王斐斐，何婷，李煒，孫琳，曲凱，姚忠強(qiáng)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一[1]。然而目前，HCC發(fā)生的分子機(jī)制尚未完全明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non coding RNAs，LncRNAs)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非蛋白編碼RNA，其在多種細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中均發(fā)揮著重要作用[2-3]。研究表明，多種lncRNAs異常表達(dá)在HCC發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮了不同作用[4]。最近，一種新的LncRNA腫瘤蛋白翻譯調(diào)節(jié)因子1反義-RNA1 (tumor protein translationally controlled 1 antisense RNA 1, TPT1-AS1)被發(fā)現(xiàn)與消化道腫瘤關(guān)系密切[5]。然而，目前TPT1-AS1在HCC中的臨床意義和功能作用尚未被完全被揭示。基于此，本研究從HCC患者的腫瘤組織和體外腫瘤細(xì)胞系兩個(gè)水平探討了TPT1-AS1對(duì)HCC的影響，以期為進(jìn)一步了解HCC發(fā)生的分子機(jī)制、開(kāi)發(fā)HCC治療新靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)研究對(duì)象：2014年1月—2015年12月西安交通大學(xué)附屬三二0一醫(yī)院和附屬第一醫(yī)院對(duì)92例HCC患者手術(shù)切除治療，留取腫瘤組織和相應(yīng)癌旁(≥3 cm)正常肝組織在-80℃液氮中保存作為研究對(duì)象。HCC手術(shù)患者符合巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona clinic liver cancer，BCLC)臨床分期要求，滿(mǎn)足肝癌治療指南手術(shù)切除標(biāo)準(zhǔn)[1]；肝癌細(xì)胞HepG2和SNU-182、人肝永生化細(xì)胞THLE-3購(gòu)自中科院上海生科院細(xì)胞資源中心。(2)試藥試劑：RIPA裂解緩沖液、碘化丙錠PI染色液(上海碧云天生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(北京天恩澤生物技術(shù)有限公司)；PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；周期蛋白依賴(lài)性激酶4 (cyclin-dependent kinases4, CDK4)、p21、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH抗體 (英國(guó)Abcam公司)；抗鼠二抗、抗兔二抗及GAPDH(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；TPT1-AS1和GAPDH引物(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成)。2種靶向TPT1-AS1的siRNA(si-TPT1-AS1#1和si-TPT1-AS1#2)，陰性對(duì)照siRNA (si-NC，蘇州吉瑪基因股份有限公司)。CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(中國(guó)賽默飛世爾公司)。(3)儀器設(shè)備：Transwell小室(上海索萊寶生物科技有限公司)； Multiskan FC多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司),ECLIPSE Ti-U熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司),流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD FACSCantogo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2018年9月—2020年6月于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。分別比較HCC患者肝癌組織與癌旁正常肝臟組織，體外肝癌細(xì)胞與人肝永生化細(xì)胞之間TPT1-AS1表達(dá)差異。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)測(cè)得全部患者肝癌組織TPT1-AS1相對(duì)表達(dá)水平中位數(shù)(3.38)，將納入HCC患者分為T(mén)PT1-AS1高表達(dá)組(≥3.38)和低表達(dá)組(<3.38)，比較2組患者術(shù)后5年生存時(shí)間差異。利用qRT-PCR分別檢測(cè)siRNA、si-NC轉(zhuǎn)染HepG2和SNU-182細(xì)胞后TPT1-AS1基因表達(dá)情況。比較siRNA、si-NC轉(zhuǎn)染后HepG2和SNU-182細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)情況差異。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 腫瘤組織與癌旁正常肝組織中RNA TPT1-AS1表達(dá)差異檢測(cè):使用TRIzol法從收集的腫瘤組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常肝組織及HepG2、SNU-182、THLE-3細(xì)胞中提取總RNA，并使用PrimeScriptTMRT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。相關(guān)引物序列如下：TPT1-AS1，上游引物：5' -AGCCTTGAGGCTATGCCCATC-3'；下游引物：5' -AACAGTGTTTGGAGGCCTGAA-3'；GAPDH，上游引物：5' -GCCCTCCGACACCCACTACTT-3'；下游引物：5' -TGAATTCTGTAGCCACGTTGTCATA-3'。

1.3.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)篩選轉(zhuǎn)染HepG2和SNU-182細(xì)胞高效的siRNA：常規(guī)復(fù)蘇凍存細(xì)胞后，分別將HepG2、SNU-182、THLE-3細(xì)胞均勻分散在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞融合率為70%～90%。按照細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明，分別使用siRNA(si-TPT1-AS1#1和si-TPT1-AS1#2)和si-NC轉(zhuǎn)染HepG2、SNU-182細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，以每孔3 000個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板上，分別于24、28、72 h向培養(yǎng)板加入 10 μl細(xì)胞懸液，孵育2h后，再加入10 μlCCK-8溶液，再次孵育2 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度。選擇其中轉(zhuǎn)染高效的siRNA進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.3 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)觀測(cè)沉默TPT1-AS1基因?qū)epG2和SNU-182細(xì)胞生長(zhǎng)能力： 將轉(zhuǎn)染細(xì)胞以每孔500個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板中，在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)2周。形成的細(xì)胞集落用PBS浸洗2次，空氣干燥后。使用70%甲醇固定，用0.1%結(jié)晶紫染色10 min。在顯微鏡下對(duì)集落數(shù)(>50個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。

1.3.4 沉默TPT1-AS1基因HepG2和SNU-182細(xì)胞周期測(cè)定：HepG2和SNU-182細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-TPT1-AS 48 h后，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，并在70%乙醇、4℃條件下固定過(guò)夜。之后，清洗細(xì)胞離心去除上清液。用 RNase A溶液20 μl和0.2% Triton X-100在37℃孵育10 min，再用碘化丙錠PI染色液400 μl避光孵育。用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默TPT1-AS1基因后HepG2和SNU-182細(xì)胞遷移能力： 將轉(zhuǎn)染HepG2和SNU-182細(xì)胞以每孔5×105個(gè)密度接種于6孔板。細(xì)胞單層融合后，用200 μl移液槍頭垂直于6孔板制作劃痕。分別于0 h和24 h用倒置熒光顯微鏡拍攝圖像，利用Image J軟件分別測(cè)量劃痕區(qū)域?qū)挾龋⒎謩e記錄為H0和H24。根據(jù)公式：(H0-H24)/W0×100%計(jì)算相對(duì)遷移距離。

1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)染si-TPT1-AS1后HepG2和SNU-182細(xì)胞侵襲能力： Transwell上室加入Matrigel與無(wú)血清DMEM，后分別將5×104個(gè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞懸液接種于上室每個(gè)小室中。在下室的24孔板中各加入DMEM完全培養(yǎng)基500 μl。孵育24 h后，下室細(xì)胞用4%多聚甲醇固定15 min，0.2%結(jié)晶紫染色30 min。每個(gè)Transwell小室隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域拍攝并計(jì)數(shù)進(jìn)行分析。

1.3.7 Western blot檢測(cè)法檢測(cè)CDK4、p21、CDK4、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平： 根據(jù)RIPA裂解緩沖液提取轉(zhuǎn)染后HepG2和SNU-182細(xì)胞的總蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別用加入CDK4、p21、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH一抗體及二抗，TBST緩沖液洗滌后，使用電化學(xué)發(fā)顯影劑顯影。使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶灰度分析，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌組織TPT1-AS1表達(dá)水平及其與預(yù)后比較 用qRT-PCR檢測(cè)92例患者的肝癌組織及癌旁組織中TPT1-AS1的相對(duì)表達(dá)水平。與對(duì)應(yīng)癌旁組織相比，肝癌組織TPT1-A1相對(duì)表達(dá)水平升高(3.14±0.29 vs. 1.00±0.00，t/P=54.065/0.000)。

根據(jù)qRT-PCR測(cè)得全部肝癌組織TPT1-AS1相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)(3.38)，將92例患者分為T(mén)PT1-AS1高表達(dá)組(n=46)和低表達(dá)組(n=46)。高表達(dá)組的BCLC分期C期比例、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例高于低表達(dá)組(χ2/P=15.187/0.001，7.379/0.007)，見(jiàn)表1。Kaplan-Meier生存分析顯示，高表達(dá)組患者5年生存率低于低表達(dá)組 (χ2/P=7.354/0.007)，見(jiàn)圖1。

表1 肝癌患者92例不同TPT1-AS1表達(dá)水平臨床特點(diǎn)比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics of differentTPT1-AS1 expression levels in 92 patients with liver cancer

圖1 肝癌組織中TPT1-AS1表達(dá)與患者結(jié)局關(guān)系

2.2 沉默TPT1-AS1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖比較 HepG2和SNU-182細(xì)胞的TPT1-AS1相對(duì)表達(dá)水平分別為3.42±0.21和3.15±0.17，顯著高于人肝永生化細(xì)胞THLE-3(1.00±0.00)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.960、21.905，均P=0.000)。分別用siRNA和si-NC轉(zhuǎn)染HepG2和SNU-182細(xì)胞后可見(jiàn)，與si-NC相比，si-TPT1-AS1#1和si-TPT1-AS1#2轉(zhuǎn)染均可下調(diào)TPT1-AS1的表達(dá)。同時(shí)，si-TPT1-AS1#1和si-TPT1-AS1#2均對(duì)HepG2(圖2A)和SNU-182細(xì)胞(圖2B)的細(xì)胞活力均有明顯抑制作用。由于si-TPT1-AS1#1比si-TPT1-AS1#2對(duì)TPT1-AS1和細(xì)胞活力的抑制作用更強(qiáng)，因此選擇si-TPT1-AS1#1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用si-TPT1-AS1#1轉(zhuǎn)染HepG2和SNU-182細(xì)胞后，較si-NC轉(zhuǎn)染的對(duì)應(yīng)細(xì)胞集落數(shù)顯著減少(分別為147.35±10.63、114.52±9.52和68.49±7.74、47.36±5.43，t=10.388、10.614，均P=0.000)，見(jiàn)圖2C。

2.3 沉默TPT1-AS1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞周期比較 使用si-TPT1-AS1#1轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例為(74.43±1.24)%，S期細(xì)胞比例為(12.82±0.76)%；使用si-NC轉(zhuǎn)染后，G0/G1期細(xì)胞比例為(56.91±1.32)%，S期細(xì)胞比例為(27.15±0.53)%。使用si-TPT1-AS1#1轉(zhuǎn)染SNU-18細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例為(68.52±1.06)%，S期細(xì)胞比例為(31.08±1.27)%；使用si-NC轉(zhuǎn)染后，G0/G1期細(xì)胞比例為(56.16±0.94)%，S期細(xì)胞比例為(17.85±1.62)%。使用si-TPT1-AS1轉(zhuǎn)染HepG2和SNU-18細(xì)胞均較si-NC轉(zhuǎn)染后，G0/G1期細(xì)胞比例均升高(t=16.756、15.111,P均=0.000)，S期細(xì)胞比例均顯著降低(t=26.788、11.132,P均=0.000)，見(jiàn)圖3。

注：A. CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞活力影響；B. CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)SNU-182細(xì)胞活力影響；C. si-TPT1-AS1#1和si-NC轉(zhuǎn)染HepG2、SNU-182細(xì)胞對(duì)細(xì)胞集落形成影響。與si-NC組比較，a P<0.05，b P<0.01

圖3 流式細(xì)胞分析沉默TPT1-AS1對(duì)HepG2和SNU-182肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期影響

2.4 沉默TPT1-AS1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的遷移、侵襲能力比較 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 使用si-TPT1-AS1#1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和SNU-182細(xì)胞的相對(duì)遷移距離分別為(19.24%±1.36%)和(28.46%±1.63%)，相同細(xì)胞si-NC轉(zhuǎn)染后分別為(58.51%±1.62%)和(50.83%±1.29%)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.153、18.640，均P=0.000)，見(jiàn)圖4A。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)使用si-TPT1-AS1#1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和SNU-18細(xì)胞后，較si-NC轉(zhuǎn)染后穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)量減少，見(jiàn)圖4 B。

2.5 沉默TPT1-AS1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的G1/S期轉(zhuǎn)換及EMT相關(guān)蛋白比較 Western blot檢測(cè)顯示，使用si-TPT1-AS1#1轉(zhuǎn)染HepG2和SNU-182細(xì)胞后，較si-NC轉(zhuǎn)染后對(duì)應(yīng)細(xì)胞的CDK4、N-cadherin和Vimentin的蛋白相對(duì)表達(dá)量下降(P均=0.000)，而p21和E-cadherin的蛋白相對(duì)表達(dá)量增加(P均=0.000)，見(jiàn)圖5，表2。

表2 各組細(xì)胞CDK4、N-cadherin、Vimentin、p21和E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較

注：A.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果； B.Transwell實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞對(duì)侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×200)

圖5 沉默TPT1-AS1基因?qū)epG2和SNU-182肝癌細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)換及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

近年來(lái)隨著對(duì)肝癌發(fā)生分子機(jī)制了解的不斷深入，眾多l(xiāng)ncRNA在HCC的診斷、治療和預(yù)后判斷中的作用逐漸被認(rèn)識(shí)[6-7]，這對(duì)今后進(jìn)一步改善HCC治療效果、減少?gòu)?fù)發(fā)、提高患者預(yù)后和生活質(zhì)量具有重大意義。反義RNA對(duì)mRNA的穩(wěn)定性、編碼蛋白的翻譯等方面發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，它們大多在各種腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)[8-9]。目前已發(fā)現(xiàn)，MCM3AP-AS1、LASP1-AS1和DSCAM-AS1等多個(gè)反義RNA可能存在促癌作用[10-12]。反義RNA中的TPT1-A S1也是lncRNA家族中的一員，其在胃癌等許多消化道腫瘤中的功能和診斷作用已被證實(shí)[5]。為了探究TPT1-A1在HCC中發(fā)揮的具體作用和相關(guān)分子機(jī)制，本研究分別利用肝癌組織、癌旁組織和2種肝癌細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，以分析TPT1-A S1對(duì)于HCC細(xì)胞的增殖能力、遷移能力、侵襲能力、細(xì)胞周期及EMT影響。

由于lncRNA在HCC的發(fā)生、發(fā)展中起到的作用越來(lái)越受到重視，因此關(guān)于lncRNA在HCC中的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。本結(jié)果證明肝癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1的表達(dá)量存在差異， TPT1-AS1高表達(dá)與肝癌患者BCLC分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系，且患者5年生存率更低。既往研究已經(jīng)證實(shí)，BCLC分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是HCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13-14]。與TPT1-AS1低表達(dá)的患者比較，TPT1-AS1高表達(dá)患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，這可能與TPT1-AS1可促進(jìn)HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲存在一定關(guān)系，為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，進(jìn)行的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)亦證明。

本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)沉默TPT1-AS1表達(dá)時(shí)，可顯著降低2種肝癌細(xì)胞的增殖、G1/S轉(zhuǎn)換及遷移、侵襲能力。這提示，TPT1-AS1可能是一種癌基因，在HCC的發(fā)生、發(fā)展中起到一定作用。這與關(guān)于TPT1-AS1在卵巢癌、胃癌細(xì)胞系等不同的研究，所得結(jié)論類(lèi)似[15-16]。沉默TPT1-AS1基因后肝癌細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，G1/S期轉(zhuǎn)換及EMT相關(guān)蛋白明顯被抑制。

本研究通過(guò)使用Western blot技術(shù)分析了沉默TPT1-AS1基因影響肝癌細(xì)胞惡性行為的可能分子機(jī)制。當(dāng)沉默TPT1-AS1基因表達(dá)后，肝癌細(xì)胞中的CDK4的表達(dá)降低，而p21蛋白表達(dá)上調(diào)。CDK4和CDK抑制劑p21在細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換中起重要作用，是目前反映腫瘤細(xì)胞增殖的常用標(biāo)志物[17]。有國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)[18]，敲除胃癌細(xì)胞TPT1-AS1基因后細(xì)胞的G1/S轉(zhuǎn)化、增殖均受抑制，且與CDK4表達(dá)減少、p21表達(dá)增加有關(guān)。細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期間存在密切關(guān)系。本結(jié)果表明沉默TPT1-AS1基因后可能通過(guò)調(diào)節(jié)CDK4/p21的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)體外肝癌細(xì)胞停留在G0/G1期，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制[19]。本研究中也觀察到，沉默TPT1-AS1表達(dá)后對(duì)肝癌細(xì)胞的EMT也可產(chǎn)生抑制作用。其中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)增加，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin和Vimentin表達(dá)降低。提示沉默沉默TPT1-AS后可抑制體外肝癌細(xì)胞的EMT。近年來(lái)有研究報(bào)道，敲除或沉默HOXA-AS2[20]和SBF2-AS1[21]等lncRNAs，可通過(guò)抑制EMT而抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。也有報(bào)道體外胃癌細(xì)胞中沉默TPT1-AS1基因?qū)-cadherin和Vimentin的調(diào)節(jié)作用[5]。上述結(jié)果都提示，TPT1-AS1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移起抑制作用。由于本研究受到條件所限，并未開(kāi)展上調(diào)TPT1-AS1對(duì)HCC生物學(xué)行為的研究，有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述， TPT1-AS1與肝癌患者的分期較差、淋巴轉(zhuǎn)移和5年生存率降低相關(guān)，可通過(guò)影響細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和EMT相關(guān)指標(biāo)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT的發(fā)生。本研究結(jié)論仍需要更多的在體研究和臨床觀察以進(jìn)一步證實(shí)，但本研究的結(jié)論仍能夠?yàn)榻窈蟾伟┲委熖峁┮粋€(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王斐斐：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，論文撰寫(xiě)；何婷：提出研究思路，實(shí)施研究過(guò)程；李煒：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；孫琳：資料搜集整理，論文修改；曲凱：資料搜集整理，論文修改；姚忠強(qiáng)：設(shè)計(jì)研究方案，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，論文審核