王彬，武亭宇，王博龍

丹毒俗稱“流火”，是由A族B型鏈球菌引起的皮膚及皮下組織急性炎癥，常表現(xiàn)為分界清晰的局限性紅腫熱痛，好發(fā)于顏面及下肢［1］.宋代陳言《三因極一病證方論》載“丹毒之病，由心實(shí)熱也.心生血，主于脈，血熱肌浮，陰滯于陽，即發(fā)丹毒”［2］.目前，臨床上治療丹毒常用青霉素類或頭孢類抗生素，雖然效果較為顯著，但在夏季易復(fù)發(fā)，且用藥療程較長，易產(chǎn)生耐藥性和菌群失調(diào)，導(dǎo)致出現(xiàn)腹痛腹瀉、免疫功能紊亂等相應(yīng)癥狀，給患者帶來了很大的心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［3-4］.

陳世鐸在《洞天奧旨·骨癰》云：“內(nèi)用五神湯……利其濕熱而又不耗其氣血.”五神湯中牛膝、車前子利水消腫，茯苓淡滲而安神，紫花地丁、金銀花功擅清熱解毒.尤其是車前子甘寒性降、甘而滑利、寒而清熱、性專降泄，以防丹毒傳變；與金銀花相伍，增強(qiáng)金銀花解毒清熱之力；與茯苓相配，上下相合，交通心腎，開全身之腠理，解丹毒之濕熱；與牛膝同用，利水消腫兼能溫腎化氣，防諸藥寒涼太過而傷正是為使藥，牛膝又性善“引諸藥下行”，亦能導(dǎo)丹毒之熱下泄，引瘀血下行，以降“上亢之陽、上 炎 之火、上 逆 之血”［5］.此五 藥相合，清熱解毒與利水消腫并舉［6］，而研究表明清熱解毒法具有良好的抗菌功能［7］，可有效治療丹毒，為五神湯治療丹毒奠定了基礎(chǔ).

由于中藥及其復(fù)方成分復(fù)雜，治療疾病的作用機(jī)制不明確，因此運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將藥物作用網(wǎng)絡(luò)與生物網(wǎng)絡(luò)整合在一起，分析藥物在此網(wǎng)絡(luò)中與特定節(jié)點(diǎn)或模塊的相互作用關(guān)系，從而解析藥物和機(jī)體相互作用的科學(xué)機(jī)理［8］，有助于從整體觀角度認(rèn)識藥物與疾病間的相互作用［9］.本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討五神湯治療丹毒的作用機(jī)制，以期為五神湯治療丹毒提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 五神湯活性成分及靶點(diǎn)篩選

本研究以五神湯組方中藥為研究對象，在TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫 中，以“金 銀 花”“紫 花 地 丁”“茯 苓”“車 前子”“牛膝”為關(guān)鍵詞，按照OB≥30%、DL≥0.18篩選其活性成分及作用的靶蛋白，再運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）將靶蛋白統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因名稱保存；利用Chemical-Book數(shù)據(jù)庫（https：//www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx）查找活性成分結(jié)構(gòu)式，保存.mol格式文件后導(dǎo)入Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）數(shù)據(jù)庫中，利用結(jié)構(gòu)相似性預(yù)測靶點(diǎn)，將以上兩個來源的靶基因合并，構(gòu)建五神湯靶基因匯總.

1.2 丹毒靶點(diǎn)集合構(gòu)建

以“erysipelas”“inflammatory disease with redness of skin”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https：//www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫中收集匯總丹毒相關(guān)靶點(diǎn)，篩除重復(fù)后合并，構(gòu)建丹毒靶點(diǎn)集合.

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心靶點(diǎn)篩選

將篩選的五神湯靶點(diǎn)與丹毒靶點(diǎn)通過微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）取交集得到共同靶點(diǎn)，再將共同靶點(diǎn)上傳至STRING平臺（https：//string/db.org/），構(gòu)建共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇“Multiple Proteins”模式，蛋白種屬設(shè)為“Home Sapiens”，設(shè)置最小互作需求得分（Minimum Required Interaction Score）為0.700，其他參數(shù)保持默認(rèn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型.然后將所得文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，利用插件CytoNCA計算每個節(jié)點(diǎn)的打分，計算PPI網(wǎng)絡(luò)的3個拓?fù)鋮?shù)，即自由度（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality，BC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）.篩選標(biāo)準(zhǔn)：①DC值大于所有節(jié)點(diǎn)DC值中位數(shù)2倍的重要節(jié)點(diǎn)；②其他2個指標(biāo)大于所有節(jié)點(diǎn)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，即得到核心靶點(diǎn).

1.4 GO功能分析和KEGG通路富集

將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID平臺（https：//david.ncifcrf.gov）進(jìn)行GO功能分析與KEGG通路富集，物種與背景設(shè)置均為“Homo sapiens”（智人），獲得GO功能分析及KEGG通路富集結(jié)果（P＜0.05），再通過微生信平臺對GO功能分析和KEGG通路富集進(jìn)行可視化.

1.5 關(guān)鍵成分-核心靶點(diǎn)的分子對接驗證

為驗證篩選出的五神湯治療丹毒核心靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，將關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接.在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下載核心靶蛋白結(jié)構(gòu)；在PubChem數(shù)據(jù) 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載關(guān)鍵成分的結(jié)構(gòu)，使用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對接.

2 結(jié)果

2.1 五神湯-丹毒核心靶點(diǎn)的獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction平臺篩選收集五神湯中5味藥材的活性成分及作用靶點(diǎn)，篩選得到五神湯活性成分共21種，如表1所示，作用靶點(diǎn)共1 262個，刪除重復(fù)值后得到301個靶點(diǎn)；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取疾病靶點(diǎn)992個，兩者取交集得到89個共同靶點(diǎn).

表1 活性成分基本信息

2.2 五神湯-丹毒靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將89個共同靶點(diǎn)上傳STRING平臺，將結(jié)果保存為.tsv格式，再導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建五神湯-丹毒靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖1.再運(yùn)用其“Network Analysis”插件進(jìn)行拓?fù)浞治龊Y選核心靶點(diǎn)，篩選策略見圖2，篩得核心靶點(diǎn)21個.

圖1 五神湯-丹毒靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 核心靶點(diǎn)的篩選策略圖

2.3 “活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建如圖3所示“活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖.該圖包括42個節(jié)點(diǎn)和93條邊，節(jié)點(diǎn)（Node）代表有效活性成分或靶點(diǎn)、邊（Edge）代表節(jié)點(diǎn)間的相互關(guān)系.Degree較高的化合物分別是槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素、β-胡蘿卜素等，將度值最高的槲皮素定義為關(guān)鍵成分；Degree較高的靶點(diǎn) 分 別 是PTGS2、ESR1、NOS3、AKT1、TNF、VEGFA.本研究通過自由度（Degree）的大小來分析網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)的自由度值越大顏色越深，其在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要.

圖3 “活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 核心靶點(diǎn)GO功能分析和KEGG通路富集

將核心靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集，得到GO功能分析條目428條，其中，生物學(xué)過程（Biological Process，BP）389條，主要涉及T細(xì)胞增殖的正調(diào)控、血小板脫顆粒、表皮生長、肽基酪氨酸磷酸化、細(xì)胞對藥物的反應(yīng)等；細(xì)胞成分（Cell Component，CC）16條，涉及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外間隙、蛋白質(zhì)復(fù)合物、受體復(fù)合物等；分子功能（Molecular Function，MF）23條，與蛋白磷酸酶、染色質(zhì)、血紅素、細(xì)胞因子活性、血小板衍生生長因子受體結(jié)合等相關(guān).均取排名靠前的10個條目作圖（圖4）.

圖4 核心靶點(diǎn)GO功能分析

由圖5可知，五神湯參與的通路主要有T細(xì)胞受體信號通路、HIF-1信號通路、PI3K/Akt信號通路、TNF信號通路、Toll樣信號通路等，其中，P值最小、目標(biāo)基因最多的是PI3K/Akt信號通路，富集因子最高的是HIF-1信號通路.

圖5 核心靶點(diǎn)KEGG通路富集

2.5 關(guān)鍵成分-核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

通過Cytoscape 3.7.2計算PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)，將關(guān)鍵成分槲皮素與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接.由PDB數(shù)據(jù)庫得到蛋白ID編號為3sz1（VEGFA）、1x7j（ESR1）、5ii2（PTGS2）、1x7r（NOS3）、4eh3（TNF），利用Pymol軟件對排名前三的結(jié)果進(jìn)行輸出優(yōu)化（圖6）.通常情況下，結(jié)合能越低，關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)之間親和力越高，表2結(jié)果表明，關(guān)鍵成分槲皮素與核心靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的親和力.

圖6 槲皮素-核心蛋白對接模式

表2 槲皮素與核心靶點(diǎn)對接情況

3 討論與結(jié)論

3.1 五神湯治療丹毒核心靶點(diǎn)分析

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)對五神湯治療丹毒的機(jī)制進(jìn)行研究，篩選獲得五神湯治療丹毒的核心靶點(diǎn)有VEGFA、ESR1、PTGS2、NOS3、TNF等.其中，VEGFA具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管形成等作用，也是組織生長和修復(fù)所必需的［10］.VEGFA的表達(dá)下調(diào)可明顯減輕炎癥并促進(jìn)血管生成［11］.TNF不僅是典型的促炎因子，還能誘導(dǎo)VEGFA的合成，研究證實(shí)其在丹毒病情進(jìn)展中發(fā)揮核心作用［11］.丹毒病灶局部缺氧潰爛等除了炎性反應(yīng)外，還與血管功能異常相關(guān).PTGS2是丹毒生成的關(guān)鍵基因之一［12］，當(dāng)受到細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、缺氧等刺激可迅速上調(diào)，主要產(chǎn)物前列腺素具有促進(jìn)血管生成等生物學(xué)活性.人血管內(nèi)皮型NOS3誘導(dǎo)釋放的內(nèi)皮型NO對促進(jìn)血管舒張、參與血管生成調(diào)控發(fā)揮重要作用，NOS3基因表達(dá)異常，導(dǎo)致生成NO的量不穩(wěn)定，造成血管內(nèi)皮功能紊亂，病理狀態(tài)下NO合成減少導(dǎo)致內(nèi)皮素-1等縮血管物質(zhì)相對占優(yōu)勢、血管處于收縮及缺氧狀態(tài)，局部皮膚細(xì)胞迅速壞死，影響人體的免疫系統(tǒng)［13］.因此，VEGFA、ESR1、PTGS2、NOS3、TNF等靶點(diǎn)在炎性反應(yīng)及血管內(nèi)皮損傷中具有調(diào)節(jié)作用，決定了它們成為五神湯治療丹毒的核心靶點(diǎn).

3.2 五神湯治療丹毒關(guān)鍵成分分析

研究表明，局部及全身炎性反應(yīng)是丹毒最主要的病理基礎(chǔ)，大量炎性因子合成分泌并形成炎性級聯(lián)反應(yīng).通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到五神湯治療丹毒的關(guān)鍵成分為槲皮素，槲皮素可以通過下調(diào)TNF-a、NF-kB等因子的表達(dá)而起到抗炎作用，從而阻止局部組織損傷、潰爛［14-15］；通過分子對接進(jìn)一步驗證了槲皮素與核心靶點(diǎn)有較高的親和力（結(jié)合能均≤-8 kcal/mol），結(jié)合位點(diǎn)均有穩(wěn)定的氫鍵和疏水鍵，構(gòu)象穩(wěn)定，其中對接最穩(wěn)定的是槲皮素與VEGFA的結(jié)合（-10.1 kcal/mol）.結(jié)果表明，五神湯關(guān)鍵成分與受體蛋白穩(wěn)定結(jié)合，可以起到治療丹毒的作用.

3.3 GO功能分析及KEGG通路富集結(jié)果

GO功能分析結(jié)果顯示，五神湯治療丹毒的21個核心靶點(diǎn)生物學(xué)過程主要涉及T細(xì)胞增殖的正調(diào)控、血小板脫顆粒、表皮生長等過程.KEGG通路富集結(jié)果表明，核心靶點(diǎn)通路主要富集在PI3K/Akt信號通路、HIF-1號通路及TNF信號通路.朱磊等［16］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)皮膚組織受到缺血-再灌注損傷時，活化的PI3K/Akt能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，介導(dǎo)皮膚損傷修復(fù)，且槲皮素可抑制PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)丹毒患者成纖維細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡.HIF-1信號通路是生物處于低氧狀態(tài)下的應(yīng)激信號通路，張哲等［17］發(fā)現(xiàn)，缺氧刺激可增加丹毒患者血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素1的合成分泌，進(jìn)而引起血管異常增生，血管滲透性增加，血管周圍組織發(fā)生水腫，導(dǎo)致丹毒形成.SI等［18］發(fā)現(xiàn)，槲皮素干預(yù)可明顯降低丹毒患者成纖維細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)，促進(jìn)丹毒患者成纖維細(xì)胞凋亡.TNF信號通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答，槲皮素可以下調(diào)TNF-α表達(dá)，從而通過TNF信號通路影響免疫平衡，減輕組織或者細(xì)胞炎癥反應(yīng)［19］.

3.4 結(jié)論

五神湯可作用于PTGS2、ESR1、NOS3、AKT1、TNF、VEGFA等核心靶點(diǎn)，調(diào)控PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路和TNF信號通路等多條信號通路，從抗炎、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、舒張內(nèi)皮血管等多個方面共同治療丹毒，具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn).