肖懷秋,李玉珍,林親錄,趙謀明,周全,趙一純

1(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院,湖南 株洲,412000) 2(中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙,410004) 3(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州,510000)

食源性致病菌是指在食品加工和流通過(guò)程中引入的致病病原菌,大腸桿菌(Escherichiacoli)是最常見(jiàn)的低感染劑量高致病性腸道病原體,可引起腹瀉和出血性結(jié)腸炎等疾病,是食品公共衛(wèi)生領(lǐng)域的嚴(yán)重威脅[1]。曹鐵紅等[2]監(jiān)測(cè)通化區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)銷(xiāo)售肉與肉制品食源性致病菌污染狀況發(fā)現(xiàn),E.coli檢出率為18.37%;國(guó)譯丹等[3]監(jiān)測(cè)云南省外賣(mài)餐飲微生物污染狀況發(fā)現(xiàn),E.coli檢出率為16.48%;張艷等[4]監(jiān)測(cè)南充市熟肉制品微生物污染情況發(fā)現(xiàn),E.coli檢出率為46.4%。由此可見(jiàn),食品加工與流通環(huán)節(jié)易感染大腸桿菌并產(chǎn)生潛在安全風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)熱處理殺菌方式會(huì)對(duì)食品熱敏性成分和色香味產(chǎn)生不良影響,人工防腐劑由于化學(xué)品使用量和使用條件的限制,應(yīng)用也受限?？咕臒岱€(wěn)定性好、抗菌活性高、生物毒副作用少且不易產(chǎn)生耐藥性,可作為食品防腐保鮮劑使用[1]。當(dāng)前抗菌肽研究以膜損傷效應(yīng)靶點(diǎn)居多,主要是因?yàn)樵摪悬c(diǎn)可解決現(xiàn)有抗生素難以徹底殺滅處于減速生長(zhǎng)期與休眠期致病病原體的不足,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相對(duì)保守且具備快速殺菌效應(yīng),且真核與原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異使得抗菌肽具有較好細(xì)胞選擇性[5]。目前,抗菌劑以蛋白質(zhì)酶解制備的抗菌多肽研究較多[6-8],金屬抗菌肽研究鮮見(jiàn),金屬抗菌肽是含有金屬離子的新型抗菌肽,除可以起到良好抗菌和抗氧化等生物活性外,還能為食品提供多肽營(yíng)養(yǎng)與金屬離子,具有很好的研究?jī)r(jià)值。課題組發(fā)現(xiàn),金屬抗菌肽SIF4對(duì)金黃色葡萄球菌有良好抑菌活性[9],在模擬食品體系中能保持較好抑菌穩(wěn)定性[10],但抑菌機(jī)理尚不明確。探究SIF4對(duì)大腸桿菌的抑菌機(jī)理可為其在食源性大腸桿菌生物抑制的理論與應(yīng)用研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

1.1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40SAI蒸汽滅菌鍋,上海博迅公司；Sizer2000電位儀,Malvern；BBS-SSC超凈工作臺(tái),濟(jì)南騰覽公司；DH-360恒溫培養(yǎng)箱,北京科偉公司；UV—2500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本Shimadzu公司；TAS-990原子吸收光譜儀,北京普析公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)測(cè)定

準(zhǔn)確吸取0.05×10-3～1.0 mg/L的SIF4溶液1.0 mL 加入培養(yǎng)皿中,倒入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基并混勻,凝固后準(zhǔn)確吸取0.1 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期E.coli(6×108CFU/mL)涂布于培養(yǎng)基表面,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況,菌落被完全抑制的最低濃度為MIC。

1.2.2 大腸桿菌抑菌生長(zhǎng)曲線繪制

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液于6 500 r/min離心10 min,菌體用10 mmol/L PBS(pH 7.4,下同)洗滌3次以除去殘留培養(yǎng)基和代謝物,PBS重新懸浮菌體使OD600 nm=0.5,加入SIF4使終質(zhì)量濃度分別為0.2 mg/L(1/2 MIC)、0.4 mg/L(MIC)和0.8 mg/L(2 MIC),37 ℃、130 r/min培養(yǎng)24 h,間隔2 h取樣測(cè)定OD600 nm,以未加SIF4的PBS組為對(duì)照組。

1.2.3 細(xì)胞壁通透性的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液6 500 r/min離心10 min,菌體用PBS沖洗3次并重懸(OD600 nm=0.5)。取重懸液50 mL加入SIF4使終濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC,未加SIF4為對(duì)照組。所有試驗(yàn)組37 ℃、130 r/min溫育3 h,間隔0.5 h吸取5 mL菌懸液于6 500 r/min離心10 min,取上清液與0.5 mL 1 g/L PNPP溶液混勻,37 ℃暗處理30 min,加入0.2 mL 1 mol/L NaOH終止反應(yīng),測(cè)定OD405 nm值[11]。

1.2.4 胞內(nèi)K+泄露的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液6 500 r/min離心10 min,用無(wú)菌去離子水洗滌菌體3次并重懸(OD600 nm=0.5),加入SIF4使終濃度為1/2 MIC、MIC和2 MIC,37 ℃溫育3 h,間隔30 min取樣,10 000 r/min離心10 min,測(cè)定上清液K+濃度,未加SIF4為陰性對(duì)照,Triton X-100(100 mg/L,下同)為陽(yáng)性對(duì)照[12]。

1.2.5 胞內(nèi)生物大分子泄露的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液于6 500 r/min離心10 min,菌體用PBS洗滌3次并重懸(OD600 nm=0.5),加入SIF4使終濃度為1/2 MIC、MIC和2 MIC,37 ℃溫育5 h,間隔1 h取培養(yǎng)液5 mL,6 500 r/min離心10 min,上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾并測(cè)定OD280 nm和OD260 nm。以PBS組和Triton X-100組為陰性和陽(yáng)性對(duì)照[13]。

1.2.6 細(xì)胞表面疏水性的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液于6 500 r/min離心10 min,PBS洗滌菌體3次并用0.1 mol/L KNO3溶液(pH 6.2)重懸(OD600 nm=0.5),加入SIF4使終濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC,未加SIF4為對(duì)照組,37 ℃、130 r/min培養(yǎng)30 min后取出測(cè)定OD600 nm(A0)；取SIF4與菌體混懸液4.8 mL加入0.2 mL十六烷并充分混勻,室溫靜置30 min至完全分層后吸取水相測(cè)定OD600 nm(A1)[14]。表面疏水性用細(xì)菌吸附率(%)表示,按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.2.7 細(xì)胞膜通透性的測(cè)定

1.2.8 細(xì)胞表面電位的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液于6 500 r/min離心10 min,用無(wú)菌超純水洗滌3次并重懸(OD600 nm為0.2～0.3),加SIF4至50 mL菌懸液中使終濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC,37 ℃溫育30 min,6 500 r/min離心10 min,菌體用無(wú)菌超純水重懸(OD600 nm=0.05),室溫下測(cè)定細(xì)胞表面電位。以無(wú)菌超純水組和Triton X-100組為陰性與陽(yáng)性對(duì)照[15]。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)結(jié)果以表示(n=3),僅進(jìn)行組間均數(shù)差異多重比較,采用SPSS 25.0進(jìn)行單因素ANOVA分析,方差齊性時(shí)采用最小顯著差異法,非齊性時(shí)用塔姆黑尼T2法。

2 結(jié)果與分析

2.1 金屬抗菌肽SIF4最小抑菌濃度測(cè)定

SIF4對(duì)大腸桿菌的抑制效果如表1所示。對(duì)照組菌落數(shù)較多,SIF4濃度在0.05～0.3 mg/L時(shí),菌落數(shù)隨SIF4濃度增加呈遞減趨勢(shì),SIF4為0.4 mg/L或更高時(shí)未發(fā)現(xiàn)菌落生長(zhǎng),因此,SIF4對(duì)大腸桿菌的MIC為0.4 mg/L。

表1 SIF4對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)抑制的影響Table 1 Inhibitory effect of SIF4 on the growth of E.coli

2.2 金屬抗菌肽SIF4對(duì)大腸桿菌抑菌生長(zhǎng)的影響

SIF4對(duì)大腸桿菌抑菌曲線如圖1所示。由圖1可看出,對(duì)照組菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為10～12 h,16 h后進(jìn)入衰亡期；1/2 MIC組培養(yǎng)14 h后進(jìn)入衰亡期,比對(duì)照組提前約2 h；MIC組和2 MIC組培養(yǎng)12 h后進(jìn)入衰亡期,菌體密度與對(duì)照組和1/2 MIC相比有顯著降低,衰亡期后細(xì)胞凋亡速度明顯快于對(duì)照組和1/2 MIC組。SIF4處理后菌體穩(wěn)定期與衰亡期均有不同程度提前,可誘導(dǎo)菌體提前凋亡。

圖1 SIF4對(duì)大腸桿菌的抑菌曲線Fig.1 Inhibitory curve of SIF4 against E.coli

2.3 金屬抗菌肽SIF4對(duì)細(xì)胞壁通透性的影響

堿性磷酸酶是位于細(xì)胞周質(zhì)空間的胞內(nèi)非特異性磷酸單酯酶,是磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移、生物大分子合成及細(xì)胞分化等關(guān)鍵酶,可調(diào)控胞內(nèi)Ca2+,細(xì)胞壁受損時(shí)胞外可檢測(cè)到該酶,是細(xì)胞壁通透性的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[16]。SIF4對(duì)細(xì)胞壁通透性影響如圖2所示。

圖2 SIF4對(duì)細(xì)胞壁通透性的影響Fig.2 Effect of SIF4 on cell wall permeability 注：字母相同者表示差異不顯著(P>0.05),字母不同者表示 差異顯著(P<0.05)(下同)

試驗(yàn)組與對(duì)照組均存在顯著差異(P<0.05)。溫育0.5 h時(shí),1/2 MIC、MIC和2MIC組間差異不顯著,可能是由于溫育30 min內(nèi)抗菌肽處于膜吸附階段；溫育1 h后,各試驗(yàn)組間均存在顯著差異(P<0.05),細(xì)胞壁通透性與SIF4濃度和溫育時(shí)間呈正相關(guān)。SIF4對(duì)細(xì)胞壁的損傷可能是由于金屬抗菌肽SIF4結(jié)構(gòu)中的Fe2+能取代細(xì)胞壁表面Mg2+,或與細(xì)胞壁帶負(fù)電荷脂多糖結(jié)合,或結(jié)合到某特定負(fù)電荷區(qū)域使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變并使通透性增強(qiáng)[17],與李婷等[18]的結(jié)果一致。

2.4 金屬抗菌肽SIF4對(duì)胞內(nèi)K+泄露的影響

細(xì)胞膜受損后可使胞內(nèi)離子泄露并引起代謝紊亂,K+是離子泄漏的典型代表,小分子電解質(zhì)比核酸與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)優(yōu)先泄露[19]。SIF4對(duì)胞內(nèi)K+泄露的影響如圖3所示。

圖3 SIF4對(duì)胞內(nèi)K+泄露的影響Fig.3 Effect of SIF4 on intracellular K+ leakage

試驗(yàn)組與對(duì)照組均有顯著差異(P<0.05),對(duì)照組胞外僅能檢測(cè)到極低濃度K+。胞內(nèi)K+泄露隨SIF4濃度升高和溫育時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì),各試驗(yàn)組胞內(nèi)K+泄露有顯著差異(P<0.05),與唐文婷[12]的結(jié)果一致。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),2 MIC組與Triton X-100組差異不顯著,表明SIF4在2 MIC(0.8 mg/L)時(shí)與Triton X-100對(duì)胞內(nèi)K+泄露影響基本相同。細(xì)胞膜受損可破壞細(xì)胞膜K+離子通道并影響Na+-K+-ATP酶活性,使基于細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的代謝無(wú)法完成并誘導(dǎo)細(xì)胞提前程序性凋亡。

2.5 金屬抗菌肽SIF4對(duì)胞內(nèi)生物大分子泄露影響

a-核酸；b-蛋白質(zhì)圖4 SIF4對(duì)胞內(nèi)生物大分子泄露的影響Fig.4 Effect of SIF4 on intracellular macromolecular leakage

細(xì)胞膜受損除引起胞內(nèi)離子與小分子物質(zhì)泄漏外,還會(huì)誘導(dǎo)胞內(nèi)核酸與蛋白質(zhì)等生物大分子泄露,核酸與蛋白質(zhì)分別在260和280 nm處有特征性紫外吸收,測(cè)定這2處波長(zhǎng)光吸收值可監(jiān)測(cè)胞內(nèi)生物大分子泄露狀態(tài)[20]。SIF4對(duì)胞內(nèi)生物大分子泄露影響如圖4所示。溫育1 h時(shí),1/2 MIC組與對(duì)照組無(wú)顯著差異,可能是由于溫育60 min內(nèi)主要為膜吸附階段,并未引發(fā)細(xì)胞膜受損,溫育2 h后,試驗(yàn)組與對(duì)照組均存在顯著差異(P<0.05)。隨著SIF4濃度升高與溫育時(shí)間延長(zhǎng),胞內(nèi)生物大分子泄露呈遞增趨勢(shì),表明SIF4能破壞細(xì)胞膜并增強(qiáng)膜滲透性,推斷細(xì)胞膜可能是金屬抗菌肽SIF4抗菌效應(yīng)靶點(diǎn),與戴錦銘[21]的結(jié)果一致。研究還發(fā)現(xiàn),2 MIC組與Triton X-100組差異均不顯著,表明2 MIC組對(duì)細(xì)胞膜損傷與Triton X-100相似,Triton X-100為雙親和結(jié)構(gòu),可將膜蛋白解離,對(duì)細(xì)胞膜破壞性比較強(qiáng)[22]。

2.6 金屬抗菌肽SIF4對(duì)細(xì)胞表面疏水性的影響

細(xì)胞表面疏水性是影響細(xì)菌非特異性粘附到其它物質(zhì)或界面的重要因素[23]。正十六烷是一種對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷的疏水性溶劑,對(duì)菌體吸附率改變可表征細(xì)胞表面疏水性變化。SIF4對(duì)細(xì)胞表面疏水性影響如表2所示。

表2 SIF4對(duì)細(xì)胞表面疏水性的影響 單位：%

試驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)。表面疏水性隨SIF4濃度增加顯著遞增(P<0.05),可能是由于金屬抗菌肽結(jié)構(gòu)中的Fe2+通過(guò)靜電作用吸附在帶負(fù)電荷細(xì)菌表面,使疏水域暴露并增強(qiáng)表面疏水性。大腸桿菌等電點(diǎn)pI為4.4,試驗(yàn)所用KNO3緩沖液pH值(pH 6.2)高于大腸桿菌pI,細(xì)菌帶負(fù)電荷,有助于抗菌肽與菌體表面靜電吸附,吸引電負(fù)性基團(tuán)造成重排并增強(qiáng)表面疏水性。表面疏水性增強(qiáng)可誘導(dǎo)細(xì)胞膜混亂,疏水性越強(qiáng)膜損傷越嚴(yán)重[24],與LEE等[25]結(jié)果一致,但與趙清風(fēng)等[26]研究相悖,可能是由于Ag+與SIF4抗菌機(jī)制不同。

2.7 金屬抗菌肽SIF4對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

大腸桿菌在以乳糖為唯一碳源時(shí)可誘導(dǎo)生成β-半乳糖苷酶,細(xì)胞膜受損后,胞外ONPG可滲透入胞內(nèi)并被水解為半乳糖和鄰-硝基苯酚(o-nitrophenol,ONP),ONP在415 nm處有特征性紫外吸收。一定濃度范圍時(shí),ONP吸光值與細(xì)胞膜通透性成正比,可作為細(xì)胞膜通透性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[27]。SIF4對(duì)細(xì)胞膜通透性影響如圖5所示。

圖5 SIF4對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響Fig.5 Effect of SIF4 on CMP

溫育1～3 h時(shí),1/2 MIC組與對(duì)照組無(wú)顯著差異,可能是由于抗菌肽濃度較低,2 MIC組和MIC組及1/2 MIC有顯著差異(P<0.05),推測(cè)細(xì)胞膜損傷可能以“毯式模型”進(jìn)行,SIF4疏水端通過(guò)靜電吸附聚集在細(xì)胞膜表面形成“毯式”結(jié)構(gòu),當(dāng)集聚在細(xì)胞膜表面抗菌肽濃度達(dá)到閾值后,可由“毯式模型”破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并造成細(xì)胞膜瞬間坍塌而引起膜破裂,作用于G-菌的抗菌肽常以“毯式模型”方式進(jìn)行[5]。溫育4～5 h,1/2 MIC與對(duì)照組也存在顯著差異(P<0.05),可能是由于溫育時(shí)間較長(zhǎng)時(shí),SIF4逐步靜電吸附到細(xì)胞膜表面并達(dá)到抗菌閾值[6]。研究還發(fā)現(xiàn),溫育1 h后,MIC和2 MIC組與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05),可能是由于MIC或2 MIC濃度時(shí),靜電吸附并聚集在膜上抗菌肽可很快達(dá)到抗菌閾值[6]。

2.8 金屬抗菌肽SIF4對(duì)細(xì)胞表面zeta電位影響

表面電位絕對(duì)值越小菌體越易發(fā)生聚沉和黏附,常用zeta電位表征[28]。SIF4對(duì)細(xì)胞表面zeta電位影響如圖6所示。

圖6 SIF4對(duì)細(xì)胞表面zeta電位的影響Fig.6 Effect of SIF4 on cell surface zeta potential

由圖6可知,試驗(yàn)組zeta電位與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)；細(xì)胞表面zeta電位(y)與SIF4濃度(x)呈負(fù)相關(guān)(y=24.06x-31.59,R2=0.907 4)。通常情況下,zeta電位0～±5 mV時(shí)菌體易凝聚,±10～±30 mV不穩(wěn)定,±30～±40 mV或更大有良好穩(wěn)定性[29]。1/2 MIC組zeta電位為(-27.28±1.19)mV,菌體開(kāi)始表現(xiàn)不穩(wěn)定,MIC組和2 MIC組zeta電位分別上升至(-18.82±1.20)mV和(-13.66±1.26)mV,表明菌體穩(wěn)定性變差,2 MIC組與Triton X-100組差異不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞壁(膜)結(jié)構(gòu)的完整對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)與胞內(nèi)環(huán)境有重要作用,受損時(shí)可引起細(xì)胞通透性增強(qiáng)甚至出現(xiàn)不可逆孔洞,造成胞內(nèi)離子及生物大分子物質(zhì)泄露并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),SIF4對(duì)大腸桿菌有較好抑菌活性,可破壞其細(xì)胞壁(膜)結(jié)構(gòu)并引起胞內(nèi)K+和生物大分子泄露,使菌體代謝紊亂并誘導(dǎo)菌體凋亡。SIF4處理后能增強(qiáng)表面疏水性,引起細(xì)胞膜混亂并導(dǎo)致膜受損,還能影響細(xì)胞表面zeta電位,使菌體聚沉和黏附,推測(cè)大腸桿菌細(xì)胞膜損傷以“毯式模型”進(jìn)行。研究認(rèn)為,大腸桿菌菌體表面帶負(fù)電荷,SIF4為陽(yáng)離子抗菌肽[9],可通過(guò)靜電吸附聚集在菌體表面并干擾膜電位,以“毯式模型”破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),造成細(xì)胞聚沉和代謝紊亂,誘導(dǎo)菌體凋亡,SIF4可作為一種潛在的新型食品抗菌劑用于致病性大腸桿菌的生物抑制。