梁翔宇，顧 欣，劉文輝，孫小涵，白宇馨，馬 艷，李 茜，趙 瑩

（寧夏大學 農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021）

鹽堿化是全球耕地土壤面臨的重要問題之一[1]。為了利用鹽堿化耕地并減少土壤鹽堿化程度，人們采用了許多土壤改良方法。其中，生物措施被認為是較為有效且環(huán)境友好的措施[2]。例如，使用生物有機肥可顯著改善鹽堿地的土壤性質(zhì)[3]，施用菌劑可以促進作物在鹽堿化土壤中生長等[4—5]，生物有機肥和菌劑中的耐鹽堿有益功能菌發(fā)揮了重要作用[6]。因此，分離獲得耐鹽堿性良好、可促進植物生長的功能微生物對鹽堿地改良及新型菌劑的開發(fā)具有重要意義。

根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）是指存在于植物根際周圍的一類可以促進植株生長，提高植株抗病性的微生物[7]。其對植物生長和土壤改良均具有重要作用[8]。針對鹽堿地植物生長和土壤改良需求，耐鹽堿的PGPR逐漸成為研究熱點。有研究者利用三級篩選體系從新疆堿蓬（Suaeda glauca）根際土壤中分離獲得PGPR菌，包括芽孢桿菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌（Staphylococcus sp.）、鹽芽孢桿菌（Halobacillus sp.）、腸桿菌（Enterobacter sp.）和節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）[9]；從濱海鹽堿地的非鹽生植物根際土壤中篩選獲得了耐鹽促生芽孢桿菌B.megaterium T1-8菌株和B.paraflexus T4-9菌株[10]；從新疆鹽爪爪（Kalidium foliatum）根際土壤中分離獲得了57株細菌，分屬4個門12個屬，且多數(shù)菌株兼有耐鹽和促生作用[11]。以上研究說明，鹽堿地土壤中具有豐富的PGPR資源，有待進一步開發(fā)。

銀川平原位于我國西北部，由于氣候、地質(zhì)和人為干擾等原因，土壤易發(fā)生鹽堿化[12]。因此，當?shù)貙δ望}堿PGPR資源的開發(fā)和利用存在需求。本實驗通過采集寧夏銀北鹽堿地鹽生植物根際土壤，利用選擇培養(yǎng)法分離篩選耐鹽堿的根際促生細菌，對其進行分類鑒定，并檢測其促生作用和鹽堿耐受性，期望為有益功能菌的開發(fā)利用提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土樣采集2019年10月，選擇寧夏銀北地區(qū)平羅縣西大灘和惠農(nóng)區(qū)禮和鄉(xiāng)2個鹽堿地區(qū)，以堿蓬、鹽爪爪和蘆葦（Phragmites communis）為優(yōu)勢種的區(qū)域，挖取植株，盡量保留根系和根際土壤，裝于密封袋中帶回實驗室。利用抖根法采集植物根際土壤，用于目標微生物的分離篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[13]、阿須貝培養(yǎng)基[14]、解磷菌篩選培養(yǎng)基[15]、解鉀菌篩選培養(yǎng)基[16]、LB培養(yǎng)基[17]、CAS培養(yǎng)基[18]。

1.1.3 主要儀器超凈工作臺（SW-CJ-2FD，上海博迅實業(yè)有限公司）；振蕩培養(yǎng)箱（ZD-85，江蘇金壇市醫(yī)療器械廠）；恒溫生化培養(yǎng)箱（LRH-250；上海一恒科技有限公司）；顯微鏡（BME，徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司）；高壓滅菌鍋（MLS-3750，SANYO）；電子數(shù)顯游標卡尺（LINKS，II型，0～150 mm）；火焰光度計；分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 可培養(yǎng)細菌的分離純化稱取植物根際土壤5 g，置于無菌水95 mL中，于180 r/min、28℃下?lián)u勻30 min，將土壤懸液按梯度進行稀釋后，分別取10-4、10-5、10-6稀釋度的土壤懸液各100μL，采用稀釋涂布平板法涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。挑取細菌單菌落，經(jīng)3次劃線純化獲得純培養(yǎng)，接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，作為菌種置于4℃冷藏箱中備用。

1.2.2 耐鹽根際促生菌的分離篩選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于28℃活化菌株24 h，轉(zhuǎn)接至阿須貝培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)。定期觀察菌株生長情況，以“+”代表菌株在平板上長出菌落，以示其具有固氮能力。從劃線第2天開始，如果長出菌落記為“+++++”，每延遲1天長出菌落減少1個“+”，連續(xù)觀察至第7天，未生長的菌株記為“-”。

將活化后的菌株點接于CAS平板上，每板3個點，每株菌設3個重復，于28℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄有無橙色暈圈，測量單菌落橙色暈圈直徑（D）和菌落直徑（d），每個暈圈和菌落直徑各測量3次取平均值，計算D/d比值。D/d比值小于1記“+”；D/d比值大于1且小于1.5記“++”；D/d比值大于1.5記“+++”?！?”越多代表菌株具有越強的產(chǎn)鐵載體能力，而菌株周圍未產(chǎn)生橙色暈圈的菌株，即不產(chǎn)鐵載體，記為“-”。

菌株的解磷量采用鉬銻抗比色法[19]、解鉀量采用火焰光度法[20]、IAA產(chǎn)量采用Salkowski比色法[21]、ACC脫氨酶活性采用α-酮丁酸法[22]測定。

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中添加NaCl使其質(zhì)量分數(shù)達到5%，6%，7%，8%，9%，共設5個梯度，制成鹽平板。將活化后的菌株依次點接到不同質(zhì)量分數(shù)鹽平板上，每株菌設置3個平板重復，于28℃培養(yǎng)24 h。用游標卡尺測量菌落直徑。每個菌落直徑測量3次，取平均值。菌株能生長的最高鹽分質(zhì)量分數(shù)為該菌株的NaCl耐受值。同理，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基pH值，設pH=6、7、8、9、10共5個梯度，制成酸堿度平板，依次點接供試菌株到不同pH值的酸堿度平板上，每株菌設3個重復，于28℃培養(yǎng)24 h后測量菌落直徑。菌株能生長的最高pH值為該菌株的pH耐受值。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理和分析采用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)處理軟件進行方差分析，采用LSD法在P＜0.05水平上檢測差異性。DNA序列同源性比較使用NCBI系統(tǒng)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），進化樹的構(gòu)建采用Mega-X軟件。

1.2.4 耐鹽促生菌的分類鑒定參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[23]，對目標菌株開展形態(tài)學鑒定和生理生化鑒定?；罨?，提取基因組DNA，對細菌的16 SrRNA基因進行PCR擴增、電泳和回收[24]，委托北京奧維森基因科技公司完成測序。將得到的測序結(jié)果提交至Genbank獲得序列號，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，依據(jù)對比信息對菌株進行分析鑒定。在數(shù)據(jù)庫中選擇相近種屬的基因序列，使用Mega-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，初步確定菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的促生活性

共分離獲得細菌83株，其中具有固氮作用的菌株有23株，具有解磷作用的菌株19株，具有解鉀作用的菌株14株，具有產(chǎn)IAA能力的菌株15株，具有產(chǎn)鐵載體能力的菌株11株，具有ACC脫氨酶活性的菌株10株。其中菌株PJ10、PL11、HL3、HJ9和HY5具有2種以上的促生功能，且促生活性較強，如表1所示。經(jīng)過比較可知，菌株PJ10具有較強的解磷活性，無機磷解磷量為（44.10±0.12）mg/L；菌株PL11和HJ9具有較強的解鉀能力，解鉀量分別為（10.33±0.08）mg/L和（11.01±0.03）mg/L；菌株PL11和HY5具有較強的產(chǎn)IAA能力，分別為（34.01±0.01）mg/L和（32.41±0.08）mg/L；菌株HL3具有較強的固氮能力，但不具有解鉀和產(chǎn)生IAA的能力。

表1 細菌的促生活性

2.2 菌株的鹽堿耐受性

對菌株PJ10、PL11、HL3、HJ9和HY5進行鹽堿耐受性檢測，結(jié)果見圖1。在pH=7時，各菌落直徑最大，菌落生長良好。當培養(yǎng)基pH值超過7，各菌落的直徑均呈降低趨勢，但不同菌株的表現(xiàn)存在差異。與pH=7中的菌落直徑比較，pH=8時，HJ9菌落直徑降低了39.55%，其生長能力大幅下降；pH=9時，PL11和HL3的菌落直徑分別下降了8.73%和9.43%，而PJ10和HY5的菌落直徑僅降低了4.24%和4.32%；pH=10時，HJ9不能生長，HL3生長能力下降了54.45%；pH=11時，PJ10、HY5仍具有較好的生長能力，PL11則下降了56.67%。

圖1 不同p H值對菌株生長的影響

由圖2可知，在w（NaCl）=5.00%時，各菌落直徑最大，與其直徑相比，當w（NaCl）=6.00%時，PL11菌落直徑下降了35.58%；w（NaCl）=8.00%時，PL11不能生長，HL3和HJ9的生長能力分別降低了24.02%和36.02%；w（NaCl）=9.00%時，HL3和HJ9的生長能力繼續(xù)下降，較w（NaCl）=5.00%時降低了75.55%和55.94%，而HY5和PJ10僅下降了10.10%和11.92%。由此可知，菌株PJ10、HY5、HL3在鹽脅迫和堿脅迫條件下均表現(xiàn)出較好的耐受能力，被確認為目標菌株。

圖2 不同NaCl質(zhì)量分數(shù)對菌株生長的影響

2.3 菌株的分類鑒定

2.3.1 形態(tài)學鑒定將菌株PJ10、HL3和HY5于28℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落及菌體形態(tài)，其特征如圖3所示。

圖3 目標菌株的形態(tài)特征

PJ10菌株的菌落較大，呈白色，表面光滑干燥，邊緣整齊，培養(yǎng)基顏色無變化；菌體桿狀，（0.4～0.5）×（0.9～1.0）μm，有芽孢。

HL3菌株的菌落較大，呈白色，表面光滑濕潤，邊緣整齊，培養(yǎng)基顏色無明顯變化；菌體短桿狀，（0.3～0.4）×（0.5～0.8）μm，有芽孢。

HY5菌株的菌落較大，呈白色，表面光滑干燥，邊緣整齊，培養(yǎng)基顏色無變化；菌體桿狀，（0.3～0.4）×（0.7～0.8）μm，有芽孢。

初步判斷3個菌株均為芽孢桿菌屬細菌。

2.3.2 生理生化鑒定由表2可知，3個菌株的生理生化檢測結(jié)果符合芽孢桿菌屬細菌的鑒定特征。

表2 目標菌株的生理生化特性

2.3.3 分子生物學鑒定將3株目標菌的基因測序結(jié)果錄入NCBI，獲得Genbank編號分別為PJ10菌株MW585077、HL3菌 株 MW585078、HY5菌 株MW585079。各菌株基因序列經(jīng)BLAST比較并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。PJ10菌株與壁芽孢桿菌（B.muralis）（MT598008）位于進化樹同一分支，相似性為100%，見圖4。HL3菌株與短小芽孢桿菌（B.pumilus）264-LRN9（MF007158）位于進化樹同一分支，同源性98.66%，見圖5。HY5菌株與萎縮芽孢桿菌（B.atrophaeus）JCM9070（NR_024689）相似性為100%，見圖6。

圖4 菌株PJ10系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 菌株HL3系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 菌株HY5系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌分布廣泛，對鹽堿、高溫等脅迫條件具有一定抵抗能力，常被作為菌種篩選目標[25]。從南通市沿海灘涂鹽堿地中篩選得到的巨大芽孢桿菌（B.megaterium）B7，具有產(chǎn)IAA能力、固氮能力、解磷能力和ACC脫氨酶活性，在w（NaCl）=6%的條件下可正常生長[26]?？莶菅挎邨U菌（B.subtilis）JC01具有溶磷和產(chǎn)鐵載體能力[27]。單純芽孢桿菌（B.simplex）SD5具有固氮和解磷作用[28]，但是2株菌的耐鹽堿能力不明。馬氏芽孢桿菌（B.marmarensis）在pH=12、（NaCl）=20%的條件下可正常生長，其在盆栽實驗中表現(xiàn)出較好的促生作用[29]。壁芽孢桿菌HS4具有產(chǎn)IAA能力，耐鹽堿能力不明[30]。短小芽孢桿菌JPVS11具有產(chǎn)IAA能力和ACC脫氨酶活性，且在w（NaCl）=9%的條件下能正常生長[31]。萎縮芽孢桿菌GQJK17S8具有溶磷能力，且在w（NaCl）=10%的條件下能正常生長[32]。這說明芽孢桿菌屬中許多菌株具有促生能力，兼具耐鹽堿能力，是PGPR菌種的重要來源。

芽孢桿菌的耐鹽堿性主要依靠其耐鹽堿基因的表達。如枯草芽孢桿菌的基因組有編碼逆向轉(zhuǎn)運蛋白的基因mrp。這些逆向轉(zhuǎn)運蛋白可使微生物在極端鹽堿環(huán)境中維持菌體鹽離子平衡和酸堿度穩(wěn)態(tài)，使微生物具備抗鹽堿脅迫的能力[33—34]。蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）的全基因組測序結(jié)果顯示，49個基因可能與其耐鹽堿性相關[35]。說明芽孢桿菌耐鹽堿菌株的相關基因資源豐富，對其深入認識有助于鹽堿地的科學利用和抗鹽堿性植物的基因工程育種。

本研究從3種典型鹽生植物的根際土壤中篩選獲得3株PGPR，分別為壁芽孢桿菌PJ10、短小芽孢桿菌HL3和萎縮芽孢桿菌HY5，其分別具有一定的固氮、解磷、解鉀、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體能力和ACC脫氨酶活性，在耐鹽堿性方面表現(xiàn)良好，具有進一步開發(fā)利用的價值。

多株PGPR復配的復合型菌劑較單一菌種菌劑對植物的促生效果更強[36—37]。因此，有待對以上3株耐鹽堿PGPR開展復配研究，以明確其最佳復配組合，為新型微生物肥料的開發(fā)和利用提供技術(shù)支持。