蘇 梅，婁雅靜，王 姍，秦引林

（江蘇柯菲平醫(yī)藥股份有限公司，江蘇 南京 210016）

動(dòng)脈硬化閉塞癥（Arteriosclerosis obliterans，ASO）是在動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的慢性動(dòng)脈閉塞疾病，多見于下肢動(dòng)脈，可引起間歇性跛行、靜息痛、潰瘍、壞疽[1-2]。ASO 多發(fā)生于50 歲以上人群，發(fā)病率約0.74%，嚴(yán)重威脅著人們的健康生活[3]，迫切需要尋找一種安全有效的治療方法。ASO 的病因尚未明確，目前普遍認(rèn)為脂質(zhì)代謝紊亂、血管內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)激活是ASO 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中最基本的病理環(huán)節(jié)，能夠促進(jìn)動(dòng)脈硬化、加劇管腔狹窄[4-6]。針對(duì)性的進(jìn)行內(nèi)皮保護(hù)、抗炎和降血脂治療是目前ASO 干預(yù)的主要靶點(diǎn)。因此，尋找一種具有內(nèi)皮保護(hù)、抗炎和降脂作用的藥物來(lái)治療ASO 可能是一種有效的策略。同時(shí)，《下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥診治指南》的中醫(yī)中藥治療指出[7]，中醫(yī)以辨證論治為主，活血化瘀法貫穿始終，配合活血化瘀藥物，以建立側(cè)支循環(huán)，改善肢體血運(yùn)。

腦脈利顆粒是以三七、黃芪、川穹、紅花、丹參、當(dāng)歸、益母草等組成的中藥復(fù)方制劑。組方中三七、姜黃、丹參、川芎、紅花等具有很好的抗炎、活血祛瘀的作用，白芍、三七、丹參、益母草等對(duì)血管內(nèi)皮有一定的保護(hù)作用，其抗炎、活血祛瘀和改善血管內(nèi)皮功能的作用與治療ASO 的策略較為契合[8]。目前腦脈利顆粒在臨床上用于治療氣虛血瘀型腦卒中病中經(jīng)絡(luò)急性期，改善半身不遂、偏身麻木、口舌歪斜、語(yǔ)言蹇澀等癥狀[8-9]。但是關(guān)于腦脈利顆粒在治療ASO 方面的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究建立了高脂飼料喂養(yǎng)加隱動(dòng)脈內(nèi)膜損傷的藥效模型，通過(guò)檢測(cè)下肢動(dòng)脈血流情況、下肢動(dòng)脈狹窄情況以及血清中血脂水平、炎癥因子和血管內(nèi)皮相關(guān)指標(biāo)來(lái)研究腦脈利顆粒治療ASO 的藥理作用，為臨床提供更有價(jià)值的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 腦脈利顆粒（ 批號(hào)：11-191010，南京柯菲平盛輝制藥有限公司）；西洛他唑片（批號(hào)：200704P，浙江大冢制藥有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)成年雄性SD 大鼠，體質(zhì)量為（200 ± 20）g，購(gòu)自杭州醫(yī)學(xué)院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。

1.1.3 試劑 甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和內(nèi)皮素（ET-1） 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

1.1.4 儀器 LEGEND Micro 21R 型微量離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世尓科技公司）；Heracell 型150i CO2培養(yǎng)箱 （美國(guó)賽默飛世尓科技公司）；CX21 型奧林巴斯顯微鏡（日本奧林巴斯醫(yī)療公司）；moorFLPI-2 型激光散斑血流成像系統(tǒng)（英國(guó)摩爾儀器）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠ASO 模型 采用高脂飲食加隱動(dòng)脈內(nèi)膜損傷的方法制作大鼠ASO 模型。SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，1%戊苯巴比妥鈉（1 mL/200 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，固定于手術(shù)臺(tái)上。每只大鼠均取左后肢消毒。從腹股溝中點(diǎn)向膝下縱行切開皮膚，分離并暴露股動(dòng)脈至膝部腘動(dòng)脈分叉處，用小動(dòng)脈夾阻斷股動(dòng)脈遠(yuǎn)、近端共1.5 ～ 2.0 cm，取0.1 mL 注射器1 支，接特制玻璃穿刺針沿股動(dòng)脈血管長(zhǎng)軸從近端刺入，將0.2 ～ 0.3 mL 注射用無(wú)菌蒸餾水緩慢注入阻斷部位血管，至血管充盈為止。5 min后取下針頭和動(dòng)脈夾，止血、縫合。同時(shí)給予維生素D3（30 萬(wàn)U/kg），右后肢肌肉注射，1 次/月，共計(jì)12 周。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 24 只成年雄性SD 大鼠被隨機(jī)分為：假手術(shù)組、ASO 模型組、腦脈利顆粒低劑量組（100 mg/kg）、腦脈利顆粒高劑量組（300 mg/kg）和西洛他唑組（10 mg/kg）。假手術(shù)組：大鼠麻醉后，切開下肢皮膚，分離并暴露隱動(dòng)脈，不進(jìn)行隱動(dòng)脈內(nèi)膜損傷手術(shù)，縫合手術(shù)傷口。每天灌胃蒸餾水1 次，喂食正?；A(chǔ)飼料12 周。ASO 模型組：大鼠麻醉后，切開下肢皮膚，分離并暴露隱動(dòng)脈，進(jìn)行隱動(dòng)脈內(nèi)膜損傷手術(shù)，縫合手術(shù)傷口，喂食高脂飼料4 周后，開始每天灌胃蒸餾水1 次，并繼續(xù)喂食高脂飼料8 周。腦脈利顆粒低劑量組：大鼠麻醉后，切開下肢皮膚，分離并暴露隱動(dòng)脈，進(jìn)行隱動(dòng)脈內(nèi)膜損傷手術(shù)，縫合手術(shù)傷口，喂食高脂飼料4 周后，開始每天灌胃腦脈利顆粒藥液1 次（給藥量：100 mg/kg），并繼續(xù)喂食高脂飼料8 周。腦脈利顆粒高劑量組：大鼠麻醉后，切開下肢皮膚，分離并暴露隱動(dòng)脈，進(jìn)行隱動(dòng)脈內(nèi)膜損傷手術(shù)，縫合手術(shù)傷口，喂食高脂飼料4周后，開始每天灌胃腦脈利顆粒藥液1 次（給藥量：300 mg/kg），并繼續(xù)喂食高脂飼料8 周。西洛他唑組：大鼠麻醉后，切開下肢皮膚，分離并暴露隱動(dòng)脈，進(jìn)行隱動(dòng)脈內(nèi)膜損傷手術(shù)，縫合手術(shù)傷口，喂食高脂飼料4 周后，開始每天灌胃西洛他唑藥液1 次（給藥量：10 mg/kg），并繼續(xù)喂食高脂飼料8 周。

1.2.3 檢測(cè)下肢動(dòng)脈平均血流速度 喂食12 周后，使用異氟烷麻醉大鼠，大鼠麻醉后，對(duì)大鼠左后肢進(jìn)行脫毛處理。完成脫毛后，使用激光散斑血流成像系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠下肢動(dòng)脈血流情況。

1.2.4 檢測(cè)下肢動(dòng)脈血管狹窄 喂食12 周后，使用戊苯巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠麻醉后，處死大鼠，并取出左后肢動(dòng)脈，固定于多聚甲醛中，通過(guò)HE 染色和EVG 染色觀察各組大鼠下肢動(dòng)脈狹窄。

1.2.5 檢測(cè)脂質(zhì)水平 喂食12 周后，使用戊苯巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠麻醉后，眼眶取血，離心，收集血清，并將血清保存在-20 ℃中備用。分別使用TG、TC、LDL 和HDL 試劑盒檢測(cè)血清中TG、TC、LDL 和HDL 的含量。

1.2.6 檢測(cè)炎癥因子水平 喂食12 周后，使用戊苯巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠麻醉后，眼眶取血，離心，收集血清，并將血清保存在-20 ℃中備用。分別使用TNF-α、IL-1β 和IL-6 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量。

1.2.7 檢測(cè)血管內(nèi)皮功能 通過(guò)檢測(cè)血清中NO、VEGF 和ET-1 水平來(lái)反應(yīng)各組大鼠血管內(nèi)皮功能狀況。喂食12 周后，使用戊苯巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠麻醉后，眼眶取血，離心，收集血清，并將血清保存在-20 ℃中備用。分別使用NO 含量檢測(cè)試劑盒、VEGF 和ET-1 酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)血清中NO、VEGF 和ET-1 的含量。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 腦脈利顆粒對(duì)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥大鼠的下肢動(dòng)脈血流速度的影響

與假手術(shù)組相比，ASO 模型組血流速度明顯降低（P＜0.01），表明造模成功。與ASO 模型組相比，腦脈利顆粒組和西洛他唑組大鼠下肢動(dòng)脈血流速度均明顯升高（P＜0.01），高劑量的腦脈利顆粒的藥效與西洛他唑相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1、表1。

圖1 各組動(dòng)物下肢動(dòng)脈血流速度圖的比較Fig. 1 Comparison of lower limb arterial blood rate in each group

表1 各組動(dòng)物下肢動(dòng)脈血流速度比較結(jié)果（±s，n = 6）Tab. 1 Comparison of lower limb arterial blood rate in each group（±s，n = 6）

表1 各組動(dòng)物下肢動(dòng)脈血流速度比較結(jié)果（±s，n = 6）Tab. 1 Comparison of lower limb arterial blood rate in each group（±s，n = 6）

注：模型組與假手術(shù)組相比，##P ＜0.01；各給藥組與ASO 模型組相比，**P ＜0.01。

組別平均血流速度/（mm/s）假手術(shù)組254.18 ± 18.88 ASO 模型組 35.29 ± 4.53##腦脈利顆粒低劑量組 140.79 ± 14.20**腦脈利顆粒高劑量組 240.79 ± 20.28**西洛他唑組 214.24 ± 16.33**F 65.260 P 0.000

2.2 腦脈利顆粒對(duì)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥大鼠的下肢動(dòng)脈狹窄癥狀的影響

與假手術(shù)組相比，ASO 模型組大鼠下肢動(dòng)脈出現(xiàn)嚴(yán)重的狹窄的現(xiàn)象。與ASO 模型組相比，腦脈利顆粒組和西洛他唑組都可以減輕下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥大鼠的下肢動(dòng)脈狹窄，腦脈利顆粒高劑量組的藥效與西洛他唑組相當(dāng)，各組HE 染色和EVG 染色結(jié)果，分別見圖2、圖3。

圖2 各組HE 染色結(jié)果Fig. 2 The results of hematoxylin-eosin stain in each group

圖3 各組EVG 染色結(jié)果Fig. 3 The results of elastic van gieson stain in each group

2.3 腦脈利顆粒對(duì)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥大鼠的血脂紊亂現(xiàn)象的影響

與假手術(shù)組相比，ASO 模型組大鼠的TC、TG 和LDL 均明顯升高（P＜0.01），而HDL 明顯降低（P＜0.01），表明造模成功。與ASO 模型組相比，腦脈利顆粒組和西洛他唑組大鼠的TC、TG 和LDL 含量均降低（P＜0.05），HDL 含量升高（P＜0.05）。腦脈利顆粒高劑量組對(duì)ASO 大鼠血脂紊亂改善的藥效與西洛他唑組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組動(dòng)物血脂水平比較（±s，mmol/L，n = 6）Tab. 2 Comparison of blood lipid levels in each group （±s，mmol/L，n = 6）

表2 各組動(dòng)物血脂水平比較（±s，mmol/L，n = 6）Tab. 2 Comparison of blood lipid levels in each group （±s，mmol/L，n = 6）

注：模型組與假手術(shù)組相比，##P ＜0.01；各給藥組與ASO 模型組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別TCTGLDLHDL假手術(shù)組3.52 ± 0.320.62 ± 0.05162.55 ± 14.4593.97 ± 4.99 ASO 模型組 7.56 ± 0.57## 0.96 ± 0.06## 339.26 ± 23.89## 65.41 ± 5.49##腦脈利顆粒低劑量組 5.85 ± 0.15** 0.76 ± 0.02* 278.21 ± 16.02*77.34 ± 3.16腦脈利顆粒高劑量組 4.63 ± 0.45** 0.67 ± 0.04** 206.42 ± 14.20** 86.35 ± 4.96**西洛他唑組 4.21 ± 0.35** 0.72 ± 0.03** 235.12 ± 15.58** 83.28 ± 5.96*F 33.26019.06064.97010.440 P 0.000 0.000 0.000 0.001

2.4 腦脈利顆粒對(duì)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與假手術(shù)組相比，ASO 模型組大鼠的TNF-α、IL-1β 和IL-6 均明顯升高（P＜0.01），表明造模成功；與ASO 模型組相比，腦脈利顆粒組和西洛他唑組大鼠的TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量明顯降低 （P＜0.01），腦脈利顆粒高劑量組藥效與西洛他唑組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組動(dòng)物體內(nèi)炎癥因子水平比較（±s，ng/L，n = 6）Tab. 3 Comparison of inflammatory factors levels in each group （±s，ng/L，n = 6）

表3 各組動(dòng)物體內(nèi)炎癥因子水平比較（±s，ng/L，n = 6）Tab. 3 Comparison of inflammatory factors levels in each group （±s，ng/L，n = 6）

注：模型組與假手術(shù)組相比，##P ＜0.01；各給藥組與ASO 模型組相比，**P ＜0.01。

組別TNF-α IL-1β IL-6假手術(shù)組157.23 ± 11.4189.74 ± 9.2096.83 ± 6.53 ASO 模型組 503.58 ± 18.96## 211.32 ± 12.84## 236.83 ± 10.39##腦脈利顆粒低劑量組 300.12 ± 22.07** 170.66 ± 6.71** 163.50 ± 10.17**腦脈利顆粒高劑量組 260.43 ± 25.85** 117.32 ± 10.29** 128.05 ± 11.30**西洛他唑組 290.21 ± 23.70** 136.89 ± 7.09** 133.89 ± 11.71**F 71.87049.61054.260 P 0.000 0.000 0.000

2.5 腦脈利顆粒對(duì)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥大鼠的血管內(nèi)皮功能紊亂的影響

與假手術(shù)組相比，ASO 模型組大鼠的NO 和VEGF 均明顯降低 （P＜0.01）；而ET-1 明顯升高（P＜0.01），表明造模成功；與ASO 模型組相比，腦脈利顆粒組和西洛他唑組大鼠的NO 和VEGF 含量均升高（P＜0.05），ET-1 含量明顯降低（P＜0.01）。腦脈利顆粒高劑量組對(duì)ASO 大鼠血管內(nèi)皮功能紊亂改善的藥效與西洛他唑組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 各組動(dòng)物血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n = 6）Tab. 4 The results of related indexes of vascular endothelial function in each group（±s，n = 6）

表4 各組動(dòng)物血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n = 6）Tab. 4 The results of related indexes of vascular endothelial function in each group（±s，n = 6）

注：模型組與假手術(shù)組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01；各給藥組與ASO 模型組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別NO/ （μmol/L）ET-1/ （ng/L）VEGF/ （ng/L）假手術(shù)組21.44 ± 2.6427.10 ± 2.0939.39 ± 1.93 ASO 模型組 12.44 ± 2.10## 82.67 ± 4.46## 20.75 ± 2.50##腦脈利顆粒低劑量組 17.18 ± 1.13* 53.97 ± 7.81**27.81 ± 2.08腦脈利顆粒高劑量組 19.51 ± 0.63** 46.65 ± 4.06** 33.89 ± 3.73**西洛他唑組 18.19 ± 0.45* 49.32 ± 4.36** 31.74 ± 3.56*F 8.58333.09011.950 P 0.003 0.000 0.000

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠下肢動(dòng)脈血管內(nèi)膜損傷并異常增殖，造成血管狹窄、平均血流速度下降；血清中的NO 和VEGF 含量降低，ET-1 含量升高，炎癥水平升高；脂質(zhì)代謝紊亂，說(shuō)明造模成功，可用于腦脈利顆粒對(duì)于大鼠下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥治療效果的評(píng)估。

與模型組相比，腦脈利顆粒組可以升高下肢動(dòng)脈血流速度，同時(shí)HE 和EVG 染色結(jié)果顯示腦脈利顆粒組均可有效改善下肢動(dòng)脈狹窄，從而改善血循環(huán)和肢體血運(yùn)，達(dá)到舒經(jīng)活絡(luò)的目的。臨床上，改善下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥患者血流速度和血管內(nèi)徑，可提高臨床療效[10]。

研究表明，動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)展歷程為氧化型LDL 沉積于動(dòng)脈內(nèi)膜下（損傷處尤為明顯），與巨噬細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞表面的清道夫受體結(jié)合，致使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，形成泡沫細(xì)胞，并與內(nèi)皮損傷相互作用，導(dǎo)致以TNF-α 和IL-6 為代表的炎性因子異常釋放，進(jìn)一步引起平滑肌細(xì)胞異常表達(dá)及遷移增生，加重動(dòng)脈硬化閉塞癥的癥狀[11-12]，巨噬細(xì)胞內(nèi)的氧化型LDL 堆積，還可以誘發(fā)ET-1 大量釋放，加速疾病進(jìn)程[13]。腦脈利顆粒組可以有效降低血清中TC、TG 和LDL 含量，升高血清中HDL 含量，并降低血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 炎癥因子水平，提示腦脈利顆粒通過(guò)減少動(dòng)脈血管中的脂質(zhì)沉積、抑制炎癥反應(yīng)，減緩動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)展進(jìn)程。腦脈利顆粒組還可以有效升高血清中NO 和VEGF 含量，降低血清中ET-1 含量。提示腦脈利顆粒組通過(guò)對(duì)NO、ET-1 和VEGF 含量的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗自由基和促進(jìn)血管新生的作用，進(jìn)而改善血管內(nèi)皮功能紊亂的情況。臨床上NO、ET-1 的水平對(duì)于預(yù)測(cè)血管再狹窄的發(fā)生及判斷預(yù)后具有重要價(jià)值[14-15]。

《下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥診治指南》[7]指出，西洛他唑?yàn)橹委熼g歇性跛行的一線藥物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦脈利顆粒高劑量組升高血流速度，改善下肢動(dòng)脈狹窄，降低血清中TC、TG、LDL、TNF-α、IL-1β、IL-6 和ET-1 的含量，升高血清中HDL、NO 和VEGF 水平的藥效作用與西洛他唑基本相當(dāng)或略優(yōu)，說(shuō)明其對(duì)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的治療具有積極的作用。

4 結(jié)論

通過(guò)大鼠高脂喂養(yǎng)加內(nèi)膜損傷模型首次驗(yàn)證了腦脈利顆粒改善動(dòng)脈硬化閉塞癥的作用，各劑量組的腦脈利顆粒通過(guò)改善下肢動(dòng)脈狹窄、升高血流速度、調(diào)節(jié)血脂、抑制炎性反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能紊亂，發(fā)揮治療大鼠下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的作用，且具有一定的劑量依賴關(guān)系。但由于人體ASO 病變過(guò)程較為復(fù)雜，后期尚需進(jìn)一步探索，為可能開展的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為有效開發(fā)腦脈利顆粒的生物學(xué)功能提供科學(xué)依據(jù)。