王永華 莫舒欣 肖正 雷長(zhǎng)梅

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

二十碳五烯酸(EPA)是一種對(duì)人體十分重要的n3-多不飽和脂肪酸(PUFAs)，在保健食品、藥品、飼料等行業(yè)具有廣闊的商業(yè)前景，對(duì)于心血管疾病的防治、精神分裂癥、抑郁癥的治療及抗炎抗癌等方面具有重要的生理功能[1- 7]。EPA的傳統(tǒng)來(lái)源是深海魚(yú)油，但由于受到海洋資源日益枯竭和環(huán)境污染如核泄露等因素的影響，魚(yú)油的質(zhì)量和產(chǎn)量不盡如人意，無(wú)法滿足人們對(duì)EPA日益增長(zhǎng)的需求，尋找一條可持續(xù)的綠色生產(chǎn)途徑是目前亟待解決的問(wèn)題。海洋微藻是PUFAs的初級(jí)生產(chǎn)者，生長(zhǎng)要求的營(yíng)養(yǎng)相對(duì)簡(jiǎn)單，環(huán)境因素適中且容易控制，成為PUFAs的替代來(lái)源，受到人們的廣泛重視。目前，常見(jiàn)產(chǎn)EPA的微藻如三角褐指藻[8- 10](Phaeodactylumtricornutum)、菱形藻[11- 13](Nitzschialaevis)、微擬球藻[14- 15](Nannochloropsissp.)等微生物生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)溫度低，且在發(fā)酵過(guò)程中需要光照等，因而生物量往往小于5 g/L。由于生物產(chǎn)量和EPA產(chǎn)率低下且發(fā)酵成本高，大大限制了微藻來(lái)源EPA的工業(yè)化開(kāi)發(fā)。

微藻油脂中的脂肪酸組成會(huì)隨著環(huán)境脅迫而變化，溫度和溶氧(DO)是影響生物生長(zhǎng)和油脂積累的關(guān)鍵因素，顯著影響產(chǎn)油微藻的脂肪酸組成。Chodchoey等[16]發(fā)現(xiàn)隨著溫度從30 ℃降至12 ℃，破囊壺菌Aurantiochytriummangrovei總脂肪酸(TFAs)中的二十二碳六烯酸(DHA)所占比例從28.90%上升至41.81%；Jakobsen等[17]研究了氧限制對(duì)破囊壺菌Aurantiochytriumsp.T66中DHA生成的影響，結(jié)果表明，在低溶氧條件下，DHA含量達(dá)到52.12%，而對(duì)照組僅為25.03%。然而，改善PUFAs的應(yīng)激策略通常以降低生物量為代價(jià)，但這可以通過(guò)階段控溫和控氧發(fā)酵來(lái)解決。Liang等[18]通過(guò)30 ℃(發(fā)酵4 d)- 25 ℃(發(fā)酵3 d)- 20 ℃(發(fā)酵1 d)- 15 ℃(發(fā)酵4 d)的階段控溫發(fā)酵策略來(lái)提高畸雌腐霉Pythiumirregulare的EPA產(chǎn)量，階段控溫發(fā)酵策略與優(yōu)化前相比，發(fā)酵時(shí)間從 12 d縮短至9 d，EPA產(chǎn)量從211.7 mg/L上升至243.1 mg/L；Ren等[19]采用階段控氧策略發(fā)酵裂殖壺菌Schizochytriumsp.HX- 308，獲得較高的生物量(71 g/L)和DHA含量(48.95%)，以上研究表明，階段控制溫度或供氧的策略對(duì)微藻的細(xì)胞生長(zhǎng)和PUFAs合成有明顯影響。

裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)是一種異養(yǎng)海洋真菌，具有生長(zhǎng)速度快、發(fā)酵成本低和DHA含量高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為工業(yè)化生產(chǎn)DHA的菌株，EPA也存在其脂肪酸中[19]。Schizochytriumsp.ATCC 20888中存在兩條脂肪酸合成途徑，其中，短鏈飽和脂肪酸主要由脂肪酸合成酶(FAS)途徑合成，DPA、DHA等多不飽和脂肪酸則為聚酮合成酶(PKS)途徑的產(chǎn)物[20- 21]。EPA與DHA結(jié)構(gòu)相似，為DHA的前體物質(zhì)，微藻油脂中DHA可由EPA經(jīng)過(guò)碳鏈延長(zhǎng)和去飽和進(jìn)一步合成，若在高產(chǎn)DHA的裂殖壺菌細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)環(huán)境脅迫阻斷EPA向DHA轉(zhuǎn)化的途徑，則可能會(huì)大幅提高EPA的產(chǎn)量。所以，富含DHA的裂殖壺菌具有一定生產(chǎn)EPA的潛力。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于裂殖壺菌的研究主要集中在誘變育種和發(fā)酵工藝優(yōu)化來(lái)提高DHA產(chǎn)量[22- 23]，而對(duì)于裂殖壺菌作為EPA的生產(chǎn)菌株的可行性研究較少，且產(chǎn)量較低，難以滿足產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)需求。裂殖壺菌作為我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品的DHA藻油來(lái)源之一，其藻油安全性已獲得確認(rèn)，探究其生產(chǎn)EPA的可行性，并提高產(chǎn)量，從而實(shí)現(xiàn)EPA工業(yè)化生產(chǎn)十分必要。本研究建立了一種兩階段控溫-低溶氧控制發(fā)酵工藝(TST-LDO)來(lái)促進(jìn)裂殖壺菌產(chǎn)EPA，以期為裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)EPA油脂工業(yè)化提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)室從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，USA)購(gòu)買獲得裂殖壺菌菌株Schizochytriumsp.ATCC 20888。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖(AR(分析純)，CAS號(hào)：58367- 01- 4)、硫酸鈉(AR，CAS號(hào)：7757- 82- 6)、硫酸鎂(AR，CAS號(hào)：22189- 08- 8)，購(gòu)自無(wú)錫市佳妮化工有限公司；谷氨酸鈉(食品級(jí)，CAS號(hào)：142- 47- 2)，購(gòu)自上海太太樂(lè)食品有限公司；酵母浸粉(AR，CAS號(hào)：8013- 01- 2)，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；硫酸銨(AR，CAS號(hào)：7783- 20- 2)，購(gòu)自廣東廣試試劑科技有限公司；磷酸二氫鉀(AR，CAS號(hào)：7778- 77- 0)，購(gòu)自福晨化學(xué)試劑有限公司；氯化鉀(AR，CAS號(hào)：7447- 40- 7)，購(gòu)自江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

金屬離子混合液：Na2EDTA 6 g/L、FeSO4·7H2O 0.58 g/L、MnCl2·4H2O 0.86 g/L、ZnSO4·7H2O 1.42 g/L、CoCl2·6H2O 0.01 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.01 g/L、NiSO4·6H2O 0.06 g/L、CuSO4·5H2O 0.6 g/L。

固體培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L、磷酸二氫鉀 3.5 g/L、谷氨酸鈉60 g/L、酵母浸粉10 g/L、硫酸銨1.5 g/L、七水硫酸鎂4.48 g/L、氯化鉀1 g/L、無(wú)水硫酸鈉37 g/L、金屬離子混合液 2 mL/L，瓊脂粉18 g/L。種子培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L、磷酸二氫鉀3.5 g/L、谷氨酸鈉60 g/L、酵母浸粉10 g/L、硫酸銨1.5 g/L、七水硫酸鎂4.48 g/L、氯化鉀1 g/L、無(wú)水硫酸鈉37 g/L、金屬離子混合液2 mL/L。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L、磷酸二氫鉀3.5 g/L、谷氨酸鈉40 g/L、酵母浸粉10 g/L、硫酸銨4.8 g/L、七水硫酸鎂4.48 g/L、氯化鉀1 g/L、無(wú)水硫酸鈉37 g/L、金屬離子混合液2 mL/L。高溫蒸汽滅菌：121 ℃，20 min。葡萄糖單獨(dú)滅菌：115 ℃，20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)

菌種活化：將保藏于-80 ℃超低溫冰箱中的甘油管菌株劃線接種于平板固體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)2 d。

種子培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取單菌落接入裝有 5 mL 種子培養(yǎng)基的20 mL試管中，180 r/min、28 ℃培養(yǎng)2 d；以10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量將上述種子液接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL擋板錐形瓶中，180 r/min、28 ℃培養(yǎng)1 d。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：為了研究溫度的影響，以10%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(100 mL/500 mL擋板三角瓶)，180 r/min培養(yǎng)120 h，0～24 h 之間，控制發(fā)酵溫度為28 ℃，24 h 后分別設(shè)置發(fā)酵溫度為20、25、28、32、34、36和38 ℃，72 h 時(shí)向搖瓶中補(bǔ)加葡萄糖至終質(zhì)量濃度為50 g/L，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：3 L發(fā)酵培養(yǎng)基加入5 L發(fā)酵罐(BIOTECH- 5BG型，上海保興生物設(shè)備工程有限公司生產(chǎn))中，接種量為10%，轉(zhuǎn)速為600 r/min，通氣量為3 L/min，用2 mol/L NaOH溶液或HCl溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖含量降至20 g/L 時(shí)，連續(xù)流加700 g/L的葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中的葡萄糖含量保持在10～ 20 g/L，4個(gè)發(fā)酵批次條件設(shè)置如下：①為驗(yàn)證溫度影響，分別設(shè)置發(fā)酵溫度工藝為28 ℃(0～120 h)、28 ℃(0～24 h)→34 ℃(24～120 h)；②為探究變溫時(shí)間點(diǎn)的影響，選擇24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將發(fā)酵溫度由28 ℃提高到34 ℃；③為了研究?jī)呻A段控溫條件下不同溶氧水平對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)及EPA合成的影響，通過(guò)控制轉(zhuǎn)速和通氣將DO控制在不同溶氧水平，當(dāng)溶氧水平開(kāi)始增加時(shí)，控制轉(zhuǎn)速和通氣使其維持在25%DO(高溶氧水平)、10%DO(中溶氧水平)和2%DO(低溶氧水平)；④根據(jù)上述最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立TST-LDO發(fā)酵工藝，每批次發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.2.2 生物量、葡萄糖及谷氨酸鈉含量測(cè)定

生物量用菌體干重(DCW)表示，生物量測(cè)定方法是取2 mL發(fā)酵培養(yǎng)液于離心管中，8 000 r/min離心5 min，將上清液和菌體分開(kāi)，并用37 g/L 硫酸鈉溶液將菌體洗滌離心2-3次，80 ℃ 烘干至恒重后稱重。利用生物傳感儀(SBA- 40C型，山東省科學(xué)院生物研究所生產(chǎn))測(cè)定上清液的葡萄糖及谷氨酸鈉含量。

1.2.3 油脂產(chǎn)量測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液加入50 mL離心管中進(jìn)行離心洗滌，得到濕菌體，之后加入10 mL濃鹽酸，混勻后置于80 ℃水浴反應(yīng)1 h，期間振蕩混勻3-4次。反應(yīng)結(jié)束后加入正庚烷萃取油脂，重復(fù)3-4次直至有機(jī)層無(wú)色，然后在旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器中除去溶劑，置于烘箱干燥至恒重后稱重。

1.2.4 脂肪酸組成測(cè)定

將2 mL 2%氫氧化鈉-甲醇溶液加至裝有0.2 g油脂和50 μL 16 g/L二十一碳烷酸(內(nèi)標(biāo))的15 mL 離心管中，在60 ℃水浴中反應(yīng)30 min，期間震搖3-5次，反應(yīng)結(jié)束后加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，繼續(xù)在60 ℃水浴中反應(yīng)2 min，取出離心管迅速冷卻至室溫，加入2 mL正庚烷和5 mL 飽和氯化鈉溶液，混勻后靜置分層，取上層有機(jī)相加入裝有1 g無(wú)水硫酸鈉的2 mL離心管中，混勻靜置后，吸取上層溶液1 mL于氣相色譜瓶中進(jìn)行氣相色譜分析。

氣相色譜系統(tǒng)為安捷倫公司生產(chǎn)的GC- 7890B，GC系統(tǒng)配備毛細(xì)管柱(CP-SIL 88，60 m×0.25 mm×0.2 μm)和氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)。進(jìn)樣器溫度為270 ℃，檢測(cè)器溫度為280 ℃，程序升溫：初始溫度為100 ℃，持續(xù)13 min；100～180 ℃，升溫速率為10 ℃/min，保持6 min；180～200 ℃，升溫速率為1 ℃/min，保持20 min；200～230 ℃，升溫速率為4 ℃/min，保持10.5 min。載氣：氮?dú)?；分流比?00：1；進(jìn)樣體積：1.0 μL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Origin 2017 軟件作圖，并用SPSS 24.0軟件進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對(duì)裂殖壺菌產(chǎn)EPA發(fā)酵性能的影響

Schizochytriumsp.ATCC 20888是經(jīng)過(guò)Barclay篩選的在20 ℃以上繁殖速度快的DHA高產(chǎn)菌株[24]。由圖1可知，其最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，最高生物量和油脂產(chǎn)量分別為33.06 g/L和9.41 g/L。從28 ℃開(kāi)始，無(wú)論溫度升高還是降低，生物量和脂肪產(chǎn)量均呈下降趨勢(shì)，當(dāng)溫度高于32 ℃時(shí)，下降趨勢(shì)更明顯，溫度升高至34 ℃時(shí)生物量為24.96 g/L，油脂產(chǎn)量為4.29 g/L，與28 ℃恒溫發(fā)酵時(shí)相比分別降低24.50%、45.58%。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，溫度的升高對(duì)油脂的積累有較大的影響，發(fā)酵溫度通過(guò)影響細(xì)胞生物量從而影響了油脂產(chǎn)量，菌株在36 ℃和38 ℃下生長(zhǎng)緩慢，生物量和油脂產(chǎn)量都較低。

(a)生物量和油脂產(chǎn)量變化情況

溫度的變化對(duì)脂肪酸成分的影響較大(見(jiàn)圖1(b))，隨著培養(yǎng)溫度的升高，飽和脂肪酸(SFAs)和PUFAs含量的變化趨勢(shì)幾乎相反，溫度從20 ℃升高至34 ℃，主要的飽和脂肪酸C16：0(棕櫚酸)的含量由28.0%下降到10.57%，在38 ℃ 時(shí)又上升到26.45%；DHA和DPA n6的變化趨勢(shì)相似，均呈先上升后下降的趨勢(shì)，其含量峰值在32～34 ℃之間；在20～28 ℃下培養(yǎng)時(shí)，脂類中EPA的含量小于1%，幾乎沒(méi)有EPA的積累，當(dāng)發(fā)酵溫度升高至32 ℃時(shí)，EPA含量顯著增加到3.88%，約是28 ℃時(shí)的4倍，34 ℃時(shí)EPA的含量最高，為8.35%。這種上升趨勢(shì)并沒(méi)有隨著培養(yǎng)溫度的升高而升高，當(dāng)溫度高于34 ℃時(shí)，EPA含量開(kāi)始下降，特別是在38 ℃培養(yǎng)時(shí)，EPA含量迅速下降至0.55%，與20～28 ℃培養(yǎng)時(shí)相近。以上結(jié)果表明EPA和DHA在高溫作用下具有不同的變化趨勢(shì)，EPA含量增加的同時(shí)，DHA含量并未隨之降低，而是保持不變，甚至在一定程度上有所增加，這說(shuō)明在溫度的影響下并沒(méi)有改變EPA轉(zhuǎn)化為DHA的合成效率，而是加快了C16：0向EPA的轉(zhuǎn)化，卻不是作用于DHA。由此推測(cè)Schizochytriumsp.ATCC 20888中EPA和DHA的代謝途徑可能存在差異，并且存在一定環(huán)境脅迫時(shí)可能有助于EPA的積累。

溫度對(duì)細(xì)胞膜的流動(dòng)性、酶活等有顯著影響，是影響微生物生長(zhǎng)代謝及胞內(nèi)生化組分的一個(gè)關(guān)鍵性因素。細(xì)胞膜的空間結(jié)構(gòu)為脂質(zhì)雙分子層，是一種流動(dòng)模型，生物的物質(zhì)及能量合成、分解、運(yùn)輸?shù)裙δ芏夹枰?xì)胞膜的參與，細(xì)胞膜通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸比例從而耐受不同溫度。已有大量研究表明[25- 26]，在低溫脅迫下，細(xì)胞膜中的PUFAs比例會(huì)增加，從而維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞生理功能，Xing等[27]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析技術(shù)分析高溫(32 ℃)和低溫(10 ℃)兩種培養(yǎng)溫度下產(chǎn)油微藻AuxenochlorellaprotothecoidesUTEX 2341的脂肪酸組成變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫可以激活A(yù)cetyl-CoA羧化酶和Ⅱ型FAS酶的基因，從而對(duì)葉綠體內(nèi)的脂肪酸代謝產(chǎn)生影響，提高了PUFAs的含量，高溫條件下可以通過(guò)激活A(yù)cetyl-CoA羧化酶、I型多酮合酶和延長(zhǎng)酶復(fù)合物的大量表達(dá)，來(lái)誘導(dǎo)PUFAs和極長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(VLCFAs)的生物合成，使VLCFAs占總脂肪酸的百分含量與低溫發(fā)酵時(shí)相比增加109.80%。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，裂殖壺菌中PUFAs的表達(dá)量對(duì)培養(yǎng)溫度十分敏感，這可能與膜結(jié)合的去飽和酶的活性有關(guān)。

根據(jù)生物量、油脂產(chǎn)量和脂肪酸組成的結(jié)果，篩選出34 ℃為誘導(dǎo)EPA積累的最佳培養(yǎng)溫度。

2.2 5 L發(fā)酵罐中驗(yàn)證溫度對(duì)裂殖壺菌產(chǎn)EPA發(fā)酵性能的影響

為了驗(yàn)證兩階段變溫發(fā)酵策略能促進(jìn)EPA積累的現(xiàn)象，是否可以應(yīng)用于更大規(guī)模的發(fā)酵過(guò)程中，在5 L的發(fā)酵罐中進(jìn)行了試驗(yàn)。表1顯示了兩種溫度控制策略在恒定轉(zhuǎn)速與通氣條件下對(duì)生物量和油脂產(chǎn)量的影響，在變溫條件下，生物量和油脂產(chǎn)量分別為45.28 g/L和8.41 g/L，比28 ℃恒溫條件下分別降低29.50%和62.98%，結(jié)果表明高溫培養(yǎng)對(duì)油脂產(chǎn)量有更明顯的影響。

表1 5 L發(fā)酵罐中不同溫度條件下裂殖壺菌的生物量及油脂產(chǎn)量Table 1 Biomass and lipid production of Schizochytrium sp. in 5 L reactors at different temperatures

從表2可以看出，兩種溫度策略對(duì)脂肪酸組成的影響顯著。恒溫發(fā)酵條件下，培養(yǎng)至24～48 h時(shí)，SFAs占總脂肪酸的百分含量在起始階段快速下降，發(fā)酵至48 h后緩慢上升，DHA和DPA n6含量在發(fā)酵過(guò)程呈下降趨勢(shì)，EPA和DPAn3含量在發(fā)酵過(guò)程呈上升趨勢(shì)，在變溫發(fā)酵條件下，SFAs含量一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)其含量為14.04%，僅為恒溫發(fā)酵的50.53%，EPA和DPAn3含量在發(fā)酵過(guò)程仍呈上升趨勢(shì)，但增加幅度大于恒溫發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束時(shí)EPA占總脂肪酸的百分含量增加至7.17%，是恒溫條件下的8.33倍，DHA占總脂肪酸的百分含量在整個(gè)發(fā)酵周期中基本保持穩(wěn)定。由于EPA和DHA在整個(gè)發(fā)酵周期中的變化趨勢(shì)并不相似，由此可推測(cè)在裂殖壺菌中，EPA和DHA的積累代謝途徑可能存在差異，并且存在溫度脅迫時(shí)有助于EPA的積累。

表2 5 L發(fā)酵罐中不同溫度條件下裂殖壺菌脂肪酸含量的變化情況

2.3 變溫時(shí)間對(duì)裂殖壺菌產(chǎn)EPA發(fā)酵性能的影響

變溫時(shí)間對(duì)裂殖菌發(fā)酵性能的影響如圖2(a)所示。結(jié)果表明，與恒溫發(fā)酵對(duì)照組(CT組)相比，在高溫條件下裂殖壺菌的生長(zhǎng)受到抑制，升溫時(shí)間越早，生物量和油脂產(chǎn)量越低，與CT組相比，變溫時(shí)間為24 h時(shí)，生物量和油脂產(chǎn)量下降幅度最大。不同的變溫時(shí)間對(duì)EPA的含量和產(chǎn)量有很大的影響(見(jiàn)圖2(b))，在變溫時(shí)間為24 h后，EPA占總脂肪酸的百分含量變化最為顯著，而在變溫時(shí)間為48 h和72 h時(shí)EPA占總脂肪酸的百分含量增加幅度較小，EPA的產(chǎn)量分別為0.293 g/L(CT)、0.667 g/L(24 h)、0.520 g/L(48 h)和0.462 g/L(72 h)。因此，變溫時(shí)間為24 h最有利于裂殖壺菌中EPA的積累。

(a)生物量和油脂產(chǎn)量的變化情況

2.4 溶氧條件對(duì)裂殖壺菌產(chǎn)EPA發(fā)酵性能的影響

氧在需氧微生物的生長(zhǎng)和代謝物積累過(guò)程中起著重要作用，裂殖壺菌兩種脂肪酸的合成途徑中，F(xiàn)AS途徑需要氧分子參與，PKS途徑則不依賴氧分子[28]。為探究不同溶氧水平對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵性能的影響，分別研究在恒定條件(轉(zhuǎn)速600 r/min、恒定通氣量3 L/min)和3種溶氧水平下裂殖壺菌的生物量、油脂產(chǎn)量和EPA占總脂肪酸百分含量的變化情況。在階段控溫(28 ℃(0～24 h)→34 ℃(24～120 h))發(fā)酵條件下，5 L發(fā)酵罐的起始轉(zhuǎn)速為600 r/min，起始通氣量為3 L/min，當(dāng)溶氧開(kāi)始上升時(shí)，通過(guò)改變轉(zhuǎn)速和通氣量將發(fā)酵液溶氧水平分別維持于25%DO(高溶氧)、10%DO(中溶氧)和2%DO(低溶氧)(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明，高溶氧水平對(duì)于裂殖壺菌的菌體生長(zhǎng)和油脂積累有促進(jìn)作用，與2% DO條件相比，10%DO和25%DO條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)更好(見(jiàn)圖3(a))，在固定轉(zhuǎn)速和通氣條件下進(jìn)行發(fā)酵時(shí)生物量在72 h時(shí)開(kāi)始下降，且油脂產(chǎn)量低于其余各組，3種溶氧條件下，發(fā)酵至96 h后生物量都略有下降，油脂產(chǎn)量變化趨勢(shì)與生物量一致，都在96 h后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)油脂產(chǎn)量分別為9.58、23.85和16.58 g/L(見(jiàn)圖3(b))；在2% DO條件下，EPA含量先快速上升至12.50%(96 h時(shí))，然后緩慢下降至12.24%(120 h時(shí))(見(jiàn)圖3(c))；DHA占總脂肪酸的百分含量變化趨勢(shì)在恒定轉(zhuǎn)速及3種溶氧水平中基本保持不變，在2% DO條件下DHA占總脂肪酸的百分含量最高，達(dá)到47.45%(見(jiàn)圖3(d))。

(a)生物量

2.5 TST-LDO控制條件對(duì)裂殖壺菌產(chǎn)EPA發(fā)酵性能的影響

基于上述分析，本研究提出了一種TST-LDO發(fā)酵策略：在發(fā)酵初期(0～24 h)，將發(fā)酵溫度控制在28 ℃，24 h后，溫度升高至34 ℃，DO水平保持在2%以下，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)裂殖壺菌的生長(zhǎng)變化情況可將發(fā)酵分為4個(gè)階段：0～12 h(階段1)為生長(zhǎng)延滯期，該階段細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；12～48 h(階段2)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在此階段細(xì)胞迅速生長(zhǎng)耗盡谷氨酸鈉，在48 h時(shí)生物量達(dá)到51.66 g/L，油脂在24～48 h快速積累；48～84 h(階段3)為生長(zhǎng)平緩期，該階段細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)，12～84 h葡萄糖被快速消耗，84 h時(shí)生物量和油脂產(chǎn)量達(dá)到最大值57.01 g/L和10.50 g/L；84～120 h(階段4)為油脂反耗期，生物量下降到50.12 g/L，油脂產(chǎn)量降至9.06 g/L。在最佳工藝發(fā)酵條件下，發(fā)酵至96 h時(shí)EPA產(chǎn)量最高，達(dá)到1.14 g/L，此時(shí)生物量、油脂產(chǎn)量和EPA含量分別為56.60 g/L、9.62 g/L和12.50%。

圖4 裂殖壺菌在TST-LDO發(fā)酵工藝下的發(fā)酵情況Fig.4 Fermentation process of Schizochytrium sp.controlled by two-stage-temperature and low-dissolved-oxygen strategy

圖5為脂肪酸組成隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況。根據(jù)脂肪酸組分的變化趨勢(shì)，將主要檢測(cè)到的脂肪酸分為3類(SFAs、PUFAs- 1、PUFAs- 2)。SFAs以C16：0為主，24 h到120 h之間，SFAs含量逐漸下降，由25.95%下降到5.28%。24～48 h和72～96 h為兩個(gè)快速下降階段，96 h后SFAs占總脂肪酸的百分含量基本不變；PUFAs根據(jù)變化趨勢(shì)的相似性可分為兩種類型：PUFAs- 1(花生四烯酸(ARA)、EPA和DPA n3)和PUFAs- 2(DHA和DPA n6)。24 h時(shí)PUFAs- 1含量低于1%，72～96 h之間迅速增加，96 h后其含量維持穩(wěn)定，0～96 h之間EPA的含量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，96 h時(shí)含量達(dá)到最高為12.50%，之后緩慢降低，發(fā)酵結(jié)束時(shí)EPA含量為12.24%。DHA和DPA n6含量在24～48 h之間逐漸升高，然后分別維持在45%和16%左右。圖5(d)顯示了5種類型脂肪酸隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況，4種SFAs總量由24 h時(shí)的42.89%下降至120 h時(shí)的7.66%，PUFAs- 2總量由48.04%上升至63.23%，PUFAs- 1總量由1.25%上升至23.60%。EPA和DHA在高溫和低溶氧協(xié)同作用下具有不同的變化趨勢(shì)，EPA含量增加的同時(shí)，DHA含量并未隨之降低，而是保持不變，甚至在一定程度上有所增加，這說(shuō)明在溫度和溶氧的脅迫下并沒(méi)有改變EPA轉(zhuǎn)化為DHA的合成效率，而是加快了SFAs向EPA、ARA和DPA n3的轉(zhuǎn)化，卻不是作用于DHA。由此，推測(cè)在Schizochytriumsp.ATCC20888中EPA和DHA的代謝途徑可能存在差異，并且存在一定環(huán)境脅迫時(shí)可能有助于EPA的積累。

(a)飽和脂肪酸

Zhu等[29]發(fā)現(xiàn)將發(fā)酵溫度從16 ℃增加至37 ℃時(shí)，EPA的含量有了明顯的提升，EPA含量從0.72%增加至1.24%；凌雪萍等[30]通過(guò)在裂殖壺菌培養(yǎng)至24 h時(shí)添加50 mg/L氟啶酮使EPA占總脂肪酸的百分含量從0.45%提高至0.65%；孟彤[31]通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵及發(fā)酵過(guò)程中添加無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵，使EPA占總脂肪酸的百分含量從0.58%提升至0.98%。與目前研究相比，本研究中采用的TST-LDO策略可以顯著促進(jìn)裂殖菌發(fā)酵過(guò)程中EPA的積累，且不降低DHA的含量，獲得的藻油中PUFAs含量為86.92%，具有較高的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。

3 結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)探究不同溫度、變溫時(shí)間和溶氧水平對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)EPA的影響，建立了一種兩階段控溫-低溶氧發(fā)酵策略。在發(fā)酵起始階段控制溫度為28 ℃(0～24 h)，裂殖壺菌迅速增殖，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中點(diǎn)(24 h)，即油脂積累階段的起始階段，升高發(fā)酵溫度至34 ℃時(shí)促進(jìn)了EPA的合成，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中控制溶氧水平為2%。在該策略下，發(fā)酵至96 h時(shí)生物量、油脂產(chǎn)量、EPA占總脂肪酸的百分含量和EPA產(chǎn)量分別達(dá)到56.60 g/L、9.62 g/L、12.50%和1.14 g/L，TFAs中EPA的百分含量和產(chǎn)量分別是優(yōu)化前的14.5倍和6.1倍。該發(fā)酵策略為裂殖壺菌高產(chǎn)EPA提供了新的研究思路，且溫度和溶氧脅迫下的脂肪酸變化情況分析為解析裂殖壺菌中脂肪酸的合成途徑提供了理論依據(jù)。接下來(lái)可結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析，深入研究裂殖壺菌發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化，可進(jìn)一步明確發(fā)酵過(guò)程中的原料和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和物得率與培養(yǎng)條件之間的動(dòng)態(tài)變化，為其產(chǎn)業(yè)化體系建立提供更為深入的理論依據(jù)。