李理 陳才 金澤坤 王友本

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.中新國際聯(lián)合研究院，廣東 廣州 510700；3. 廣州雅創(chuàng)環(huán)?？萍加邢薰?，廣東 廣州 511458)

隨著社會工業(yè)化和城市化進程的不斷推進，基于揮發(fā)性有機物(VOCs)出現(xiàn)的環(huán)境問題也日益嚴重?？刂茡]發(fā)性有機物的排放及揮發(fā)性有機物的治理已經(jīng)成為近年來研究的熱點。相對于傳統(tǒng)處理方法，生物治理法因其運行成本低、建設(shè)簡單、無二次污染等優(yōu)點而備受國內(nèi)外關(guān)注，逐漸成為當前揮發(fā)性有機物治理的主流。目前，生物治理法已被廣泛應(yīng)用到惡臭廢氣和VOCs的治理中[1- 2]。

活性污泥是一種由原核生物、真菌、微型動物、病毒等多種類型微生物，與它們所依附的有機物質(zhì)和無機物質(zhì)在一起所形成的復(fù)雜人工生態(tài)系統(tǒng)。活性污泥作為生物滴濾池中污染物轉(zhuǎn)化的主體，其生物活性從根本上決定著一個生物處理廠對有機廢氣的處理能力，而生物活性又與活性污泥中的微生物息息相關(guān)。近年來，很多研究者借助高通量測序技術(shù)等生物學(xué)手段研究了許多類型活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性和豐度的動態(tài)變化，全面揭示了活性污泥微生態(tài)系統(tǒng)與有機廢氣處理效率之間的相關(guān)性[3- 5]。因此，探明生物滴濾池活性污泥微生態(tài)中的微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性及豐度，對理解污染物去除的微生物機制、提高生物處理廠污染物處理效率具有十分重要的意義。

本文選取廣東某VOC處理系統(tǒng)生物滴濾池中的填料固形物進行實驗研究，采用 Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)對樣品進行微生物群落與多樣性分析，并對相關(guān)降解基因進行預(yù)測和注釋，同時為解決該工廠甲苯、二甲苯以及乙酸丁酯降解不充分的問題，利用唯一碳源培養(yǎng)基，從污泥中分離、馴化篩選了一批有降解潛力的菌株，有望通過生物強化手段改變生物滴濾池中的微生物群落結(jié)構(gòu)，提高甲苯和二甲苯等苯系污染物的降解效率。

1 材料與方法

1.1 樣品與培養(yǎng)基

樣品采自廣州市某油漆公司VOC處理系統(tǒng)中生物滴濾池的填料固形物。用干凈無菌袋在生物滴濾池中取少量污泥樣品，取樣后24 h內(nèi)帶回實驗室，進行實驗測定分析或樣品處理。剩余樣品于-80 ℃冰箱中保存。

馴化培養(yǎng)基：KH2PO4338.8 mg，Na2HPO4·12H2O 890.7 mg，(NH4)2SO4234.0 mg，Na2CO3100.0 mg，MgSO4·7H2O 59.3 mg，CaCl2·2H2O 5.16 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.37 mg，1 mL微量元素母液，蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。

篩選培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 1 g，KH2PO41 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.36 g，KNO30.5 g，CaCl20.001 g，1 mL微量元素母液，蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。

微量元素母液：FeCl2·4H2O 1 500 mg，Na2MoO4·2H2O 24 mg，CoCl2·6H2O 190 mg，ZnCl270 mg，MnSO4·7H2O 100 mg，MnCl2·4H2O 6 mg，CuCl2·2H2O 2 mg，NiCl2·6H2O 24 mg，蒸餾水1 000 mL。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：細菌DNA提取試劑盒，北京博邁德基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)；50×TBE(Tris硼酸)緩沖液、超純水、PCR Mix、DNA分子質(zhì)量標準Marker12、Gold view核酸染料、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，均購自廣州東盛生物科技有限公司；引物27F、引物1492R，購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

主要儀器：XSP-BM- 3CA生物顯微鏡，上海雷韻試驗儀器制造有限公司生產(chǎn)，TC- 96/G/H(b)C PCR擴增儀，杭州博日科技有限公司生產(chǎn)；BG-gdsAUTO(130)凝膠成像系統(tǒng)，北京百晶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；JW- 2010H高速離心機，安徽嘉文儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；Agilent Technologies 767A氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 活性污泥宏基因組PCR擴增與測序

本實驗基于Illumina Miseq高通量測序平臺，采用全基因組鳥槍法(WGS)策略，將提取獲得的菌群宏基因組總DNA隨機打斷為短片段，并構(gòu)建合適長度的插入片段文庫，然后對文庫進行雙端(PE)測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析

采用FastQC對測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，包括堿基質(zhì)量分布、序列平均質(zhì)量分布、堿基含量分布等，然后按照篩查標準進行有效序列的篩查過濾[6]。

序列的組裝拼接：以K-mer～的參數(shù)設(shè)置，調(diào)用megahit(https：∥hku-bal.github.io/megabox/)[7]，對每個樣本的雙端序列分別進行從頭組裝拼接，通過De Bruijn圖構(gòu)建Contigs和Scaffolds序列，并對生成的Contigs和Scaffolds序列進行組裝拼接效果評價。

非冗余序列集的構(gòu)建：將拼接組裝的宏基因組Scaffolds序列以2個連續(xù)的模糊堿基“N”為界，拆分為Scaftigs。隨后采用CD-HIT(高容錯性的集群數(shù)據(jù)庫)對樣本組裝拼接得到的所有Scaffolds，以0.95的相似度且覆蓋范圍大于0.9進行歸并取冗余，并以最長的序列作為該Scaftig的代表序列。

將生物滴濾池樣本(lcyp)的Scaffolds/Scafftigs序列與NCBI-NT數(shù)據(jù)庫(ftp：/ftp.ncbi.nih.gov/blast/db，v2016- 6- 19)中的細菌、古菌、真菌和病毒序列進行序列比對(E值[8]設(shè)定為0.001)。結(jié)合Scaffolds/Scaftigs序列在各樣本中的豐度(深度)數(shù)據(jù)，獲得樣本在各個分類等級(界、門、綱、目、科、屬、種)上的相對豐度分布。

1.5 功能基因的預(yù)測和注釋

對于上述拼接和分裝得到的高質(zhì)量基因組，根據(jù)基因在Scaffolds/Scaftigs 上的起始和終止位點，使用soap.coverage(http：∥soap.genomics.org.cn/)可以得到各蛋白代表序列在各樣本中所對應(yīng)的豐度(深度)數(shù)值，構(gòu)建對應(yīng)的樣本×蛋白豐度矩陣。將非冗余蛋白序列集與常用蛋白數(shù)據(jù)庫比對，從而對各樣本中的基因功能進行注釋分析。對于蛋白質(zhì)編碼序列，將其與已知的注釋信息數(shù)據(jù)庫KEGG和EggNOG比對，得到功能注釋，并檢測注釋的準確性，設(shè)定閾值為E<10-5。

1.6 降解菌的篩選與鑒定

準確稱取5 g生物滴濾池樣品接種于裝有100 mL馴化培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，通過0.22 μm濾膜添加一定濃度的甲苯、二甲苯或乙酸丁酯為唯一碳源，添加0.1%(體積分數(shù))吐溫80助溶且抑制底物的揮發(fā)，將錐形瓶置于30 ℃下，150 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)2 d后吸取5 mL培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接于更高濃度底物的新鮮培養(yǎng)基上。如此反復(fù)馴化2周，甲苯、二甲苯和乙酸丁酯馴化濃度梯度為：10、30、50、80、120 mg/L。分別取最后一次馴化培養(yǎng)物，稀釋10、102、103、104、105、106倍，吸取100 μL涂布于含有100 mg/L的甲苯、二甲苯或乙酸丁酯的篩選培養(yǎng)基上，以封口膜密封，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1 d，再將培養(yǎng)皿正置，培養(yǎng)數(shù)天。挑選平板上不同形態(tài)的優(yōu)勢菌落以平板劃線法在篩選培養(yǎng)基上劃線分離，重復(fù)3次后獲得純培養(yǎng)菌株，然后通過液體篩選培養(yǎng)基篩選出具有較高降解潛能的菌株，-80 ℃保藏。

使用硅膠膜離心柱法，用細菌基因組提取試劑盒提取分離菌株DNA，通過16S rDNA通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′)進行PCR擴增，PCR擴增體系如下：DNA 1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，2×PCR Mix 20 μL，超純水25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃末端延伸10 min。然后使用0.5×TBE緩沖液制備1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠并加入Gold view核酸染料，之后取適量PCR產(chǎn)物點樣并進行瓊脂糖凝膠電泳，然后照膠觀察。確認目標條帶清晰明亮且在正確的分子質(zhì)量范圍后，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒從PCR反應(yīng)液中回收DNA片段。將回收得到的DNA片段送到生工生物工程(廣州)公司進行DNA測序，并將拼接成功的DNA序列復(fù)制到NCBI上進行BLAST比對。

1.7 VOCs降解率的測定

將處于對數(shù)生長期的分離菌株按5%的接種量接種到含單一底物(分別為苯、甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、乙酸丁酯)的100 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中，用25 mL頂空瓶培養(yǎng)、鋁蓋密封，再用封口膜密封3層以防止揮發(fā)，設(shè)置3個平行樣，加等量無菌水作為空白參照，計算環(huán)境損失量。控制初始pH值為7.0，在30 ℃、140 r/min搖床上培養(yǎng)48 h，利用頂空氣相色譜測定培養(yǎng)液中的苯、甲苯、二甲苯、乙酸丁酯的殘余量。

頂空氣相色譜條件：氣相色譜儀，Agilent Technologies 767A型；色譜柱，Agilent Technologies HP- 5(30 m×0.32 mm×0.32 mm)；加熱箱50 ℃，定量環(huán)70 ℃，傳輸線80 ℃，平衡時間5 min，GC循環(huán)時間15 min，柱溫40 ℃，保持3 min，之后以15 ℃/min升溫到108 ℃保持3.5 min，進樣口溫度250 ℃，F(xiàn)ID檢測器溫度250 ℃，載氣(N2)流量30 mL/min，H2流量40 mL/min，空氣流量450 mL/min，分流比10：1。

式中，A為降解率，ρo、ρf分別為有機物添加量和殘余量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量分析

宏基因組的數(shù)據(jù)已提交給NCBI數(shù)據(jù)庫(登錄號：PRJNA731021)。通過高通量測序平臺整理原始數(shù)據(jù)，并進行統(tǒng)計優(yōu)化。樣本測定堿基總數(shù)為11 123 195 kbp，經(jīng)過拼接后，按照原始序列數(shù)據(jù)的篩查過濾標準對測序下機的原始數(shù)據(jù)進行篩選和過濾，測得有效序列總數(shù)為1 598 214條，平均長度范圍為200～116 666 bp，高質(zhì)量序列數(shù)占原始序列數(shù)的百分比和高質(zhì)量序列的堿基總數(shù)占原始序列堿基總數(shù)的百分比分別為99.91%和99.34%。在97%相似水平下，對測序樣品的有效序列進行操作分類單元(OTU)劃分，并進行生物信息統(tǒng)計，樣品得到了1 847 976個OTUs。

生物滴濾池樣品的稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)(Shannon)曲線如圖1所示。在IIIumina Miseq測序結(jié)果分析中，當樣品序列數(shù)量超過30 000條時，樣品的稀疏曲線(見圖1(a))逐步趨于平整，表明測序結(jié)果已經(jīng)足夠反映當前樣本所包含的物種組成，再增加測序數(shù)量也不太可能檢測出大量尚未發(fā)現(xiàn)的新物種，從而影響結(jié)果分析。同時，香農(nóng)指數(shù)曲線(見圖1(b))也逐漸趨于飽和，即當前測定可反映大多數(shù)微生物的信息。上述結(jié)果表明，此次測序樣品中微生物分析方法較為合理，可獲得有效的測序結(jié)果。

(a)稀疏曲線

考察樣品內(nèi)的微生物群落多樣性是研究一個群落樣品和解決生物學(xué)問題的重要手段[9]。通常研究微生物群落多樣性的主要指標包括物種豐富度估計、群落多樣性指數(shù)以及稀釋曲線[10]。Ace、Chao1指數(shù)用于表征樣品的物種豐富度，本樣品中Ace、Chao1指數(shù)分別為5 508.18、5 357.86，與先前的報道相比，本樣品中Ace、Chao1指數(shù)都明顯高于一般活性污泥[11- 12]，這表明本樣品中擁有更高的OTU豐度。Shannon指數(shù)表征微生物群落多樣性的豐富度和均勻度，Shannon值越大則說明群落多樣性越高。本樣品的Shannon指數(shù)為8.11，表明本樣品的菌群豐富度、物種多樣性很高，并形成了十分穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)。

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

生物滴濾池活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖2所示，活性污泥中細菌、真核生物、古菌、病毒的相對豐度分別為89.34%、1.99%、1.06%、0.03%，無法分類或未知門類相對豐度占比7.57%。樣品中共檢測出了微生物75門、195綱、395目、752科、1 798屬。

在門水平上(見圖2(a))，生物滴濾池活性污泥中占優(yōu)勢地位的前5個門分別為變形菌門(Proteobacteria，73.6%)、放線菌門(Actinobacteria，4.03%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，2.1%)、厚壁菌門(Firmicutes，1.42%)和綠彎菌門(Chloroflexi，1.23%)。與先前的報道相比，本研究中的樣品擁有更高比例的變形菌[11，13- 15]。大多數(shù)在生物脫氮、生物除磷及諸多污染物降解過程中起重要作用的微生物均歸屬于變形菌門[16]，表明此活性污泥可能具有更高的有機污染物降解潛力。此外，放線菌門在降解聚乳酸、低密度聚乙烯等生物基塑料和石油基塑料領(lǐng)域有諸多應(yīng)用[17- 18]，同時對于乙酰氨基酚及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(對氨基酚、鄰苯二酚和對苯二酚)等具有一定的降解能力[19]，后者為芳香烴降解的常見中間產(chǎn)物，表明放線菌在芳香烴的降解過程中具有承接作用，為芳香烴的完全降解起到了一定的作用。擬桿菌常見于各種厭氧降解反應(yīng)器中，具備促產(chǎn)甲烷活性[20]，通過與其他碳氫降解細菌對底物的共養(yǎng)利用，從而大量降解芳香烴化合物[21]。研究表明，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是對石油污染土壤的生物降解影響最大的3類微生物[22]，對于芳香烴類化合物的生物降解具有重要意義。

(a)門水平

細菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的組成和豐度如 圖2(b) 所示，樣品中相對豐度前20的屬主要是Dechloromonas(脫氯單胞菌屬)、Rubrivivax(紅長命菌屬)、Xanthobacter(黃色桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Burkholderia(伯克氏菌屬)、Rhodobacter(紅桿菌屬)、Thauera(陶厄氏菌屬)、Variovorax(貪噬菌屬)、Bradyrhizobium(根瘤菌屬)、Leptothrix、Paracoccus、Pelobacter(居泥桿菌屬)、Clostridium(梭菌屬)、Azoarcus(固氮弧菌屬)、Geobacter(地桿菌屬)、Cupriavidus(貪銅菌屬)、Methanothrix(甲烷絲菌屬)、Methylibium(甲基養(yǎng)菌屬)、Starkeya、Hydrogenophaga(噬氫菌屬)。該活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，并未形成絕對優(yōu)勢種屬，相對豐度占比最高的Dechloromonas的相對豐度為5.46%，Rubrivivax、Xanthobacter、Pseudomonas的相對豐度分別為2.0%、1.9%、1.87%。Dechloromonas能在細胞內(nèi)積累多磷酸鹽，在去除有機碳、氮以及磷等方面起關(guān)鍵作用[23]；此外，該菌屬還具有較高的高氯酸鹽和硝酸鹽的還原能力[24- 25]。Burkholderia可以降解常見烴類物質(zhì)，是芳烴污染的廢水中的優(yōu)勢屬[26]，還可降解焦化廢水中的苯酚和PAHs(芘)類物質(zhì)[27]。Xanthobacter可降解鹵代化合物和修復(fù)氯酸鹽污染[28- 29]，同時也可降解甲苯等芳香烴[30]。Pseudomonas是常見的芳香烴降解菌，可參與降解多種鹵代烴以及甲苯、二甲苯等單環(huán)芳香烴化合物[31- 33]。此外，Rhodobacter、Thauera、Paracoccus和Geobacter等也常見于各種廢水處理生物反應(yīng)器中[34- 35]。

樣品中檢測出的相對豐度為前20的種水平分類如圖2(c)所示，相對豐度占比前3位的為Dechloromonasaromatica(5.46%)、Rubrivivaxgelatinosus(2.0%)和Xanthobacterautotrophicus(1.89%)，與屬水平的分析結(jié)果一致，表明樣品中脫氯單胞菌屬、紅長命菌屬和黃色桿菌屬以這3個種為主。其中Dechloromonasaromatica是還原高氯酸鹽和氧化氯苯酸鹽、甲苯和二甲苯的典型菌種[36- 37]。Rubrivivaxgelatinosus是一種常見于水體沉積物的菌種，其可利用各種碳水化合物及有機酸[38]，但鮮有報道可用于VOC的降解。Xanthobacterautotrophicus因具有降解鹵代化合物的能力而被廣泛研究，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值[28，39]。此外，樣品中還檢測出了Leptothrixcholodnii、Pelobacterpropionicus、Clostridiumbotulinum、Starkeyanovella、Rhodobactersphaeroides、Methylibiumpetroleiphilum、Methanothrixsoehngenii、Azospiraoryzae、Thauerasp.K11、Ramlibactertataouinensis、Caldilineaaerophila、Sorangiumcellulosum、CandidatusAccumulibacterphosphatis、CaulobacteraceaebacteriumOTSz_A_272、Sulfuritaleahydrogenivorans、Variovoraxsp.HW608、Variovoraxparadoxus等多個種，并已有Pelobacterpropionicus在異常有機物的發(fā)酵降解和共營養(yǎng)代謝中發(fā)揮重要作用的報道[40]，其有可能對生物滴濾池中VOC的降解起促進作用。Rhodobactersphaeroides是一種重要的微生物功能菌，在生物除磷、重金屬污染土壤修復(fù)等領(lǐng)域具有重要意義[41- 42]。此外，也有Clostridiumbotulinum、Methylibiumpetroleiphilum、CandidatusAccumulibacterphosphatis、Sulfuritaleahydrogenivorans和Variovoraxparadoxus等可降解有機磷、酯類、芳香烴等有機物的報道[43- 48]，它們是重要的生物修復(fù)功能菌種。

總的來說，本研究中的活性污泥具備較高的微生物多樣性及穩(wěn)定性，同時具備降解鹵代、烴類、酚類、芳香烴和有機塑料等多種有機污染物的功能基因。活性污泥中的主要菌屬都具有降解各類有機化合物的潛力，是潛在的生物降解菌種資源庫，蘊含豐富的降解菌種資源。

2.3 功能基因的預(yù)測和注釋

將非冗余基因集與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，共870 163個Unigene注釋到KEGG的代謝通路中，分屬于6個大類、45個第2等級代謝通路子功能，其中代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞進程4大類代謝通路占比較大，如圖3所示。第2等級代謝通路子功能中占比前5位的為碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝、核苷酸代謝，代謝途徑占比分別為14.37%、10.76%、7.01%、4.86%、4.53%。碳水化合物代謝通路主要包括三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝、磷酸戊糖和糖酵解等途徑，這些途徑一般為微生物生長的正常代謝途徑，也作為各種污染物徹底分解的最終途徑。此外，在外源性生物降解與代謝子通路途徑的基因注釋數(shù)為26 166個，包括各種酯類、烷烴類、芳香烴類、醛類、固醇類及細胞色素等的復(fù)雜有機物的降解通路途徑。以二甲苯降解通路為例，樣品基因組中檢測到了完整的二甲苯降解途徑，包括todc1、todc2、xylE和catE等多個關(guān)鍵酶基因。todc1和todc2是甲苯雙加氧酶的兩個亞基，xylE和catE是鄰苯二酚- 2，3雙加氧酶，這兩個酶是甲苯降解過程中的關(guān)鍵酶和限速酶。這些酶蛋白對應(yīng)的注釋基因的數(shù)量和種類眾多，表明活性污泥樣本中可能存在多個菌種能以此途徑對二甲苯進行降解，也說明降解二甲苯的潛在菌種資源豐富。此活性污泥具有強大的降解VOC能力，可通過培養(yǎng)組學(xué)分離具備降解特定有機污染物的菌株，用于生物處理廠處理相應(yīng)的廢水、廢氣，具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖3 KEGG第2等級代謝通路的注釋結(jié)果統(tǒng)計圖

2.4 優(yōu)勢降解菌株的篩選和鑒定分析

利用馴化培養(yǎng)基，通過3種底物(甲苯、二甲苯和乙酸丁酯)對生物滴濾池的活性污泥樣品進行2周的馴化，然后用篩選培養(yǎng)基從活性污泥樣品中分離出了54株有潛在降解能力的菌株(見表1)，包括18株甲苯降解菌、21株二甲苯降解菌和 15株 乙酸丁酯降解菌。54株菌株在馴化培養(yǎng)基和初篩培養(yǎng)基上均能較好生長，如圖4所示，菌株菌落呈圓形、淺黃色不透明，表面光滑濕潤且有光澤，邊緣光滑、中央凸起，油鏡下為短桿狀或球狀。革蘭氏染色結(jié)果顯示，所篩菌種均為革蘭氏陰性菌，以短桿狀、球狀和梭狀形態(tài)為主。

(a)假單胞菌宏觀菌落圖

對于不同底物篩選培養(yǎng)基篩選出的54株有潛在降解能力的菌株，采用16S rRNA通用引物擴增菌種的保守序列，核酸凝膠電泳結(jié)果如圖5所示，擴增出來的所有條帶分子質(zhì)量均在1 500 bp左右，每個泳道中的條帶單一、清晰明亮。

圖5 部分菌株基于16S rDNA序列PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification products of some isolated strains

經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化并送由測序公司測序后，將拼接成功的基因序列在NCBI庫進行序列比對之后選取同源性最高的菌種作為初步鑒定結(jié)果(見表1)，相似度均在99%以上。16S rRNA鑒定結(jié)果顯示，18株甲苯降解菌均為不動桿菌屬，其中CT3、CT5、CT6與貝氏不動桿菌(Acinetobacterbereziniaestrain)的相似度為100%，CT9與鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumanniistrain)的相似度為100%。21株二甲苯降解菌中有3株被鑒定為假單胞菌，分別是CX18被鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonassp.strain)、CX20被鑒定為香魚假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicidastrain)以及CX21被鑒定為摩氏假單胞菌(Pseudomonasmosseliistrain)，其余18株均為不動桿菌，包括1株醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticusstrain)、3株鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumanniistrain)以及14株鑒定到屬的不動桿菌。15株乙酸丁酯降解菌中有 3株 假單胞菌以及12株不動桿菌，包括4株貝氏不動桿菌(Acinetobacterbereziniaestrain)、4株皮特不動桿菌(Acinetobacterpittiistrain)以及1株醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticusstrain)。

表1 54株降解菌的16S rDNA鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of 16S rDNA of 54 strains of degrading bacteria

通過表1可以發(fā)現(xiàn)，從活性污泥中分離得到的以甲苯、二甲苯和乙酸丁酯為目標降解物的菌株主要是假單胞菌屬和不動桿菌屬兩個屬，說明假單胞菌屬和不動桿菌屬對甲苯、二甲苯和乙酸丁酯有很強的適應(yīng)能力，同時極有可能具備降解多種VOC的能力。假單胞菌屬是常見報道的苯系物降解菌[49- 51]。劉虹等[52]從石油污染土壤中篩選、分離出一株假單胞菌，其在35 ℃、pH值為8時對石油烴降解率達到75.4%；Feng等[53]利用惡臭假單胞菌(Pseudomonasputidasw- 3)和橡膠紅球菌(RhodococcusruberSS- 4)進行生物強化，對苯、甲苯以及苯乙烯的混合廢氣去除效率穩(wěn)定在82.5%～89.8%之間，同時有研究表明這兩種菌在處理苯系物過程中具有協(xié)同作用。Chen等[54]研究發(fā)現(xiàn)一株P(guān)seudomonassp.XM- 01與Acinetobactersp.XM- 02協(xié)同培養(yǎng)后10 d內(nèi)對石油的降解率達到87.29%，比Acinetobactersp.XM- 02單獨降解的降解率提升了12.97%。雖有不動桿菌可用于降解吲哚以及各種油脂的報道[55- 57]，但關(guān)于其對于乙酸丁酯的降解目前還沒有報道過。

2.5 優(yōu)勢降解菌株對VOCs的降解率分析

從54株菌中優(yōu)選出兩株(1株P(guān)seudomonasplecoglossicidaCX20、1株AcinetobacterpittiiCBA12)在單一底物培養(yǎng)基上生長狀況良好的菌株，分別對苯、甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、乙酸丁酯降解率進行測定(見圖6)。在以相應(yīng)單一VOC為唯一碳源的培養(yǎng)基中兩株菌都能良好生長，其中二甲苯降解菌PseudomonasplecoglossicidaCX20對不同底物的降解能力存在顯著性差異(見 圖6(a))。菌株CX20對甲苯、間二甲苯和對二甲苯的降解率最高，反應(yīng)48 h后降解率分別達到了99.98%、88.34%和99.89%，說明PseudomonasplecoglossicidaCX20具有很好的降解甲苯、間二甲苯和對二甲苯的能力。相比較下，菌株利用苯和鄰二甲苯的能力一般，降解率僅為7.25%和3.76%。PseudomonasplecoglossicidaCX20對于同樣具備苯環(huán)結(jié)構(gòu)的苯和鄰二甲苯的降解能力如此之低，說明對于結(jié)構(gòu)類似的苯系物，其降解途徑也未必一樣，同一菌種對其降解能力也會出現(xiàn)顯著差異。例如，Khodaei等[58]從石油污染的地下水中分離到一株能夠降解BTEX化合物的假單胞菌(Pseudomonaszhaodongensis)，其能完全降解苯、甲苯和乙苯，卻不能降解二甲苯。其他許多研究同樣發(fā)現(xiàn)不同BTEX的降解難易程度存在很大差異[59- 61]。此外，鄰二甲苯雖然是二甲苯的一種同分異構(gòu)體，但與另外兩種同分異構(gòu)體相比，其對微生物的生長有更嚴重的生物毒性，是BTEX生物降解最有效的抑制劑[62]，因此往往也難以被菌種利用。

(a)CX20的降解率

乙酸丁酯降解菌CBA12(見圖6(b))的情況則相反，在48 h內(nèi)能把100 mg/L乙酸丁酯完全降解，但對于苯系物的降解效果卻不明顯，對鄰二甲苯和間二甲苯稍有降解，降解率分別為7.59%和14.12%，而對苯、甲苯和對二甲苯幾乎不降解，顯然菌株CBA12對于乙酸丁酯具有很強的降解能力。關(guān)于乙酸丁酯降解菌種的報道比較少，Cheng等[63]利用兩種真菌(AspergillusfumigatesHD- 2和OphiostomastenocerasLLC)和一種細菌(ZoogloearesiniphilaHJ)構(gòu)建了一種復(fù)合固體微生物劑，對120 mg/L到180 mg/L的乙酸丁酯的降解效率均在90%以上；Mathur等[64]報道了一株Shewanellaputrefaciens在70 h內(nèi)可降解500 mg/L以下的乙酸丁酯?？梢钥闯觯m然乙酸丁酯屬于較易降解VOC物質(zhì)，但本研究篩選出的菌株CBA12仍不失為一種優(yōu)良的乙酸丁酯降解菌，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

通過宏基因組技術(shù)，對VOC處理系統(tǒng)生物滴濾池中的填料固形物進行微生物群落與多樣性分析顯示，活性污泥的微生物以細菌為主，占總量的89.34%，主要分布為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和綠彎菌門等，其中變形菌門占絕對優(yōu)勢，遠高于一般活性污泥。在屬水平上主要有Dechloromonas(脫氯單胞菌屬)、Rubrivivax(紅長命菌屬)、Xanthobacter(黃色桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Burkholderia(伯克氏菌屬)、Rhodobacter(紅桿菌屬)、Thauera(陶厄氏菌屬)、Variovorax(貪噬菌屬)、Bradyrhizobium(根瘤菌屬)、Leptothrix、Paracoccus、Pelobacter(居泥桿菌屬)、Clostridium(梭菌屬)、Azoarcus(固氮弧菌屬)、Geobacter(地桿菌屬)、Cupriavidus(貪銅菌屬)、Methanothrix(甲烷絲菌屬)、Methylibium(甲基養(yǎng)菌屬)、Starkeya、Hydrogenophaga(噬氫菌屬)等，活性污泥菌種資源豐富，具有酯類、烴類、芳香烴類、醛類、固醇類及細胞色素等多個降解通路基因，具備除磷除氮，降解農(nóng)藥、塑料、鹵代烴、苯系物等多種有機物的能力。

利用馴化培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基從活性污泥中共篩選出54株具有降解潛力的降解菌株，經(jīng)鑒定，所篩菌株主要為不動桿菌和假單胞菌兩種。對VOC的降解性能進行測定，PseudomonasplecoglossicidaCX20對甲苯、間二甲苯和對二甲苯降解效果良好，48 h內(nèi)降解率分別達到了99.98%、88.34%和99.89%；而AcinetobacterpittiiCBA12能夠在48 h內(nèi)完全降解100 mg/L的乙酸丁酯，兩株菌存在明顯的底物降解特異性差異，說明通過單一底物培養(yǎng)基篩選不同VOC組分的降解菌是可行的。然而本實驗僅使用一種唯一碳源培養(yǎng)基分離特異降解BTEX的菌株，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分過于簡單，絕大多數(shù)細菌無法正常生長，篩選出的降解菌種過于單一，宏基因組學(xué)研究顯示，此活性污泥是優(yōu)秀的菌種資源庫，有望通過其他手段進一步從中篩選出更多優(yōu)良的降解菌種。