相關(guān)，F(xiàn)3GT相對(duì)表達(dá)量和花色苷含量均是塊莖高于葉片，花色苷含量較高的器官，其F3GT 的相對(duì)表達(dá)量也較高。Hu 等人[5]從甘草中挖掘出了61個(gè)對(duì)黃酮類化合物合成起著重要作用的基因?？寺〕鯝H、DXS、LUP、CHS以及SQS基因，然而對(duì)于這些基因中的大部分，它們?cè)诟咧参镱慄S酮生產(chǎn)中的作用尚不清楚。

3 環(huán)境因子對(duì)植物類黃酮的調(diào)控

3.1 光照

光是植物生命活動(dòng)中最重要的環(huán)境因子之一，它是植物生長(zhǎng)發(fā)育的能量來源，同時(shí)在調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物的合成有重要影響。光照包括光強(qiáng)和光質(zhì)，這兩方面都對(duì)黃酮的合成有重要影響。光照強(qiáng)度會(huì)影響植物中類黃酮含量和分布，一般光照強(qiáng)度增強(qiáng)，植物體內(nèi)類黃酮含量會(huì)升高。不同光質(zhì)觸發(fā)植物體內(nèi)不同的光受體，進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝活動(dòng)，光受體包括光敏素、藍(lán)光/近紫外光受體、紫外光受體，一般情況下，短波段光對(duì)植物類黃酮的積累有促進(jìn)作用，長(zhǎng)波光則抑制。Neugart等人[42]研究了溫室中光強(qiáng)對(duì)甘藍(lán)葉中類黃酮的變化，強(qiáng)光400 μmol·m-2·s-1處理下總黃酮含量比弱光100 μmol·m-2·s-1處理下高23.9%。UVB輻射處理能夠誘導(dǎo)葡萄果實(shí)皮的黃酮類化合物的積累[43]。UVB照射能夠增加銀杏黃酮的含量，降低花青素的含量和GbDFR的表達(dá)水平[36]。

3.2 溫度

低溫可以促進(jìn)植物黃酮合成途徑中相關(guān)酶的活性，對(duì)植物類黃酮的積累有促進(jìn)作用。張剛等人[44]研究了不同生長(zhǎng)溫度對(duì)煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過程中黃酮類化合物蕓香苷和山奈酚-3-O-蕓香苷含量、代謝相關(guān)酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)較低的生長(zhǎng)溫度(18.5℃)有利于黃酮類化合物在煙草葉片中的積累，與生長(zhǎng)在較高生長(zhǎng)溫度(23.5℃和28.5℃)下的葉片相比，較低生長(zhǎng)溫度上調(diào)了煙草葉片類黃酮代謝相關(guān)基因 PAL、C4H、4CL、CHS、F3H、F3′H 和 FLS 的基因表達(dá)，提高了類黃酮代謝關(guān)鍵酶 PAL、C4H、4CL 和 CHI 的活性，促進(jìn)了黃酮類化合物蕓香苷和山奈酚-3-O-蕓香苷的積累。

3.3 水分

適宜的水分脅迫可以促進(jìn)植物類黃酮的積累。土壤水分、大氣相對(duì)濕度增加利于總皂苷積累，不利于總黃酮積累。李光躍等人[45]研究發(fā)現(xiàn)黃芪根、莖、葉中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷4種黃酮類化合物在黃芪各器官中分布和含量不盡相同，同一器官中不同黃酮類化合物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)規(guī)律也存在差異；適度的干旱脅迫能夠促進(jìn)黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累，但過度干旱脅迫則不利于其積累。Yang 等人[46]研究發(fā)現(xiàn)干旱能夠脅迫誘導(dǎo)柴胡葉片中黃酮類化合物和根中柴胡皂苷的生物合成。

3.4 其他

4 展望

近年來，隨著對(duì)植物類黃酮生物代謝合成研究的逐漸深入，植物黃酮的合成代謝途徑已經(jīng)被闡明，調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控因子也被逐漸分離鑒定，這些研究闡述了黃酮合成的復(fù)雜性與特異性。然而，黃酮類化合物的生物合成調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，許多對(duì)生物合成至關(guān)重要的酶、基因及調(diào)控因子還有待不斷研究。隨著蛋白組、基因組和轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)在探索植物次生代謝的分子機(jī)制方面的發(fā)展與成熟，研究植物代謝調(diào)控差異蛋白，關(guān)鍵酶及基因等，有望成為調(diào)控植物發(fā)育、改變類黃酮含量和/或組成的有效途徑。另外也能夠?yàn)橹参镱慄S酮生物合成的功能基因挖掘和分子調(diào)控機(jī)制的闡明提供理論基礎(chǔ)。