姚春陽，徐文豪，馬先強(qiáng)

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院山東濱州 256600；2.濱州市濱城區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心山東濱州 256600；3.惠民縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心山東濱州 251700）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea vrus，PEDV）可導(dǎo)致哺乳仔豬中引起嚴(yán)重的腸炎、水樣腹瀉、嘔吐、脫水直到死亡，通常稱為“冬季拉稀病”、“打水槍”，育肥豬、母豬對該病毒有抵抗力，能耐過。20 世紀(jì)70 年代，豬流行性腹瀉（PED）作為一種急性腸道傳染病首先在英國出現(xiàn)[1]，隨后，該病在捷克共和國、匈牙利、韓國、意大利、泰國、中國、美國等許多國家暴發(fā)。我國是生豬養(yǎng)殖大國，自2010 年底以來PEDV 變異株在我國各地豬群中大規(guī)模暴發(fā)流行，大量仔豬患病死亡，特別是對3 日齡之內(nèi)的仔豬病死率可達(dá)100%，給我國造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

PEDV 病毒粒子核酸為線性單股正鏈RNA，作為一種α 冠狀病毒，在糞便中病毒粒子是多形態(tài)的，趨于圓形，病毒顆粒表面有纖突，平均直徑（包括纖突）在130nm 左右，PEDV 僅在病豬小腸黏膜上皮細(xì)胞中繁殖，只有一種血清型。PEDV 基因組全長28kb左右，纖突S 蛋白、核衣殼N 蛋白、囊膜E 蛋白及膜M 蛋白是其主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中S 蛋白由1383 個(gè)氨基酸組成，在PED 的流行中，S 蛋白的S1 區(qū)常常發(fā)生變異，根據(jù)這一特征性變異可區(qū)分經(jīng)典毒株和變異毒株，并為疫苗的選擇提供理論依據(jù)。本試驗(yàn)從山東省某豬場暴發(fā)仔豬腹瀉疫病的發(fā)病豬群中采集糞便樣品，在Vero 細(xì)胞中進(jìn)行了病毒的分離、RT－PCR 鑒定及測序分析，證實(shí)所分離毒株為PEDV 變異株。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料采自山東省某豬場疑似暴發(fā)PEDV 豬群的仔豬腹瀉糞便，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞及主要試劑

Vero 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；TRIGene 總RNA 提取試劑為GeneStar 產(chǎn)品，DL2000DNA Marker、pMD18-T 載體、一步法RT-PCR 相關(guān)試劑為寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品，DNA凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司產(chǎn)品；新生牛血清為Biolological Industry 產(chǎn)品、DMEM 干粉培養(yǎng)基和胰酶為Gibco 公司產(chǎn)品、S 蛋白單克隆抗體購自韓國金諾公司；FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自Abcam 公司。

1.2 方法

1）糞便的RT-PCR 檢測糞便樣品經(jīng)無菌生理鹽水（體積比約1：5）重懸離心后取上清液，使用TRIGene 總RNA 提取試劑提取上清液中病毒核酸，使用PEDV 鑒定引物[3]（表1）對提取的核酸進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系：2X 一步法RT-PCR 試劑12.5μL，上、下游引物混合液2μL（PEDV-F 與PEDV-R 引物10μM）、提取總RNA 3μL，加入滅菌水補(bǔ)充至總體積為25uL。

反應(yīng)程序：50℃ 10min，95℃預(yù) 變 性5min；95℃變 性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30 個(gè)循環(huán)，再進(jìn)行72℃延伸5min，4℃終止反應(yīng)。

2）病毒的分離 檢測為陽性的離心上清液樣品用0.45μm 無菌濾器過濾除菌后接種于Vero 細(xì)胞，于37℃的CO2（5%）培養(yǎng)箱中恒溫恒濕培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變（CPE）。連續(xù)體外傳代3～5代。

3）分離毒株S1 基因擴(kuò)增及序列分析利用S1 基因擴(kuò)增引物[4]（表1）對分離毒株進(jìn)行S1 基因的擴(kuò)增（反應(yīng)體系和程序同1.2.1），經(jīng)膠回收后連接PMD18-T 載體，經(jīng)鑒定后送往并測序分析。

表1 引物序列及長度

4）PEDV S1 基因序列核苷酸同源性分析利用DNAstar 軟件對S1 基因測序結(jié)果進(jìn)行基因信息比對分析，與GenBank 中已上傳的國內(nèi)外部分PEDV 參考毒株S1 基因序列進(jìn)行同源性比對和遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 糞便的RT-PCR 檢測

4 份腹瀉仔豬病料處理后，提取核酸，經(jīng)RT-PCR 檢測后2 份樣本擴(kuò)增出了492bp 左右大小的目的條帶，如圖1 所示

圖1 PEDV RT-PCR 鑒定及分離毒S1 基因的擴(kuò)增

2.2 病毒的分離

病料上清液樣接種于Vero 細(xì)胞，于37℃的CO2（5%）培養(yǎng)箱中恒溫恒濕培養(yǎng)，連續(xù)體外傳代4 代后出現(xiàn)了典型的合胞體病變，呈現(xiàn)變圓、融合等現(xiàn)象（圖2b），間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)，該分離株可以與PEDV 特異性單抗發(fā)生反應(yīng)（圖2c）。收取病毒液后繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，最終獲得1 株能夠在Vero 細(xì)胞上穩(wěn)定傳代的PEDV毒株。

圖2 PEDV 分離株分離鑒定

2.3 分離毒株S1 基因擴(kuò)增及序列分析

提取分離病毒的病毒RNA，通過RT-PCR 成功擴(kuò)增出分離株S1 基因片段，大小約2376bp，與預(yù)期相符，如圖1 所示，PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果表明該P(yáng)EDV 分離株為一變異毒株，NCBI blast 分析表明該分離株與G2-b 亞群分離株同源性最高，在98.5%以上，表明分離毒株為PEDV G2-b 亞群。

3 討論

PEDV 在細(xì)胞上分離培養(yǎng)一直是研究的熱點(diǎn)問題，1988 年，Hofmann 等首次通過次通過在Vero 細(xì)胞培養(yǎng)液中添加一定濃度的胰酶成功分離出PEDV，隨后眾多國內(nèi)外學(xué)者相繼報(bào)道了成功在Vero 細(xì)胞上分離到PEDV，但分離病毒的成功率一直不高。由于PEDV 病毒屬于RNA 病毒，變異較快，傳統(tǒng)的弱毒疫苗和滅活疫苗到一定時(shí)期將不能對仔豬起到有效的保護(hù)作用。因此，快速分離和鑒定當(dāng)前流行的PEDV 毒株平臺(tái)的建立，可以輔助針對當(dāng)前流行毒株的疫苗的開發(fā)，用于PEDV 流行株的預(yù)防和控制。近幾年來，我國眾多學(xué)者在PEDV 分離平臺(tái)建設(shè)方面取得較快發(fā)展，已成功分離到眾多豬流行性腹瀉流行株，2017 年龐文靜從陜西省某養(yǎng)豬場發(fā)病仔豬病料中分離到1 株P(guān)EDV 病毒，該分離毒用Vero 細(xì)胞盲傳至8 代以后出現(xiàn)較為穩(wěn)定的細(xì)胞病變，經(jīng)RT-PCR 鑒定及測序分析，最終確定該分離毒株為PEDV，將其命名為PEDV HZ 株[5]。2018 年吳白等人從山東某暴發(fā)腹瀉的豬場腹瀉糞便中分離到一株P(guān)EDV 分離株，該分離株口服接種3 日齡仔豬后可以出現(xiàn)典型的PED 臨床癥狀[3]。2019 年唐融志等人從山東莒縣某豬場發(fā)病小豬腸道內(nèi)容物及糞便中分離到一株P(guān)EDV[4]，2020 年王曉斐等人從河南焦作某豬場哺乳仔病料中分離到PEDV[6]，2021 年王娜等人從上海地區(qū)某豬場發(fā)病仔豬病料中分離到豬流行性腹瀉流行毒株，該分離毒屬于重組毒株G2-b 亞群，與近年來強(qiáng)毒株S 蛋白的氨基酸序列較為一致[7]。本研究用實(shí)驗(yàn)室Vero e6 細(xì)胞，基于建立的RT-PCR 檢測技術(shù)建立起了PEDV 分離平臺(tái)，成功分離到了一株P(guān)EDV 流行毒株，該毒株為變異毒株，毒株的成功分離為更好的了解和掌握PEDV 在山東的流行狀況和對PED 疫苗的選擇提供數(shù)據(jù)支持和物質(zhì)基礎(chǔ)。