周龍平 唐向榮 傅錦堅

金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)是導(dǎo)致各種人群發(fā)生社區(qū)獲得性感染或醫(yī)院獲得性感染的主要病原體之一[1,2]。SA可在全球播散蔓延得益于其具有特異性的基因，這些基因編碼的蛋白可錨定在健康個體或患者的呼吸系統(tǒng)或其他上皮和黏膜的表面，是造成SA發(fā)生傳播和感染的分子基礎(chǔ)[3,4]。此外，SA對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，促進(jìn)了在抗生素選擇性壓力下的多重耐藥性SA菌株的選擇性生長和繁衍，進(jìn)而在社區(qū)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)超級傳播，對公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[5]。根據(jù)耐甲氧西林金葡菌( methicillin-resistant SA,MRSA)其分子決定物和對抗生素的耐藥性不同，研究者進(jìn)一步將MRSA細(xì)分為社區(qū)獲得性MRSA(community acquired MRSA)和醫(yī)院獲得性MRSA(hospital acquired MRSA)，這些MRSA連同甲氧西林敏感性SA(methicillin-sensitive SA，MSSA)是導(dǎo)致兒童發(fā)生急性中耳炎的主要致病病原體[6]。此外，有研究顯示，葡萄球菌腸毒素可能參與慢性炎性疾病(如慢性中耳炎)的發(fā)病機(jī)理，但關(guān)于兒童SA中耳炎的分子流行病學(xué)報道不多。本研究從急性中耳炎兒童患者的中耳膿液或分泌物中分離出了SA菌株，并進(jìn)一步進(jìn)行了分子特征的研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象和樣本收集 以2018年1月至2020年6月在柳州市婦幼保健院(城中總院和柳東分院)耳鼻喉科門診和住院被診斷為急性中耳炎(AOM)的150例患兒為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡小于18歲且符合AOM的診斷標(biāo)準(zhǔn)， AOM的診斷標(biāo)準(zhǔn)基于《國際疾病分類》第九版，臨床修改(ICD-9-CM)代碼3810、3820或3829[6]。任何被診斷慢性中耳炎或有鼓膜置管術(shù)、膽脂瘤或外耳道炎既往史的兒童均被排除在外、非深耳道的自發(fā)性膿液或分泌物的培養(yǎng)結(jié)果亦排除。由耳鼻喉科醫(yī)生取每例患兒深耳道的自發(fā)性膿液或分泌物，若雙耳均有膿液，則合并樣本送至醫(yī)學(xué)檢驗科微生物檢驗實驗室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定。所有細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果以首次結(jié)果為準(zhǔn)，納入非重復(fù)性樣本進(jìn)行后續(xù)研究。上述研究獲得柳州市婦幼保健院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2SA的分離鑒定 收到標(biāo)本的半小時內(nèi)將樣本接種于含5%羊血的哥倫比亞瓊脂平板、嗜血巧克力和麥康凱平板，置于含有5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18～24小時，挑選可疑陽性菌落進(jìn)行革蘭染色、形態(tài)學(xué)等鑒定，純化后上機(jī)鑒定相關(guān)病原體，本研究僅關(guān)注分離鑒定出來的SA菌株。所有的瓊脂平板購自鄭州安圖生物公司，儀器選擇生物梅里埃的VITEK 2 COMPACT，鑒定卡片為AST-GP卡。

1.3藥物敏感試驗和耐藥基因檢測 使用生物梅里埃的VITEK 2 COMPACT，藥敏卡片為 AST-GP67卡，對SA菌株進(jìn)行藥物敏感試驗，檢驗結(jié)果的讀取基于美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)提出的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。多重耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)為菌株對≥3種不同型別的抗生素產(chǎn)生耐藥。此外， 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法用于檢測四環(huán)素耐藥基因(tetM和tetK)、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因(ermA和ermC)、反映甲氧西林耐藥的基因mecA和甲氧西林耐藥突變基因A(femA)[6]。

1.4SA的分子特征分析 采用多序列基因分型(multilocus sequence typing，MLST)方法對SA的7個管家基因進(jìn)行測序后，將測序結(jié)果通過MLST的數(shù)據(jù)庫(http://eburst.mlst.net)查詢得出序列分型(ST)和等位基因。使用網(wǎng)站自帶程序eBURST確定特定ST的克隆復(fù)合體(CC)；使用PCR方法對具體的mecA基因進(jìn)行分型[7]；使用PCR法對SA菌株的10種毒素基因進(jìn)行檢測；對殺白細(xì)胞素(pvl)、免疫逃逸簇基因(immune evasion cluster，IEC)(scn、chp、sak、sea和 sep)、腸毒素基因(seb、sec、sed、seg、seh、sei、sej、sek、sem、sen、seo、seq和seu)、溶血素基因(hla、hlb和hld)和中毒性休克綜合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin 1，tsst-1)進(jìn)行檢測[6～8]。耐藥基因和毒力基因的檢測在柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科完成。采用MLST方法，對7個管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測序，由本課題組成員對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。等級變量和率的差異采用χ2檢驗或Fisher’s精確檢驗，患兒年齡的比較使用t檢驗，對金葡菌CC與抗生素耐藥譜模型(敏感、非多重耐藥和多重耐藥)以及CC與每株菌株攜帶的毒力基因的數(shù)量(1～4個、5～7個和8～13個)采用對應(yīng)分析，結(jié)果以χ2檢驗值表示，所有的檢驗結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1AOM兒童SA感染的抗生素耐藥表型、基因型和毒力基因特征分析 150例患兒中，共從86份非重復(fù)的標(biāo)本中檢出SA，其中男童41例(47.7%)，女童45例(52.3%)，年齡分別為1.31±0.16歲和1.45±0.98歲，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.43，P=0.671)。86例中，檢出MRSA 20例，MSSA 66例，其中55株SA菌株至少對三種抗生素產(chǎn)生耐藥狀態(tài)，多重耐藥率為63.95%(155/86)。與MSSA相比，MRSA對紅霉素和克林霉素的耐藥率更高(P<0.05)，而MSSA比MRSA更容易對環(huán)丙沙星和慶大霉素產(chǎn)生耐藥(P<0.05)。MRSA菌株攜帶的耐紅霉素基因ermC和耐四環(huán)素基因tetK的檢出率均顯著高于MSSA菌株(P<0.05)；同時，MRSA菌株攜帶的免疫逃逸簇基因(scn、chp和sak)、腸毒素基因(seb和sek)、溶血素基因hlb以及殺白細(xì)胞素基因(pvl)的檢出率均顯著高于MSSA菌株(P值<0.05)。MSSA菌株攜帶的腸毒素基因sem和中毒性休克綜合征毒素-1(tsst-1)的檢出率均顯著高于MRSA(分別為P=0.002和P<0.001)(表1)。所有86株SA均對萬古霉素、利奈唑胺敏感，未能檢出耐藥基因ermA、tetM和腸毒素基因seq。

表1 抗生素及耐藥基因型、毒力基因在SA、MRSA與MSSA菌株分布(例，%)

2.2AOM的SA樣本克隆復(fù)合體耐藥譜、耐藥基因譜和毒力基因譜 20株MRSA菌株均攜帶SCCmecIVa，且均屬于CC59(其中ST59和ST338各10株)，表明此20株MRSA均為CA-MRSA菌株。8株菌株中共檢測出12種ST型別，分別屬于9種CC和1種未能分類的CC，其攜帶的耐藥基因譜、毒力基因譜以及抗生素耐藥譜結(jié)果見表2?？梢?，不同的CC和ST型別，其耐藥譜不一致，經(jīng)過對克隆復(fù)合體與耐藥譜(分為敏感、非多重耐藥和多重耐藥)進(jìn)行對應(yīng)分析，結(jié)果表明，CC與特定的耐藥譜對應(yīng)具有差異性，表明SA的分子遺傳背景不同，其對抗生素的耐藥譜亦不一致(χ2=131.11，P<0.001)(圖1)。進(jìn)一步將SA菌株攜帶的毒力基因數(shù)量分為3組(攜帶1～4個、5～7個和8～13個毒力基因)進(jìn)行對應(yīng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SA的分子遺傳背景不同，其攜帶的毒力基因數(shù)量亦不一致(χ2=159.79，P<0.001)(圖2)。

3 討論

咽鼓管功能障礙和細(xì)菌感染是導(dǎo)致中耳炎發(fā)生的主要原因，金黃色葡萄球菌是最常見的致病病原體之一[9]。積極監(jiān)測和分析細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)和流行動態(tài)是成功控制細(xì)菌克隆傳播的重要因素，尤其是對于快速生長繁殖的細(xì)菌，如：金黃色葡萄球菌等。因而，本研究主要從致中耳炎的金黃色葡萄球菌抗生素耐藥性、耐藥基因、毒力基因和MLST分型方面進(jìn)行綜合分析。

抗生素藥物敏感性主要用于指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥，但臨床醫(yī)師在診治中耳炎時，大部分選擇了經(jīng)驗用藥，針對中耳炎的抗生素處方多為頭孢類抗生素。本研究結(jié)果顯示，導(dǎo)致中耳炎的金黃色葡萄球菌主要為MSSA(占75.0%)，且SA菌株對頭孢曲松的耐藥率為20.9%，主要體現(xiàn)在對特定的克隆復(fù)合體，耐藥模式亦較為固定，如：對頭孢曲松耐藥的主要MRSA菌株為ST338，而MSSA菌株主要為ST2633、ST657、ST25和ST188。本研究中所有的菌株對利奈唑胺和萬古霉素敏感，對左氧氟沙星的耐藥率為16.3%；由于臨床常用氧氟沙星滴劑作為中耳炎的經(jīng)驗用藥，表明臨床上仍可將該類藥物作為經(jīng)驗用藥的備選藥物。

對SA菌株進(jìn)行分子特征分析可拓寬臨床醫(yī)師對金黃色葡萄球菌潛在傳播機(jī)制的認(rèn)識。本研究結(jié)果顯示，最常見的SA基因型為CC59(ST59和ST338)、CC5、CC6和CC398，其中CC59(ST59和ST338)是主要的MRSA菌株，與我國Liang等[10]和Wang等[11]的研究結(jié)果類似，但與德國和美國的報道不太一致。德國最為流行的SA克隆復(fù)合體為CC15、CC8、CC25和CC7[12]；美國最為流行的SA克隆復(fù)合體為CC30、CC5和CC8[13]，表明金黃色葡萄球菌的流行存在地域性分布的差異。本研究檢出的ST338和ST59是最為流行的MRSA菌株，與廣州的報道[10]相似，被認(rèn)為是主要的宿主適應(yīng)性譜系。此外，本研究檢出最多的MSSA菌株是CC398、CC5和CC6，ST398此前一直被認(rèn)為是動物感染相關(guān)的SA菌株，在人類樣本中較少發(fā)現(xiàn)，但最近幾年人源性ST398感染的報道一直在增加，如：日本三甲醫(yī)院檢出ST398[14]，美國俄亥俄州學(xué)校操場中檢出ST398[15]；本研究從86株SA菌株中檢出16株ST398菌株，表明ST398菌株導(dǎo)致的SA感染疾病一直在增加，尤其是在兒童群體中，這些發(fā)現(xiàn)也許可以揭示ST398從環(huán)境(學(xué)校操場)到兒童群體傳播的分子生物學(xué)證據(jù)。

研究細(xì)菌的耐藥表型與遺傳背景特征之間的潛在關(guān)系可以揭示更多的SA感染傳播的證據(jù)。本研究采用的對應(yīng)分析結(jié)果表明，SA克隆復(fù)合體與菌株的耐藥模式或毒力基因數(shù)量之間存在顯著的對應(yīng)關(guān)系，如CC5、CC59、CC121和CC398菌株主要與多重耐藥相關(guān)；CC121和CC188主要攜帶1～4種毒力基因，CC59、CC88和CC25主要攜帶8～13種基因等；CC59、CC398和CC88主要攜帶pvl基因，而tsst-1基因主要在CC5和CC88分離株中發(fā)現(xiàn)；揭示了基于多種表型-基因型特征區(qū)分金黃色葡萄球菌克隆的必要性，這為監(jiān)測新的流行病學(xué)趨勢提供了新思路。

本研究結(jié)果表明導(dǎo)致急性中耳炎的金黃色葡萄球菌大多呈現(xiàn)多重耐藥狀態(tài)；通過對應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌特定的分子遺傳背景(CC)與抗生素耐藥表型與毒力基因型之間存在著顯著的對應(yīng)關(guān)系，不同的SA菌株、不同的克隆復(fù)合體的耐藥表型和攜帶的毒力基因均不一致；為基于多種表型-基因型特征區(qū)分金黃色葡萄球菌感染的致病性提供了新的研究思路。