閻雅寧，曹曉云，郭福慶

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）

1 儀器與試藥

1.1 試驗(yàn)儀器及設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱（BINDER KB720），滅菌鍋（Sanyo MLS-3780），超凈工作臺(tái)（yamato ADS161），生物安全柜（BAKER SG-403A TX-INT），自動(dòng)無菌檢測(cè)儀（MILLIPORE），集菌培養(yǎng)器（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 驗(yàn)證用菌種 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、白色念珠菌（Clostridium sporogenes）［CMCC（F）98001］、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）［CMCC（B）64941］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，由本院傳代保存。

1.3 樣品 抽樣來自甲、乙、丙3個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的注射用鹽酸地爾硫（規(guī)格：10 mg），共34個(gè)批次樣品。

1.4 驗(yàn)證用培養(yǎng)基 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)190301）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)190327）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)190304）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)180724）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)181127）、蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)20181106）、聚山梨酯80（天津市華東試劑廠，批號(hào)2018年01月19日）、氯化鈉（天津市帆船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)2019年03月22日）。以上市售脫水培養(yǎng)基均按標(biāo)簽說明配制并高壓滅菌后備用。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 菌液配制與計(jì)數(shù) 取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物少許，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，32.5℃培養(yǎng)24 h；白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，22.5℃培養(yǎng)48 h。取上述培養(yǎng)物各1 ml用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成不大于100 cfu/ml的菌懸液。黑曲霉新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，22.5℃培養(yǎng)7 d，使大量孢子成熟，用含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下孢子，并稀釋成不大于100 cfu/ml的孢子懸液。取上述金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、和生孢梭菌3種菌適宜稀釋級(jí)的試驗(yàn)菌懸液1 ml注入到無菌平皿中，并立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，其中生孢梭菌置厭氧罐中，置32.5℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)；取上述白色念珠菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉3種菌適宜稀釋級(jí)的試驗(yàn)菌懸液1 ml注入到無菌平皿中，并立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，置22.5℃培養(yǎng)72 h，計(jì)數(shù)。

2.2 預(yù)試驗(yàn)

表1 3種預(yù)試驗(yàn)方法

2.2.2 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 通過試驗(yàn)結(jié)果的觀察，抽取的3個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的樣品按照表1方法C進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)時(shí)，金黃色葡萄球菌在規(guī)定時(shí)間內(nèi)都能夠產(chǎn)生菌落。陰性對(duì)照在規(guī)定時(shí)間內(nèi)均無菌生長(zhǎng)。使用方法A和方法B均不能都生長(zhǎng)出菌落。結(jié)果見表2。

表2 3家生產(chǎn)企業(yè)3種預(yù)試驗(yàn)方法的結(jié)果

2.3 無菌方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)組 先用少量0.1%無菌蛋白胨溶液潤(rùn)濕濾膜，取供試品10支，溶于100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，全量濾過至一個(gè)濾器中，用0.1%無菌蛋白胨溶液300 ml分3次沖洗，在最后一次沖洗液中在加入少于100 cfu的試驗(yàn)菌，濾干。將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 ml加至濾器內(nèi)，32.5℃培養(yǎng)3 d；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml加至濾桶內(nèi)，22.5℃培養(yǎng)5 d。各需驗(yàn)證試驗(yàn)菌同法操作。

2.3.2 菌液對(duì)照組 取一只裝有同體積的培養(yǎng)基濾器，將100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液全量濾過，用0.1%無菌蛋白胨溶液300 ml分3次沖洗，在最后一次沖洗液中在加入與試驗(yàn)組等量的試驗(yàn)菌，作為菌液對(duì)照組。按規(guī)定溫度培養(yǎng)5 d。各試驗(yàn)菌同法操作。

2.3.3 陰性對(duì)照組 另取一只裝有同體積的培養(yǎng)基濾器，將100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液全量濾過，用0.1%無菌蛋白胨溶液300 ml分3次沖洗，將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基各100 ml分別加至濾器內(nèi)，作為陰性對(duì)照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)14 d。

2.4 無菌檢查 按照“2.3”項(xiàng)下方法取規(guī)定量供試品，溶于適量的0.9%無菌氯化鈉溶液中，平均過濾至3個(gè)濾器中，用0.1%無菌蛋白胨溶液900 ml分3次沖洗，其中兩個(gè)濾器中分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基各100 ml，另一個(gè)濾器中加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml，其中一個(gè)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基加入小于100 cfu的金黃色葡萄球菌，作為陽性對(duì)照。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的濾器置于32.5℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的濾器置于22.5℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，均培養(yǎng)14 d。依法檢查，應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定。

3 結(jié)果

3.1 方法適用性試驗(yàn)結(jié)果 按照“2.3”項(xiàng)下的試驗(yàn)方法對(duì)3家生產(chǎn)企業(yè)的樣品進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果表明，《中國(guó)藥典》規(guī)定的各試驗(yàn)菌均在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)能夠正常生長(zhǎng)，該試驗(yàn)方法適用于注射用鹽酸地爾硫的無菌檢查。結(jié)果見表3。

表3 3家企業(yè)生產(chǎn)的注射用鹽酸地爾硫無菌方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

表3 3家企業(yè)生產(chǎn)的注射用鹽酸地爾硫無菌方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

注：+表示有菌落生長(zhǎng)；-表示無菌落生長(zhǎng)

生產(chǎn)企業(yè)甲乙丙試驗(yàn)菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌生孢梭菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉金黃色葡萄球菌大腸埃希菌生孢梭菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉金黃色葡萄球菌大腸埃希菌生孢梭菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉天數(shù)（d）1 2 3+++++++++--+--+--++++++++++--+--+--++++++++++--+--+--+4++++++++++++++++++5++++++++++++++++++

3.2 無菌檢查結(jié)果 按照“2.4”項(xiàng)下的試驗(yàn)方法對(duì)抽取的34批次樣品進(jìn)行無菌檢查，培養(yǎng)14 d后，均無菌生長(zhǎng)，結(jié)果均符合規(guī)定。

4 討論

4.1 無菌方法學(xué)適用性試驗(yàn)條件考查 在無菌方法適用性試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，注射用鹽酸地爾硫有一定的抑菌性，選取了3個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的3批樣品進(jìn)行方法學(xué)適用性試驗(yàn)，對(duì)比了3種試驗(yàn)方法A、B、C，試驗(yàn)得出方法C用0.1%無菌蛋白胨溶液300 ml沖洗能有效地去除藥品中的抑菌成分，該方法適用于注射用鹽酸地爾硫的無菌檢查。

4.2 抽驗(yàn)結(jié)果及市場(chǎng)情況考查 本次國(guó)評(píng)試驗(yàn)抽取3個(gè)生產(chǎn)企業(yè)共34批次樣品，涉及4個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，供樣單位涉及全國(guó)16個(gè)省市自治區(qū)。因此，對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，可以較好地反映目前國(guó)產(chǎn)注射用鹽酸地爾硫的質(zhì)量現(xiàn)狀和市場(chǎng)情況。在執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)方面，一共涉及4個(gè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，其中2批次執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)》YBH07902005及《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS1-（X-015）-2010Z-2015，2批次執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)》YBH07902005，1批次執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS1-（X-015）-2010Z-2015，29批次執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)》JX20150001。各標(biāo)準(zhǔn)的無菌檢查方法均參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則無菌檢查法的要求，根據(jù)各自的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行無菌檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。此次抽驗(yàn)結(jié)果說明注射用鹽酸地爾硫在流通運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)穩(wěn)定可靠，抽驗(yàn)的生產(chǎn)企業(yè)對(duì)該藥品的原料采集、制備、工藝和生產(chǎn)等環(huán)節(jié)及藥品的質(zhì)量安全方面相對(duì)穩(wěn)定。