孫純勇,王玲娜,顏培正,張永清,李佳,趙東升

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院,山東 濟南,250355)

金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花,是我國傳統(tǒng)藥食兩用大宗中藥材之一,具有清熱解毒、疏散風熱的功效[1]。金銀花主要含有有機酸、黃酮、環(huán)烯醚萜、三萜等功效成分[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明,金銀花具有抗氧化、降血脂、抗炎、保肝利膽、抗病毒、抗菌和免疫調節(jié)等藥理作用[3]。

體外仿生消化法是根據(jù)人體或動物的生理學功能,模擬胃腸道環(huán)境的生物學特性,能夠在一定程度上反映某些藥物或食物在人體胃腸道中的動態(tài)變化情況的一種方法[4-5],因而在藥食兩用植物的體外模擬胃腸道消化研究中已得到廣泛用[6-8]。目前有關金銀花抗氧化方面的研究主要集中在其提取物本身所含化學成分及體外活性的測定[9-11],這僅能單純地分析其原有化學成分含量及抗氧化活性,但不能真實反映在胃腸消化過程中金銀花有效成分和抗氧化活性的變化?；诖?本研究采用體外仿生消化法探究金銀花中12種主要功能成分及抗氧化活性的變化規(guī)律,以期為金銀花體外模擬胃腸消化提供一定的理論指導,同時也為正確認知和評價金銀花對人體的生理學活性提供相關依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

金銀花,山東平邑,經(jīng)山東中醫(yī)藥大學張永清教授鑒定為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾；磷酸鈉、鉬酸銨、硫酸亞鐵(AR),天津市永大化學試劑有限公司；胃蛋白酶(≥ 250 U/mg)、胰蛋白酶(8×USP)、豬膽鹽,美國Macklin公司；碳酸鈉、碳酸氫鈉(均為分析純),國藥集團化學試劑公司；乙腈、甲醇,賽默飛世爾科技有限公司；木犀草苷(Y13 J10H93050)、新綠原酸(P20A11L121936)、蘆丁(Y24F11Y17051)、綠原酸(Y20A11K111541)、異綠原酸B(P17 N11L131404)、異綠原酸A(Y24 N8Y49009)、隱綠原酸(P16A10U95423)、馬錢苷酸(K17S11B724207)、馬錢苷(P24O11F128801)、異綠原酸C(P03 N11L1-29757)、斷氧化馬錢苷(P27 N8L49194)、金絲桃苷(P14A11F121347)(純度大于98%),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

T6紫外-可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司；D-37520冷凍離心機,德國Thermo Electron公司；Alpha 1-4 LD Plus凍干機,CHRIST；-80 ℃冰箱,青島海爾特種電器有限公司；全溫振蕩器,太倉市實驗設備廠；IKA型旋轉蒸發(fā)儀,艾卡(廣州)儀器設備有限公司；2690高效液相色譜儀,美國Waters公司；ZORBAX SB-C18色譜柱,美國Agilent公司。

2 實驗方法

2.1 金銀花體外模擬消化

2.1.1 金銀花醇提物及樣品溶液的制備[12]

金銀花藥材粉碎,過60目篩,取粉末500 g,加10倍體積65%乙醇,于75 ℃下回流提取1 h,抽濾；濾渣加5倍體積65%乙醇,提取0.5 h,抽濾。合并濾液,減壓濃縮,凍干,即得金銀花醇提物。精密稱取3.0 g金銀花醇提物溶于200 mL生理鹽水,制成15 mg/mL樣品溶液備用。

2.1.2 金銀花醇提物模擬胃腸消化[13-14]

消化過程分為2個階段：胃液消化和腸液消化。模擬胃消化液：精密稱量2.0 g胃蛋白酶,加50 mL 0.01 mol/L HCl溶液溶解,制成模擬胃消化液;模擬腸消化液：分別精密稱量0.4 g胰蛋白酶、2.5 g豬膽鹽,加100 mL 0.1 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖液溶解,制成模擬腸消化液。

胃液消化：分別量取20.0 mL金銀花醇提物樣品溶液,置50 mL離心管,恒溫水浴加熱至37 ℃,1 mol/L HCl溶液調pH 2.0,加4.0 mL模擬胃消化液作為模擬胃液組；胃酸對照組和空白對照組分別加入與樣品溶液等體積的0.01 mol/L HCl溶液和生理鹽水,并且不調整pH。37 ℃恒溫水浴搖床中消化2.0 h(避光),消化過程中,自0 h開始,每隔0.5 h取樣1次,90 ℃水浴1 min滅酶,13 000 r/min離心15 min(4 ℃),上清液置-80 ℃儲存。

腸液消化：模擬胃液組樣品溶液仍具有胃蛋白酶活性,須經(jīng)90 ℃水浴滅活1 min。以1 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖液調pH 7.0,加4.0 mL模擬腸消化液作為模擬腸液組；胃液消化產(chǎn)物中加等體積0.1 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖液代替腸液作為腸液空白組。37 ℃恒溫水浴搖床中消化2.0 h(避光)。取樣方式同胃液消化,90 ℃水浴滅酶1 min,低溫離心后上清液于-80 ℃保存。

未加消化酶的樣品溶液作為空白對照組,與胃酸對照組、腸液空白組一并用于分析模擬體外消化過程中pH值等化學環(huán)境因素對金銀花醇提物化學成分和抗氧化活性的影響。

2.2 金銀花醇提物消化前后化學成分含量的測定[15]

2.2.1 色譜條件

HPLC：Waters 2690型,色譜柱：C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相：A為0.1%磷酸、B為乙腈,檢測波長254 nm,流速1 mL/min,柱溫：室溫,進樣量10 μL。

2.2.2 標準溶液的配制

分別取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、金絲桃苷、蘆丁、木犀草苷、馬錢苷酸、馬錢苷、斷氧化馬錢苷12種標準品適量制成混合標準品溶液,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 含量測定

將“2.1.2”中金銀花醇提物的胃、腸消化液用0.22 μm濾膜過濾,進樣。分析消化前后金銀花醇提物中主要活性成分含量。

2.3 體外模擬消化對金銀花醇提物抗氧化性的影響

2.3.1 總體抗氧化活性測定

在王謝祎等[16]研究方法基礎上稍作改動。分別取3 mol/L H2SO3、0.02 mol/L 鉬酸銨和0.14 mol/L Na3PO3溶液各1.0 mL,加蒸餾水至5.0 mL作為空白對照組,在695 nm處測定吸光度記為A0。取1.0 mL樣品溶液為反應組,在695 nm處測定吸光度記為Ai?？傮w抗氧化能力計算如公式(1)所示：

ΔA=Ai-A0

(1)

式中：ΔA,吸光度差值；A0,空白組吸光度；Ai,樣品溶液吸光度。

2.3.2 ·OH清除能力測定

參照趙玉靜等[17]報道的方法并稍作改動。分別取9 mmol/L 水楊酸-乙醇、9 mmol/L FeSO3、消化液各1.0 mL,加1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2,在510 nm處測定吸光度記為Ai。另以蒸餾水代替樣品為樣品空白組,在510 nm處測定吸光度記為A0,以蒸餾水替代H2O2為反應空白組,在510 nm處測定吸光度記為Ai0?！H清除率計算如公式(2)所示：

(2)

2.3.3 DPPH自由基清除能力測定

參照熊文等[18]報道的方法,以樣品溶液300 μL和DPPH自由基溶液3.0 mL作為樣品反應組,在517 nm處測定吸光度記為Ai；以80% 甲醇 1.0 mL代替樣品溶液作為樣品空白組,在517 nm處測定吸光度記為A0；80%甲醇吸光度,在517 nm處測定吸光度記為At。

DPPH清除率計算如公式(3)所示：

(3)

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0和GraphPad prism 8.3軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖。單因素方差分析中P<0.05表示差異顯著具有統(tǒng)計學意義。采用Pearson correlation test進行相關性分析。實驗操作均重復3次,結果以平均值±相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)表示。

3 結果與分析

3.1 體外仿生消化過程中金銀花醇提物化學成分含量變化

從圖1可以看出,仿生消化前后金銀花醇提物中主要活性成分含量發(fā)生了較大變化。在模擬胃液消化過程中,綠原酸含量變化如圖2-a所示,消化后綠原酸含量為(0.642 6±0.000 2)mg/mL,較空白對照組上升了14.96%。如圖2-b顯示,隱綠原酸在模擬胃液中消化1.0 h后含量明顯上升并達最大,此時含量為(0.017±0.002)mg/mL,較空白對照組升高了20.17%；隨著消化進程,隱綠原酸含量明顯降低并在2.0 h達到最小,此時含量為(0.012±0.003)mg/mL,降低了46.82%。新綠原酸(圖2-c)、異綠原酸A(圖2-d)在模擬胃液中0.5 h內含量較空白對照組分別上升了46.00%、25.23%。在模擬胃液消化前后,金銀花6種酚酸類成分含量總體相對減少,這與萬坤等[19]研究結果相一致,說明胃蛋白酶和胃酸環(huán)境可促進酚酸類成分的釋放酶解。在模擬腸液消化過程中,新綠原酸含量在0.5 h出現(xiàn)下降,1.0 h上升至最大值并逐漸下降至穩(wěn)定；綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、B、C等成分消化前后無明顯變化(P>0.05),0 h酚酸成分含量低是因為pH環(huán)境的改變促使酚酸類成分中的酚羥基被酶解或被結合,從而使其含量下降,但對比消化前后,可知腸液消化環(huán)境對酚酸類成分無顯著影響。

圖1 混標、未消化樣品、胃消化樣品和腸消化樣品典型色譜圖Fig.1 Typical chromatograms of mixed standard,undigested sample,gastric digestion sample and intestinal digestion sample 注：S-混標、A-未消化樣品、B-胃消化樣品和C-腸消化樣品；1-新綠原酸；2-馬錢苷酸；3-綠原酸；4-隱綠原酸；5-馬錢苷；6-斷氧化馬錢苷；7-蘆丁；8-金絲桃苷；9-異綠原酸B；10-異綠原酸A；11-異綠原酸C；12-木犀草苷

a-綠原酸；b-隱綠原酸；c-新綠原酸；d-異綠原酸A；e-異綠原酸B；f-異綠原酸C圖2 仿生消化過程中酚酸類成分含量變化Fig.2 Changes of phenolic acid content during bionic digestion

模擬胃消化過程中,黃酮類成分含量變化趨勢與酚酸類成分較為相似,如圖3-a和圖3-b所示,0.5 h的模擬胃液組中蘆丁、金絲桃苷含量分別升高了11.91%和114.44%。1.0 h模擬胃液組中木犀草苷含量上升至最大值為(0.005 2±0.000 3)mg/mL(圖3-c),較0 h時升高了40.33%。然而,2.0 h模擬胃液組中金絲桃苷含量相較于空白對照組降低了19.58%。模擬腸消化0 h時(圖3-a),蘆丁含量明顯低于空白對照組,僅為空白對照組的12.78%,且呈下降趨勢。模擬腸液中金絲桃苷消化前后無明顯變化(P>0.05),但含量僅為空白對照組的10.54%。因此,在模擬胃液消化過程中,黃酮類成分含量總體減少,這與李如蕊等[20]、張露等[21]報道結果一致,說明胃蛋白酶和胃酸環(huán)境可促進黃酮類成分的酶解。

a-蘆?。籦-金絲桃苷；c-木犀草苷圖3 仿生消化過程中黃酮類成分含量變化Fig.3 Changes of flavonoid content during bionic digestion

如圖4-a所示,模擬胃液組在消化0 h時,馬錢苷酸含量為(0.007 5±0.000 2)mg/mL,明顯低于空白對照組。此時模擬胃液組中馬錢苷含量為(0.060 1±0.001 7)mg/mL(圖4-b),明顯高于空白對照組。而斷氧化馬錢苷消化前后含量無明顯變化(P>0.05)。在胃液消化前后,金銀花環(huán)烯醚萜類成分含量總體無明顯變化,說明胃蛋白酶和胃酸環(huán)境對環(huán)烯醚萜類成分影響較小。在體外模擬腸液消化過程中,相較于空白對照組,2.0 h內金銀花環(huán)烯醚萜類成分含量無顯著性變化(P>0.05)。

a-馬錢苷酸；b-馬錢苷；c-斷氧化馬錢苷圖4 仿生消化過程中環(huán)烯醚萜類成分含量變化Fig.4 Changes of iridoids content during bionic digestion

3.2 仿生消化后金銀花醇提物抗氧化活性變化

3.2.1 總體抗氧化活性能力

金銀花醇提物及仿生消化后總體抗氧化能力結果(圖5-a)顯示,空白對照組(B)、模擬胃液組(GJ)和模擬腸液組(IJ)總體抗氧化能力分別為(0.526±0.023)、(0.305±0.003)和(0.202±0.006)。

a-總體抗氧化能力；b-·OH清除率；c-DPPH自由基清除率圖5 仿生消化后金銀花醇提物抗氧化能力變化Fig.5 Changes of antioxidant capacity of ethanol extract of honeysuckle after biomimetic digestion

相較于B,金銀花醇提物經(jīng)過模擬胃液和模擬腸液消化后總體抗氧化能力顯著降低,GJ總體抗氧化能力降低了44.36%,而IJ降低了64.98%。

3.2.2 ·OH清除能力

金銀花醇提物及模擬消化后·OH清除能力如圖5-b所示,金銀花醇提物經(jīng)過仿生消化后,空白對照組(B)、模擬胃液組(GJ)和模擬腸液組(IJ)·OH清除能力分別為(97.51±0.3)%、(79.07±2.85)%、(11.99±1.34)%,與B相比,GJ的·OH清除能力降低了18.91%,而IJ降低了87.70%。

3.2.3 DPPH自由基清除能力

金銀花醇提物及仿生消化后DPPH自由基的清除能力結果如圖5-c所示,空白對照組(B)、模擬胃液組(GJ)和模擬腸液組(IJ)的DPPH自由基清除率分別為(88.37±0.15)%、(14.55±3.17)%和(6.56±0.48)%,與B相比,GJ的DPPH自由基清除能力降低了85.53%,而IJ降低了92.58%。

3.3 消化前后成分含量變化與其抗氧化活性之間的相關性分析

由圖6可知,在模擬胃腸道消化過程中,金銀花醇提物消化前后的總體抗氧化能力、·OH清除能力以及DPPH自由基清除能力與隱綠原酸、異綠原酸A、B、C以及蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷含量之間呈良好的正相關性(P<0.05)。

圖6 仿生消化前后成分含量變化與抗氧化活性之間 的相關性分析Fig.6 Correlation analysis between the content changes of components and their antioxidant activities before and after bionic digestion

此外,金銀花醇提物DPPH自由基清除能力和總體抗氧化能力之間也存在顯著的相關性(P<0.05),說明酚酸以及黃酮類成分含量能夠較好地反映金銀花醇提物的DPPH自由基清除能力和總體抗氧化能力。

4 討論與結論

4.1 討論

本研究利用體外仿生消化法研究了金銀花醇提物中酚酸類、黃酮類及環(huán)烯醚萜類成分含量的變化規(guī)律,并以總體抗氧化能力、·OH清除能力和DPPH自由基清除能力為指標綜合評價金銀花醇提物消化前后抗氧化活性的變化情況。

金銀花醇提物在模擬胃液消化中環(huán)烯醚萜類成分含量無顯著性差異,酚酸類和黃酮類成分含量出現(xiàn)下降趨勢,尤其新綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和金絲桃苷等成分?？瞻讓φ战M中異綠原酸A、異綠原酸C和隱綠原酸含量呈逐漸上升并趨于穩(wěn)定,推測37 ℃環(huán)境會促進金銀花醇提物中酚酸類物質的釋放。而在胃酸對照組和模擬胃液組中,隱綠原酸、新綠原酸和異綠原酸B均出現(xiàn)含量先升高后下降的規(guī)律,在1.0 h達最大值,可推測胃蛋白酶和胃酸環(huán)境對它們有一定的酶解作用,并在1.0 h后酚酸類物質的酶解速度大于釋放速度。模擬腸液消化過程中,由于溶液酸堿環(huán)境的改變,使得酚酸類、黃酮類和環(huán)烯醚萜類物質在0 h均出現(xiàn)降低情況,且降幅較大,尤其蘆丁含量降幅最大。腸液對照組和模擬腸液組中因腸液堿性增加,酚酸類化合物分子結構中多具有酚羥基,容易發(fā)生反應。環(huán)烯醚萜類成分雖受到酸堿環(huán)境影響,而模擬胃、腸消化過程中無顯著性變化,從而胃、腸溶液對環(huán)烯醚萜類成分不具有消化作用。由此可見,胃腸環(huán)境對酚酸及黃酮類成分的酶解作用較明顯,而對酚酸類、黃酮類成分的具體酶解機制還有待進一步深入探究。

通過對比仿生消化前后的抗氧化能力可知,金銀花醇提物在模擬胃腸消化過程中抗氧化能力隨著酚酸類、黃酮類成分含量的下降而降低,說明經(jīng)過胃液消化后金銀花中的抗氧化活性成分部分被酶解,導致其抗氧化能力降低。金銀花在模擬腸液消化過程中腸液消化組的總體抗氧化能力和·OH清除能力與成分含量的變化趨勢一致,即在模擬腸液消化過程中,腸液酸堿環(huán)境、胰蛋白酶、膽鹽環(huán)境在促進酚酸類、黃酮類成分的降解或轉化的同時,抗氧化能力也隨之明顯降低。相關性分析結果顯示,金銀花醇提物仿生消化前后的抗氧化能力與其中主要成分隱綠原酸、異綠原酸A、B、C以及蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷的含量變化成正相關,且酚酸以及黃酮類成分含量能夠較好地反映金銀花醇提物的DPPH自由基清除能力和總體抗氧化能力。因此,酚酸類、黃酮類成分是金銀花主要的抗氧化活性成分,這與徐文流等[22]、付晶晶等[23]、朱小峰等[24]報道的結果相一致。

4.2 結論

本研究結果為進一步深入研究金銀花體內胃腸道消化以及正確認識金銀花對人體的生物學活性提供了一定的理論指導,同時也為金銀花提取物在保健食品和醫(yī)藥等領域的開發(fā)及應用提供了科學依據(jù)。但金銀花醇提物中化學成分因其自身性質差異在模擬胃腸道環(huán)境中表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性,其結構變化、降解途徑、代謝產(chǎn)物及各成分之間是否存在相互作用仍值得進一步探究。