孔琬琳，冷錦紅

（1.遼寧中醫(yī)藥大學 研究生學院，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 內分泌科，遼寧 沈陽 110032）

痛性糖尿病周圍神經病變（Painful diabetic peripheral neuropathy, PDPN）是糖尿病治療中最具挑戰(zhàn)性的并發(fā)癥之一[1]。臨床表現(xiàn)主要以疼痛為主，或伴有四肢麻木、灼熱、冰涼等感覺異常。嚴重影響患者的生活質量，給患者造成極大痛苦。現(xiàn)代醫(yī)學研究多在控制血糖的基礎上，給予抗氧化劑、醛糖還原酶抑制劑、營養(yǎng)神經、改善微循環(huán)、鎮(zhèn)痛藥物等對癥治療[2]，雖取得一定療效，但仍未從根本上解決問題。

中醫(yī)學將PDPN 歸屬于“消渴痹癥”。穿山龍和威靈仙是治療各種頑痹的要藥。威靈仙辛散溫通，性猛善走，可宣通十二經絡；穿山龍藥性剛性純厚、力專功捷，有補虛之功。兩藥共用，能走能守，能通能補，相輔相成，共奏補虛通絡，活血定痛之功。兩藥經過配伍之后，寒痹、熱痹、濕痹、虛痹均可用之，故為諸多醫(yī)家所喜，是臨床治療痹癥的經典對藥[3-5]。本研究主要通過網(wǎng)絡藥理學探討穿山龍-威靈仙藥對治療PDPN 的分子作用機制，并運用分子對接進行驗證，為進一步研究其治療PDPN作用提供了基礎。

1 資料和方法

1.1 活性成分篩選

運用TCMSP 數(shù)據(jù)庫，檢索“穿山龍”“威靈仙”活性成分，并以“OB ≥30%”和“DL ≥0.18”為限制條件，將結果輸入Excel表格以獲得活性成分數(shù)據(jù)集。

1.2 靶點預測與篩選

運用PharmMapper、UniProt 數(shù)據(jù)庫進行檢索，得到藥對靶點和對應基因。運用Genecards 數(shù)據(jù)庫篩選得到與PDPN 相關的基因。兩者取交集，最終得到穿山龍-威靈仙藥對治療PDPN 的潛在靶點。輸入Excel 表格以獲得靶點數(shù)據(jù)集。

1.3 生物信息學GO 分析和信號通路KEGG 分析

運用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫進行GO 分析和KEGG分析，得到相應通路。運用CTD 數(shù)據(jù)庫，以 “painful diabetic peripheral neuropathy”“diabetic neuropathy”為關鍵詞進行檢索，得到PDPN 的相關信號通路。將其與之前檢索到的通路相匹配，作為穿山龍-威靈仙藥對治療PDPN 的信號通路。將其輸入Excel 表格，以獲得信號通路數(shù)據(jù)集。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建

將靶點輸入String 11.0 數(shù)據(jù)庫，構建網(wǎng)絡圖。設置參數(shù)＞0.90，以保證相互作用關系的高置信度。將其導入Cytoscape 3.7.2 軟件構建PPI 網(wǎng)絡圖。

1.5 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構建

運用上述結果篩選出核心成分、靶點、信號通路，并將其導入Cytoscape3.7.2 軟件，構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖。研究穿山龍-威靈仙藥對治療PDPN 的機制。

1.6 分子對接

從蛋白晶體結構數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org）中下載核心靶點，保存為PDB 格式。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中下載核心有效成分，保存為.mol 格式。運用PyMOL 和AutodockTool 1.5.6 軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 活性成分篩選

運用TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索出66 個活性成分。其中，穿山龍有9 個、威靈仙有57 個。限定條件為“OB ≥30%”“DL ≥0.18”，最終得到活性成11 個，其中，穿山龍有3 個（即D9-D11）、威靈仙有8 個（即D1-D8）。各活性成分具體信息如表1 所示。

2.2 靶點預測

運用PharmMapper、UniProt 數(shù)據(jù)庫獲取靶蛋白。去掉各活性成分重復靶蛋白，得到靶蛋白197 個。將其與從Genecards 數(shù)據(jù)庫中檢索到的目標蛋白相匹配。剔除假陽性靶蛋白后，得到129 個潛在靶蛋白，見圖1。在穿山龍中，活性成分薯蕷皂甙元棕櫚酸酯（diosgenin palmitate）對應的靶蛋白數(shù)目最多，有68 個。在威靈仙中，β-谷甾醇（beta-sitosterol）對應的靶蛋白數(shù)目最多，有72 個。表明薯蕷皂甙元棕櫚酸酯和β-谷甾醇可能是穿山龍-威靈仙藥對治療PDPN 的核心有效成分，具體信息見表1。

表1 穿山龍-威靈仙藥對活性成分基本信息Tab.1 Basic information on active ingredients of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma drugs

圖1 穿山龍-威靈仙藥對基因與PDPN 基因韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma gene and PDPN gene

2.3 生物信息學 GO 分析和信號通路 KEGG 分析

運用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫進行GO 分析和KEGG分析，得到BP 126 個、CC 24 個、MF 38 個、KEGG通路88 個。限定P＜ 0.01，得到BP 43 個、CC 13 個、MF 13 個、KEGG 通路48 個。將這些通路與CTD 數(shù)據(jù)庫中檢索到的通路進行匹配，最終得到34 條通路。

GO 分析結果按靶點數(shù)目排序，取前10 位繪制成圖表。見圖2-圖4。結果顯示，在生物過程方面，主要涉及DNA 轉錄、蛋白水解、氧化還原、RNA聚合酶負調控、血管生成和負調節(jié)凋亡等。在細胞組成方面，主要涉及細胞外基質、細胞核、細胞質和線粒體等。在分子功能方面，主要涉及ATP 結合、鋅離子結合和類固醇激素受體活性等。

圖2 穿山龍-威靈仙藥對主要活性成分的BP 富集分析Fig. 2 BP enrichment analysis of the main active components of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma drugs

圖3 穿山龍-威靈仙藥對主要活性成分的CC 富集分析Fig. 3 CC enrichment analysis of the main active components of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma drugs

圖4 穿山龍-威靈仙藥對主要活性成分的MF 富集分析Fig. 4 MF enrichment analysis of the main active components of Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma drugs

KEGG 分析結果按靶點數(shù)目排序，選取前20 位繪制成圖表，見圖5。結果顯示，大多數(shù)基因主要富集到Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、PI3K-Akt 通路、Ras 通路、Focal adhesion、Rap1 通路、MAPK 這幾條通路。Pathways in cancer 富集基因最多，有23 個。其余分別為19、16、15、13 個。表明Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、PI3KAkt 等前20 位通路可能是穿山龍-威靈仙藥對治療PDPN 的關鍵通路。

圖5 穿山龍-威靈仙藥對KEGG 通路富集分析高級氣泡圖Fig. 5 Advanced bubble diagram for KEGG pathway enrichment analysis by Dioscoreae Nipponicae Rhizoma-Clematidis Radix et Rhizoma drugs

2.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建與分析

運用String 11.0 數(shù)據(jù)庫構建網(wǎng)絡圖，并將置信度限制設置為大于0.90。將其導入Cytoscape 3.7.2 軟件中。以degree 值≥12（中位數(shù)值），BC ≥0.001 286 55（中位數(shù)值）和CC ≥0.420 924 57（中位數(shù)值）進行篩選，得到核心靶點5 個，相互作用關系見圖6、表2 。這些 degree 較高的靶點是PPI 網(wǎng)絡關系的樞紐，可能在穿山龍-威靈仙藥對治療PDPN 的過程中起到了關鍵作用。

圖6 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡圖Fig. 6 Network diagram of protein interactions (PPI)

表2 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡中核心靶點拓撲學性質Tab. 2 Topological properties of core targets in protein interaction (PPI)networks

2.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡構建與分析

將穿山龍-威靈仙藥對、2 個核心成分、7 個核心靶點和20 個關鍵通路輸入 Cytoscape 3.7.2 軟件，構建網(wǎng)絡圖。共有31 個節(jié)點，78 條邊，結果見圖7。由此可見，穿山龍-威靈仙藥對中多種活性成分、多種通路與多種靶點，相互影響、共同參與，起到對PDPN 的治療效用。

圖7 “化合物-靶點-信號”通路網(wǎng)絡圖Fig. 7 Network diagram of “compound-target-signaling” pathway

2.6 分子對接驗證

將核心成分分別與核心靶點進行分子對接，結果見表3。一般認為，分子對接結合能越低，結構越穩(wěn)定，結合作用越好。若結合能低于或等于-5 Kcal/mol，則認為該活性成分與靶蛋白結合作用較好[6]。結果顯示，各配體與受體結合能均小于-5 Kcal/mol，結合作用較好，表明本研究對核心成分和核心靶點的預測具有一定科學性。其中，薯蕷皂甙元棕櫚酸酯與PTPN11 的結合能最低，為-9.0 Kcal/mol，結構最穩(wěn)定。除此以外，β-谷甾醇與EGFR、MAPK8，薯蕷皂甙元棕櫚酸酯與EGFR、β-谷甾醇與MAPK1 的結合作用也較好，結合能分別為-8.6 Kcal/mol、-8.3 Kcal/mol、-8.1 Kcal/mol、-8.0 Kcal/mol。對接模式見圖8。

表3 分子對接結果Tab. 3 Molecular docking results

結合模式分析可見，薯蕷皂甙元棕櫚酸酯和PTPN11 結合嵌入疏水loop 區(qū)（PRO-38、THR-356、PHE-420、TRP-423、VAL-428、PRO-429、PRO-432、VAL-435、PHE-438、THR-468、PHE-469、GLU-508、ALA-509、ALA-517）。β－谷甾醇和MAPK8 氨基酸殘基 ASP-112 形成 1 個氫鍵，并嵌入疏水 loop 區(qū)（ILE-32、GLN-37、VAL-40、VAL-158、LEU-168）。薯 蕷 皂甙元棕櫚酸酯與 EGFR 結合嵌入疏水 loop 區(qū)（PHE-699、VAL-702、ALA-719、LYS-721、THR-766、ARG-817、LEU-820、LEU-834）。β－谷甾醇與MAPK1 結合嵌入疏水loop 區(qū)（ILE-31、TYR-36、VAL-39、LYS-54、LEU-156）。

3 討論

本研究篩選出靶點197 個，與PDPN 有關的靶點129 個，占總靶點的66%，說明穿山龍-威靈仙藥對對于PDPN 的治療具有極高的針對性。研究表明，Src激酶能夠介導NMDA 受體磷酸化，調控受體與胰島素結合，從而調節(jié)血糖[11]。MAPK1 和MAPK8 是JNK家族的一員，對細胞應激具有重要作用。它與血糖調控、氧化應激和生長因子活化等有關，對PDPN 的形成有一定影響[12-14]。HSP90AA1 和EGFR 皆與細胞凋亡有關，能夠有效抑制異常細胞周期進程，顯著降低細胞活力，對胰島細胞具有調控作用，在胰島素抵抗、T2DM 等代謝紊亂方面具有良好效用[15]。ESR1 可以影響激素分泌的水平，進一步影響血糖的變化，對于糖尿病及其合并癥皆具有重要影響[16]。這些核心靶點在PDPN 的治療中都占據(jù)著關鍵位點、發(fā)揮重要作用。

KEGG 富集涉及PI3K-Akt、MAPK 等34 個信號通路。研究表明，激活PI3K-Akt 通路不僅可以引起炎癥因子過度表達，還可以激活免疫反應，使病變持續(xù)加重，并引起神經功能的改變，出現(xiàn)疼痛等癥狀，是PDPN 發(fā)生的重要機制[17]。在高血糖狀態(tài)下，AGEs 與受體發(fā)生反應，通過Ras 通路，能夠引起微循環(huán)障礙，引發(fā)PDPN[18]。Focal adhesion通路激活可抑制部分 DNA 甲基轉移酶誘導 DNA 低甲基化[19]。Rap1 和MAPK 通路在糖尿病的發(fā)病和治療中具有重要意義[20-21]。MAPK 通路是目前為止關于糖尿病及其并發(fā)癥研究最深入的通路之一，是穿山龍治療PDPN 的核心通路之一[22]。激活該通路，可引起炎癥反應，調控神經細胞凋亡，與“疼痛”形成相關，在PDPN 的治療中具有重要意義[23]。

4 結論

穿山龍-威靈仙藥對可能主要通過薯蕷皂甙元棕櫚酸酯和β -谷甾醇等核心成分，分別與MAPK1、MAPK8 等核心靶點以氫鍵、疏水作用等方式結合，作用于PI3K-Akt、MAPK 等關鍵通路，起到治療PDPN 的作用。研究證明了穿山龍-威靈仙藥對治療PDPN 多成分、多靶點、多途徑的作用機制。分子對接結果驗證了核心成分與核心靶點結果的可靠性、科學性。但本研究作為作用機制探討尚停留在計算機模擬的理論研究層面，后續(xù)還需進一步的臨床和實驗研究驗證其藥效及作用機制。