隋強(qiáng)君，張 靜，柳麗麗

（天津市第三中心醫(yī)院，天津市人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，天津市肝膽疾病研究所，天津 300170）

巖白菜素（bergenin）是巖白菜的主要有效活性成分，又稱巖白菜內(nèi)酯、矮茶素、虎耳草素［1］。巖白菜素具有選擇性抑制咳嗽中樞、連續(xù)使用無(wú)耐受性、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)，在鎮(zhèn)咳祛痰方面具有良好的應(yīng)用前景，現(xiàn)已被《中國(guó)藥典》收錄，用于治療慢性支氣管炎。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，巖白菜素能夠調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，具有免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗氧化、抗炎、降尿酸、保護(hù)神經(jīng)等作用［2-5］。但目前對(duì)于巖白菜素相關(guān)的的藥物相互作用的研究較少。硝苯地平（nifedipine）作為二氫吡啶類鈣通道抑制劑，在臨床上應(yīng)用廣泛。此外，硝苯地平經(jīng)CYP3A代謝為特異性產(chǎn)物氧化硝苯地平，可作為CYP3A酶系的探針?biāo)幬?，用于藥物代謝和藥物的相互作用等方面的研究［7-8］。本文旨在考查巖白菜素對(duì)硝苯地平藥動(dòng)力學(xué)的影響，為中藥的開(kāi)發(fā)和安全使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 巖白菜素原料藥（批號(hào)101018，純度：99.92%），山西玉森制藥廠提供；硝苯地平原料藥（批號(hào)091008，純度>99%），青島格瑞藥業(yè)有限公司提供；硝苯地平對(duì)照品（批號(hào)1000338-200502）、格列齊特對(duì)照品（批號(hào)100585-200602），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈、甲醇、乙酸乙酯，均為色譜純，美國(guó)Dikma Technologies公司生產(chǎn)；甲酸，色譜純，Sigma公司生產(chǎn)；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要儀器Agilent 1200型高效液相色譜儀串聯(lián)Agilent 6410三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）、Hip-ALS SL進(jìn)樣器、Agilent Mass Hunter分析軟件（美國(guó)Agilent公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；PROIND離心機(jī)（德國(guó)賀利氏公司）；AX-205 Delta Range電子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠，體重為（210±10）g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2013 0009。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為12 h/d人工照明，溫度20～25℃，相對(duì)濕度45%～60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理的相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取硝苯地平和格列齊特對(duì)照品各0.010 g，分別置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成濃度為1 mg/ml的儲(chǔ)備液。取適量?jī)?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，采用流動(dòng)相稀釋，得到2.0 μg/ml內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用流動(dòng)相梯度稀釋硝苯地平儲(chǔ)備液，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有溶液置于4℃保存。

2.1.2 大鼠灌胃液的配制 稱取適量巖白菜素和硝苯地平原料藥，分別采用0.5%CMC-Na溶液配制成混懸液（巖白菜素3 mg/ml，硝苯地平1 mg/ml），所有灌胃給藥樣品均系新鮮配制。

2.2 測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil Plus C18-A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸（60∶40），在線脫氣；流速1 ml/min；進(jìn)樣量5 μl。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式；干燥氣為高純度氮?dú)?，流?0 L/min，溫度為350℃；霧化壓力40 psi，毛細(xì)管電壓4 000 V；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式掃描，掃描間隔為200 ms；硝苯地平和內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)分別是m/z 347.1→254.1、324.2→127.1，碎片電壓為100 V，碰撞能分別是20 eV。

2.3 血漿樣品預(yù)處理 精密量取血漿樣品100 μl，加入2.0 μg/ml內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，渦旋混勻，加入1 ml乙酸乙酯，渦旋提取2 min。5 000 r/min離心5 min，吸取上層有機(jī)相，于40℃水浴氮?dú)饬鞔蹈?。殘?jiān)?00 μl流動(dòng)相復(fù)溶，取5 μl進(jìn)樣分析。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取空白大鼠血漿100 μl，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，按照“2.3”項(xiàng)下的方法處理；空白血漿外加硝苯地平得到的血漿樣品和大鼠給藥后的血漿樣品，按照“2.3”項(xiàng)下的方法處理。按“2.2”項(xiàng)下方法得色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，硝苯地平和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別是4.72和3.84 min，基線噪音小，各色譜峰形良好，無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾，方法專屬性較高。

圖1 空白血漿（A）空白血漿加硝苯地平和內(nèi)標(biāo)（B）血漿樣品（C）HPLC色譜圖

2.5 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 取大鼠空白血漿加入硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低、中、高（0.20、1.00和5.00 μg/ml）濃度質(zhì)控樣品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的方法處理，測(cè)得峰面積A1；取空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，按照“2.3”項(xiàng)下的方法處理后，用100 μl濃度為0.20、1.00和5.00 μg/ml的硝苯地平對(duì)照品溶液復(fù)溶后，測(cè)定得峰面積A2。以A1/A2表示提取回收率。取100 μl相應(yīng)濃度為0.20、1.00和5.00 μg/ml的硝苯地平對(duì)照品溶液，于40℃水浴氮?dú)饬鞔蹈桑?00 μl流動(dòng)相復(fù)溶后，測(cè)定得峰面積A3，以A2/A3表示基質(zhì)效應(yīng)。內(nèi)標(biāo)的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)按上述同法計(jì)算。結(jié)果表明，硝苯地平的提取回收率為68.09%～71.91%，基質(zhì)效應(yīng)值為99.15%～102.00%，且無(wú)濃度依賴性。內(nèi)標(biāo)的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)數(shù)值分別為67.69%和99.66%，見(jiàn)表1。

表1 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=5）

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取大鼠空白血漿，分別加入適量的硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成含有硝苯地平濃度為0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00和5.00 μg/ml的血漿樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，每一個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行3份樣品分析。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸分析，權(quán)重系數(shù)為1/X2，線性回歸方程為：Y=2.137 4X+0.100 1（r=0.996），線性范圍為0.10～5.00 μg/ml。

取大鼠空白血漿加入硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成含硝苯地平濃度為0.10 μg/ml的血漿樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。結(jié)果顯示，其S/N≥10，硝苯地平的最低定量限（LLOQ）為0.10 μg/ml。

2.7 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 取大鼠空白血漿加入適量的硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制低、中、高（0.20、1.00和5.00 μg/ml）濃度的質(zhì)控樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的方法處理后，進(jìn)樣分析，每一質(zhì)量濃度制備5份，每天測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定3 d，并按當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量濃度，與配制濃度比較，計(jì)算日內(nèi)和日間的相對(duì)誤差（RE）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），分別考查方法的準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果表明精密度與準(zhǔn)確度符合測(cè)定要求，見(jiàn)表2。

表2 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=5）

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取大鼠空白血漿加入適量的硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制低、中、高（0.20、1.00和5.00 μg/ml）濃度的質(zhì)控樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的方法處理后，于進(jìn)樣器中放置7 h，進(jìn)行樣品分析，考查血漿樣品提取后的室溫放置穩(wěn)定性。另配制低、中、高（0.20、1.00和5.00 μg/ml）濃度的質(zhì)控樣品，分別經(jīng)凍融2次、冷凍14 d后，按“2.3”項(xiàng)下的方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，考查血漿樣品的凍融穩(wěn)定性和長(zhǎng)期冷凍穩(wěn)定性。結(jié)果，大鼠血漿樣品在整個(gè)分析期間，穩(wěn)定性良好。見(jiàn)表3。

表3 硝苯地平在不同條件下的穩(wěn)定性（x±s，n=5）

2.9 藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)18只健康雄性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（多次給藥組、單次給藥組）、對(duì)照組，每組各6只。多次給藥組：灌服巖白菜素30 mg/kg，3次/d，連續(xù)灌服7 d；單次給藥組與對(duì)照組：灌服等體積的0.5% CMC-Na溶液，3次/d，連續(xù)灌服7 d。末次灌服巖白菜素或0.5%CMC-Na溶液后，大鼠禁食不禁水12 h。之后，實(shí)驗(yàn)組大鼠灌服巖白菜素30 mg/kg后，立即灌服硝苯地平10 mg/kg；對(duì)照組大鼠灌服0.5%CMC-Na溶液后，立即灌服硝苯地平10 mg/kg。

于給藥前和藥后5 min，0.25、0.50、0.75、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10、12和24.0 h抽取頸靜脈血0.3 ml，立即置于肝素抗凝化的EP管中，10 000 r/min離心5 min，分離上層血漿，-80°C冷凍保存?zhèn)錅y(cè)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)大鼠樣品測(cè)定過(guò)程中，同時(shí)制備并測(cè)定質(zhì)控樣品。以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算硝苯地平的質(zhì)量濃度。

采用藥動(dòng)學(xué)分析軟件DAS 2.0統(tǒng)計(jì)矩法分析藥動(dòng)學(xué)特征，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)包括藥時(shí)曲線下面積（AUC）、平均駐留時(shí)間（MRT）、達(dá)峰時(shí)間（Tmax）、清除率（Cl）、表觀分布容積（V）、藥峰濃度（Cmax）、消除半衰期（t1/2）；采用SPSS 20.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P<0.05表示有顯著性差異。

各組大鼠給藥后各時(shí)間點(diǎn)的硝苯地平血漿濃度見(jiàn)表4，血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表5。

表5 硝苯地平的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（x±s，n=5）

圖2 大鼠硝苯地平的血藥濃度均值-時(shí)間曲線（n=6）

表4 大鼠給藥后各時(shí)間點(diǎn)的硝苯地平血藥濃度均值（n=5）

3 討論

3.1 吸收AUC和Cmax、Tmax分別作為吸收程度與吸收速度的指標(biāo)。吸收程度增加會(huì)導(dǎo)致AUC和Cmax升高，吸收速度增快會(huì)導(dǎo)致Cmax升高，Tmax縮短。本研究中發(fā)現(xiàn)，單次灌服或連續(xù)灌胃巖白菜素1周，大鼠體內(nèi)硝苯地平的AUC0-t和AUC0-∞、Tmax和Cmax均無(wú)顯著性變化。

硝苯地平主要在小腸中經(jīng)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。巖白菜素屬于弱酸性物質(zhì)，在酸性環(huán)境中穩(wěn)定，而在中性和堿性環(huán)境易分解［1，6］。巖白菜素在小腸中主要通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散吸收，有別于硝苯地平的吸收途徑，因此，對(duì)其吸收影響的可能性降低。此外，硝苯地平是CYP3A酶和外排蛋白糖蛋白（P-gp）的底物。若藥物能夠作用于CYP3A或P-gp，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制或直接影響CYP3A的生物轉(zhuǎn)化作用、P-gp的外排作用，對(duì)硝苯地平的口服生物利用度產(chǎn)生一定影響［5，7，8］。本研究發(fā)現(xiàn)，合用巖白菜素后，大鼠體內(nèi)硝苯地平的口服生物利用度無(wú)明顯變化，提示巖白菜素可能對(duì)腸道細(xì)胞CYP3A酶和P-gp無(wú)影響，因此不影響腸道內(nèi)硝苯地平代謝和外排。

3.2 分布與消除 表觀分布容積V反映了藥物在體內(nèi)分布情況，MRT、t1/2、Cl是藥物體內(nèi)藥物消除速度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。單次或多次灌服巖白菜素對(duì)大鼠體內(nèi)硝苯地平的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均無(wú)顯著性影響，表明巖白菜素對(duì)硝苯地平的分布和消除的影響不明顯。

硝苯地平在體內(nèi)分布廣泛，主要經(jīng)肝臟CYP3A酶系代謝代謝為氧化硝苯地平，為一相代謝。而巖白菜素進(jìn)入體內(nèi)后分布迅速，消除速度較快［5-6］。巖白菜素在大鼠體內(nèi)主要是二相代謝，經(jīng)尿苷二磷酸葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UGT）代謝為葡糖醛酸化巖白菜素，還存在硫酸化、水解合并甲基化兩種代謝途徑［9］。因此，巖白菜素對(duì)硝苯地平的分布和代謝途徑影響小。此結(jié)果還提示，巖白菜素對(duì)硝苯地平的代謝酶的影響不顯著。因此，巖白菜素與其他CYP3A底物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可能不影響此類藥物的分布和代謝，這有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，巖白菜素對(duì)硝苯地平在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程影響不明顯，對(duì)臨床藥物的聯(lián)合應(yīng)用具有一定的參考意義。但由于藥物代謝酶的種屬差異，人體內(nèi)是否存在一致的藥物相互作用，有待進(jìn)一步研究論證。