馬艷妮,魏悅,李智寧,王志堯,景炳年,寧二娟,楊銳,范毅*

1(河南省科學院,河南 鄭州,450002) 2(河南省納普生物技術有限公司,河南 鄭州,450002) 3(成都理工大學 材料與化學化工學院,四川 成都,610059)

蒲公英,菊科植物蒲公英 (TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)、堿地蒲公英 (TaraxacumborealisinenseKitam.)或同屬數(shù)種植物的干燥全草,性味苦、甘、寒,歸肝、胃經,具有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋之功效,用于治療疔瘡腫毒、乳癰、凜病、目赤、咽痛、肺癰、腸癰、濕熱黃疸和熱淋澀痛等[1]。蒲公英不僅含有碳水化合物、蛋白質、脂肪、氨基酸、維生素、磷、鐵、鈣等營養(yǎng)成分[2],同時含有揮發(fā)油[3]、多糖[4]、有機酸[5]、黃酮[6]、生物堿[7]等活性成分,具有降糖[8-9]、抗菌[10-11]、抗炎[12-14]、抗氧化[15-16]、抗腫瘤[17-18]、調節(jié)腸道微生態(tài)[19]等多種生物學活性,是我國傳統(tǒng)醫(yī)學和現(xiàn)代醫(yī)學均證實的藥食同源物品之一。近年來,蒲公英也被逐漸用于飲品[20-21]、保健品[22]、獸醫(yī)用[23]等方面,因此,蒲公英具有巨大的市場開發(fā)潛力。蒲公英根,作為蒲公英藥用部位的一部分,其多糖含量相對較高[24],具有良好的抗氧化活性[25],但是目前鮮少有明確的報道。本研究以河南市售蒲公英根為研究對象,通過乙醇提取、大孔樹脂柱分離與體外抗菌抗炎活性評價相結合,研究了蒲公英根的抗菌和抗炎活性組分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英根購于河南鄭州藥材市場,經河南中醫(yī)藥大學董誠明教授鑒定為菊科植物蒲公英(Taraxacummongolicum)的干燥根,標本存放于河南省科學院天然產物重點實驗室；標準菌株(大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、肺炎鏈球菌ATCC 49619、化膿性鏈球菌ATCC19615、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311),南京便診生物科技有限公司；臨床菌株(雞大腸桿菌CVCC 1555、雞金黃色葡萄球菌CVCC 548、雞白痢沙門氏菌CVCC 1887、牛無乳鏈球菌CVCC 540),中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；小鼠巨噬細胞RAW264.7,成都理工大學提供；1640培養(yǎng)基,美國Hyclone公司；青霉素-鏈霉素,上海碧云天生物技術有限公司；胎牛血清,新西蘭Newzerum公司;CCK-8試劑盒,大連美侖生物技術有限公司;ELISA試劑盒,北京達科為生物技術有限公司；培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒,成都福際生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒,南京諾唯贊生物科技有限公司；脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),美國Sigma公司；D101大孔樹脂,天津市光復精細化工研究院；蒲公英顆粒(批號18013702),江西心誠藥業(yè)有限公司；胰蛋白胨,上海寶錄生物科技有限公司；牛肉浸膏,北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇、氫氧化鈉滴定液、硫酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

ME204型分析天平,美國Mettler公司；TU-1810紫外分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司；wi93008麥氏比濁儀,東西儀(北京)科技有限公司；Countstar細胞計數(shù)儀,上海睿鈺生物科技有限公司；Nanodrop2000核酸檢測儀、CO2培養(yǎng)箱,美國Thermo公司；酶標儀、q-PCR儀、Gel DocTMXR+with Image LabTMsoftware凝膠成像系統(tǒng),美國Bio-Rad公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海紅華儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蒲公英根提取與分離

稱取蒲公英根2份,每份200 g,分別用體積分數(shù)70%乙醇回流提取3次,每次1 h,料液比分別為1∶12、1∶10和1∶10(g∶mL),趁熱抽濾,合并濾液并濃縮至無醇味,加蒸餾水稀釋,離心取上清液。稱取D101大孔樹脂2份,每份400 g,用95%乙醇浸泡過夜后分別裝柱,用95%乙醇洗滌、蒸餾水沖至無醇味。將2份上清液分別上樣,其中一個樹脂柱(1)用蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇依次洗脫,另一個樹脂柱(2)用蒸餾水、70%乙醇依次洗脫,洗脫液分別收集并濃縮至干,冷藏備用。

1.3.2 總黃酮質量分數(shù)測定

總黃酮質量分數(shù)按照參照文獻[26]方法測定。蘆丁對照品的線性回歸方程為Y=0.008 4X+0.165 9,r=0.999 0。

1.3.3 多糖質量分數(shù)測定

多糖質量分數(shù)按照硫酸-蒽酮方法測定[1]。葡萄糖線性回歸方程為Y=0.042 3X+0.024 8,r=0.999 1。

1.3.4 體外抗菌活性測定

1.3.4.1 菌懸液的制備

從活化的固體平板上挑取單菌落接種至液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)16～18 h后,用培養(yǎng)基稀釋成濃度為106～108CFU/mL的菌懸液,備用。

1.3.4.2 最小抑菌濃度的測定

利用倍半稀釋法[26-27]測定各樣品的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。先將各樣品制成初始質量濃度為250 mg/mL的水溶液,陽性藥物蒲公英顆粒制成初始質量濃度為500 mg/mL的水溶液,再分別用液體培養(yǎng)基依次倍半稀釋,共稀釋7個濃度。在96孔板各孔中加入100 μL供試菌液和100 μL待測溶液,每種測試菌液分別設置陰性對照(加入100 μL供試菌液和100 μL液體培養(yǎng)基)和空白對照(加200 μL液體培養(yǎng)基),于37 ℃培養(yǎng)18～20 h,各待測組澄清的孔所對應的最小檢測質量濃度即為其MIC。

1.3.4.3 最小殺菌濃度的測定

MIC實驗結束后,分別從澄清的各孔中取出少量液樣涂布于固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)18～24 h,完全沒有細菌生長的各待測組所對應的最小檢測質量濃度即為其最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)[26-27]。

1.3.5 體外抗炎活性的測定

1.3.5.1 細胞復蘇與傳代

將凍存的小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞于37 ℃下快速消融,然后轉至已預熱的2 mL含體積分數(shù)10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)液中,輕輕吹勻、800 r/min離心3 min,棄去上清液,再加新培養(yǎng)液吹勻后取適量轉至細胞培養(yǎng)皿中,在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

當培養(yǎng)皿中細胞密度達到80%～90%時,棄去培養(yǎng)基,用胰酶輕輕消化后加入新培養(yǎng)液輕輕吹打,直至細胞完全吹落,800 r/min離心3 min、棄上清液,重新加入新培養(yǎng)液,輕輕吹勻后取適量細胞懸液加入培養(yǎng)皿中,輕輕振勻后于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經過2～3代傳代可用于正常實驗操作。

1.3.5.2 藥物濃度篩選

將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞重懸后稀釋至5×104個/mL,向96孔板內每孔加入100 μL細胞懸液,培養(yǎng)24 h,每孔再加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液100 μL,每組設5個重復,繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后對各實驗組進行CCK-8細胞毒性檢測。在450 nm波長下測定各孔的吸光值(A),以只含培養(yǎng)液的孔為調零孔,以含細胞、不含藥物的孔為空白對照孔,以含不同濃度藥物的孔為測試孔,記錄結果并計算細胞存活率。存活率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.5.3 抗炎活性測定

向6孔板內每孔加入處于對數(shù)生長期的細胞懸液2～3 mL,每孔3×105個細胞,每組設3個重復,培養(yǎng)24 h之后,棄去原培養(yǎng)液,每孔加入含不同藥物與1 μg/mL LPS的培養(yǎng)液2～3 mL,設置對照組及模型組,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后先收集上清液,再用生理鹽水清洗每孔2次,再加入0.5 mL細胞裂解液收集細胞,于-80 ℃保存?zhèn)溆肹28-29]。

根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清液中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度；根據(jù)培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒說明書提取RAW264.7細胞的RNA,再參照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄。Q-PCR引物合成由擎科生物公司完成,添加適量引物與模板,按照Bio-rad SsoAdvancedTMUniversal SYBR? Green Supermix說明書進行q-PCR實驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 提取分離結果與分析

蒲公英根醇提物經大孔樹脂柱層析、依次用蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇洗脫(即柱1)后所得的3個組分依次標記為PGYG1-D0、PGYG1-D30和PGYG1-D70；醇提物經大孔吸附樹脂柱層析、依次用蒸餾水、70%乙醇洗脫(即柱2)后所得的2個組分依次標記為PGYG2-D0和PGYG2-D70,結果見表1。大孔吸附樹脂柱分離后水洗脫部位的得率較高,可達16%以上,而且該部位多糖質量分數(shù)相對較高,接近6%；乙醇洗脫部位(PGYG1-D30、PGYG1-D70和PGYG2-D70)得率較低,尤其是當乙醇梯度洗脫時,各部分得率更低,不超過1%；而且,乙醇洗脫部位的總黃酮質量分數(shù)相對較高,能達到45%以上。

表1 蒲公英根各組分的得率與總黃酮、多糖質量分數(shù)Table 1 Yields and mass fractions of different components from dandelion root

2.2 體外抑菌檢測結果與分析

2.2.1 MIC檢測結果與分析

5種待測樣品對9種供試菌(人、畜禽病原菌)的MIC檢測結果見表2。5種待測樣品對9種供試菌的抑菌效果均比陽性藥物蒲公英顆粒的抑菌效果好,而且乙醇洗脫部位的抑菌效果普遍比水洗脫部位抑菌效果好(MIC值小),而且洗脫部位極性越小,抑菌效果越好。綜合考慮各洗脫相的得率、工藝和活性,可以發(fā)現(xiàn)提取后用水和70%乙醇依次洗脫的工藝不僅簡單,而且所得的乙醇洗脫組分(PGYG2-D70)得率高、抗菌效果好,9種供試菌中8種供試菌MIC可達1.95 mg/mL。

表2 蒲公英根各組分對9種供試菌的MIC檢測結果 單位：mg/mL

2.2.2 MBC檢測結果與分析

5種待測樣品對9種供試菌的MBC檢測結果見表3。乙醇洗脫部位對9種供試菌的殺菌效果普遍比水洗脫部位和陽性藥物蒲公英顆粒的殺菌效果好(MBC值小)。其中,水洗脫后用70%乙醇洗脫所得部位的殺菌效果最好,MBC均為31.25 mg/mL,因此可以將該部位作為蒲公英根的抗菌活性組分。

表3 蒲公英根各組分對9種供試菌的MBC檢測結果 單位：mg/mL

2.3 體外抗炎檢測結果與分析

2.3.1 測試濃度篩選結果與分析

參考抗菌活性結果,選取水和70%乙醇依次洗脫的2個部位(即PGYG2-D0和PGYG2-D70)作為抗炎活性評價的考察對象。分別設置不同質量濃度(0.25、0.5、1、2、4 mg/mL)同時處理小鼠巨噬細胞RAW 264.7,24 h后檢測各組細胞的生長情況,如圖1所示。2個組分在0.25 mg/mL時對巨噬細胞RAW 264.7的生長無影響,所以選擇該濃度作為處理濃度,考察2個組分對巨噬細胞RAW264.7炎癥模型的作用情況。

圖1 不同質量濃度蒲公英根組分對細胞RAW264.7存活率的影響Fig.1 Survival rate of RAW264.7 cells treated by the components from dandelion root at different concentrations

2.3.2 炎癥因子濃度檢測結果與分析

蒲公英根2個待測組分對巨噬細胞RAW264.7的炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α濃度的影響見圖2。相對于模型組而言,蒲公英根2個待測組分對炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌均有顯著性抑制作用(P<0.05),而且,PGYG2-D70組分的抑制作用比PGYG2-D0的抑制作用更為顯著(P<0.05)。

2.3.3 炎癥因子轉錄水平結果與分析

2個待測組分對巨噬細胞RAW264.7的炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α轉錄水平的影響見圖3。相對于模型組而言,2個待測組分對炎癥因子IL-6和TNF-α的轉錄水平均有顯著性抑制作用(P<0.05),而且這2個組分之間對IL-6的轉錄水平抑制存在顯著性差異(P<0.05)；PGYG2-D70對炎癥因子IL-1β的轉錄水平有顯著性抑制作用(P<0.05)。因此,也可以將70%乙醇洗脫部位作為蒲公英根的抗炎活性組分。

a-IL-6;b-IL-1β;c-TNF-α圖2 蒲公英根不同組分對RAW264.7炎癥因子濃度的影響Fig.2 Concentrations of inflammatory cytokines treated by different components from dandelion root 注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05),(下同)

a-IL-6;b-IL-1β;c-TNF-α圖3 蒲公英根不同組分對RAW264.7炎癥因子轉錄水平的影響Fig.3 Transcription levels of inflammatory cytokines treated by different components from dandelion root

3 結論

本研究在對蒲公英根進行醇提的基礎上,通過大孔吸附樹脂柱分離和活性評價得到了蒲公英根的高效抗菌抗炎活性組分。最終建立的提取分離工藝為：70%乙醇回流提取后,用D101大孔吸附樹脂進行柱分離,水洗脫之后的70%乙醇洗脫部位為蒲公英根的抗菌抗炎活性組分。該組分對9種人、畜禽常見病原菌具有顯著的抑菌和殺菌作用,MIC和MBC分別可達1.95和31.25 mg/mL；對LPS誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥模型的炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的濃度和轉錄水平均有顯著抑制作用。從初步的成分分析可以發(fā)現(xiàn),該組分黃酮含量相對較高,這也為蒲公英根的進一步分離純化、生物活性及其機制研究以及開發(fā)具有潛力的功能性食品、藥品等提供了依據(jù)。