張 倩，任 敏，茍 妍，陶金忠

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

0 引言

應(yīng)激（Stress）這一觀點(diǎn)最先是由加拿大的病理生理學(xué)家Hans Selye于1936年在《Nature》雜志上首次提出的。其基本定義被認(rèn)為泛指機(jī)體在遭遇內(nèi)外部刺激性因子的相互刺激下，所觸發(fā)的一系列非特異性生理防御機(jī)制，其中，下丘腦垂體腎上腺的激活過(guò)程是整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中最主要的一種[1-3]。下丘腦垂體中的腎上腺軸突的活動(dòng)直接受到位于下丘腦垂體中心室旁核（paraventricular hypothalamicnucleus，pvn）活動(dòng)的影響。當(dāng)機(jī)體大腦受到強(qiáng)烈刺激時(shí)，室旁核神經(jīng)細(xì)胞分泌精氨酸加壓素（avon）和促腎上腺皮質(zhì)激素，從而使垂體產(chǎn)生和分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（Adreno-cortico-tropic-hormone，ACTH）。促腎上腺皮質(zhì)激素隨著血液流動(dòng)到達(dá)腎上腺，刺激腎上腺皮質(zhì)合成和分泌皮質(zhì)醇[5-7]。隨后，ACTH刺激腎上腺皮質(zhì)釋放皮質(zhì)醇，而皮質(zhì)醇反過(guò)來(lái)又向垂體提供負(fù)反饋，減少促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌，皮質(zhì)醇是腎上腺在面臨壓力時(shí)產(chǎn)生的一種糖皮質(zhì)激素，具備抑菌、抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒等的作用，可顯著的增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性[8]。正常情況下，機(jī)體通過(guò)控制皮質(zhì)醇分泌和調(diào)節(jié)血液中皮質(zhì)醇的含量來(lái)保持正常的生理功能。在應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)源性皮質(zhì)醇產(chǎn)生量激增（至正常程度的10倍上下)來(lái)抵擋刺激，并產(chǎn)生針對(duì)性的應(yīng)激反應(yīng)。血液中的皮質(zhì)醇濃度是權(quán)衡激素強(qiáng)度的一個(gè)指標(biāo)。生產(chǎn)實(shí)踐中，常用測(cè)量血液中乳糖皮質(zhì)醇的平均含量值來(lái)評(píng)定奶牛的應(yīng)激和其他疾病狀態(tài)，但其濃度可能會(huì)同時(shí)受到血液采樣和應(yīng)激等因素的嚴(yán)重干擾[9-10]。

近年來(lái)，隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，應(yīng)激的防治成為獸醫(yī)臨床關(guān)注的重點(diǎn)。大量研究表明，動(dòng)物應(yīng)激受生理性因素、環(huán)境性因素、管理性因素以及藥物性因素的影響。長(zhǎng)途運(yùn)輸后肉牛會(huì)出現(xiàn)運(yùn)輸應(yīng)激綜合征導(dǎo)致應(yīng)激激素水平增加，也可能減少蛋白質(zhì)的合成，降低生產(chǎn)性能和泌乳能力[11-13]。流行病學(xué)研究顯示，應(yīng)激刺激嚴(yán)重者可以使蛋雞產(chǎn)蛋率從85%驟降到15%；德國(guó)每年由于運(yùn)輸應(yīng)激而死亡的屠宰肉豬比例大約是0.2%；美國(guó)因運(yùn)輸應(yīng)激而死亡的豬比例也很高，每年將近損失3 000萬(wàn)美元?？梢姡瑧?yīng)激嚴(yán)重危害動(dòng)物的健康。已成為亟待解決的問題之一。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，單欄飼喂是經(jīng)常使用的一種飼養(yǎng)方式。單欄飼喂，雖便于飼喂管理，但限制了動(dòng)物的活動(dòng)及生存空間，是否會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激，目前尚不清楚。本試驗(yàn)通過(guò)比較單欄飼喂和圈舍喂養(yǎng)兩種不同飼喂方式對(duì)灘羊應(yīng)激激素水平的變化，探究單欄飼喂對(duì)灘羊應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

常用儀器與試劑，見表1。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

本試驗(yàn)于2019年8—9月份從寧夏鹽池灘羊育種場(chǎng)選取24只健康無(wú)病、月齡相近的灘羊，并隨機(jī)將其分為2組（實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組），每組各12只，2組灘羊均飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組進(jìn)行單欄飼喂，對(duì)照組進(jìn)行圈舍飼喂。分別于第1 d、第14 d和第24 d晨飼前采集試驗(yàn)灘羊頸靜脈血樣10 mL，加入肝素鈉抗凝，在3 000 rpm條件下離心15 min后獲得血漿，置于-20℃冰箱中冷凍保存待檢。

1.3 樣本預(yù)處理

從-20℃冰箱中取出血樣，緩慢解凍后至常溫，使用ELISA試劑盒檢測(cè)第1 d、第14 d和第24 d血漿樣品中皮質(zhì)醇和ACTH含量。

1.4 ELISA檢測(cè)

1）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和樣品的添加:在酶標(biāo)包被板上分別依序設(shè)置1個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的乳化樣品10孔，在第1和第2孔中分別依次稀釋加入1個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的乳化樣品100μL，并且在第1和第2孔中分別依次加入2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)新產(chǎn)品稀釋液50μL依次混勻，然后從第1孔和第2孔中各取100μL分別依次加入混勻到第3孔和第4孔中，接著在第3孔和第4孔分別依次加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀液50μL，混勻，然后再?gòu)牡?孔和第4孔中分別取50μL混勻棄掉，再各取50μL分別依次加到第5和第6孔中，再在第5和第6孔中依次加入2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)新產(chǎn)品稀釋液50μL，混勻，混勻后從第5孔和第6孔中分別取50μL依次加到第7孔和第8孔中，再?gòu)牡?孔和第8孔中分別依次加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)新產(chǎn)品稀釋液50μL，混勻后再?gòu)牡?孔和第8孔中分別取50μL依次加到第9孔和第10孔中，再?gòu)牡?孔和第10孔分別依次加入2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)新產(chǎn)品稀釋液50μL，混勻后從第9孔和第10孔中分別取50μL別棄掉。（使用皮質(zhì)酸乙醇溶液稀釋后各孔徑添加樣物含量都為50μL，質(zhì)量濃度分別為300、200、100、50、2.5μg/L；ACTH（稀釋后各孔徑添加樣物含量都為50μl，質(zhì)量濃度分別為90、30、15、7.5 ng/L）。

2）加樣:分別設(shè)空缺孔（即在空缺對(duì)照板的孔隙內(nèi)不加待測(cè)樣品及其他酶標(biāo)待測(cè)試劑，別的各步加樣操縱并無(wú)差異)、待檢預(yù)測(cè)酶標(biāo)樣品孔，在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加空缺待檢預(yù)測(cè)酶標(biāo)樣品10μL（待測(cè)樣品最后的稀釋度為5倍），將待測(cè)樣品試劑加于原酶標(biāo)板孔底部，（盡量不直接碰觸孔壁，輕輕左右搖晃使其混勻）。

3）溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

4）配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5）洗滌:注意要仔細(xì)揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，同上步驟反復(fù)5次，拍干。

6）加酶:每孔選項(xiàng)加入帶有酶標(biāo)記的試劑50μL，空白孔選項(xiàng)除外。

7）溫育:操作同3。

8）洗滌:操作同5。

9）顯色:每孔先加入顯色劑B50μL，輕輕搖晃使之均勻混合，37℃避光顯色15 min。

10）反應(yīng)終止:每孔中添加一次終止液50μL之后該孔停止化學(xué)反應(yīng)（此時(shí)孔由藍(lán)色逐漸變?yōu)榻瘘S色）。

11）測(cè)定:以空缺孔調(diào)零，420 nm波長(zhǎng)依序丈量各孔的吸光度（OD值），測(cè)定應(yīng)在加停止液之后15 min之內(nèi)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

首先通過(guò)Excel對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行排序后，采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)顯著性分析，所得的數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性水平為（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

ACTH標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=46.435X+2.313 5，R2=0.984 8；皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=188.54X+1.998，R2=0.987 7。說(shuō)明兩個(gè)曲線擬合良好。式中:X為溶液濃度，Y為吸光度。

2.2 對(duì)照組與試驗(yàn)組皮質(zhì)醇與ACTH濃度變化

由表2可知，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，皮質(zhì)醇濃度隨時(shí)間的變化而呈下降趨勢(shì)，且在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 皮質(zhì)醇濃度隨時(shí)間變化情況

由表3可知，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，ACTH濃度隨時(shí)間的變化各組ACTH呈上升趨勢(shì)，在第24 d時(shí)，對(duì)照組ACTH濃度極顯著高于試驗(yàn)組（P＜0.01）。

表3 ACTH濃度隨時(shí)間變化情況

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物在急性應(yīng)激下，皮質(zhì)醇激增。雖然最開始是在促腎上腺皮質(zhì)激素水平大幅上升之前皮質(zhì)醇才開始升高，但如果出現(xiàn)長(zhǎng)期的炎癥應(yīng)激，促腎上腺皮質(zhì)激素的水平會(huì)恢復(fù)到相近于基礎(chǔ)水平，而皮質(zhì)醇水平則由于腎上腺敏感性的增加而持續(xù)上升；在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，垂體的下丘腦激活由促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素為主轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼岷笕~加壓素為主，皮質(zhì)醇水平持續(xù)升高，至少部分原因是皮質(zhì)醇代謝下降[14-15]。

大鼠在恐懼應(yīng)激條件下其血漿中ACTH和皮質(zhì)醇在血清中的含量明顯高于常規(guī)，ACTH和皮質(zhì)醇的含量可以反映垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功效轉(zhuǎn)變[16]。另有研究表明，當(dāng)奶?；加凶訉m內(nèi)膜炎等疾病時(shí)，毛發(fā)中皮質(zhì)醇濃度會(huì)升高，而當(dāng)奶牛處于亞臨床疾病狀態(tài)時(shí)，毛發(fā)中皮質(zhì)醇含量沒有明顯升高[17-21]。在國(guó)內(nèi)，每年有超過(guò)5 000萬(wàn)頭牛通過(guò)半掛車被運(yùn)輸，有研究表明，當(dāng)奶牛在運(yùn)輸壓力下，血清中的ACTH和皮質(zhì)醇含量都會(huì)上升。當(dāng)奶牛處于急性熱應(yīng)激時(shí)，血清皮質(zhì)醇的含量也會(huì)升高，說(shuō)明在應(yīng)激刺激下，機(jī)體作為回應(yīng)，其應(yīng)激素ACTH和皮質(zhì)醇會(huì)升高。

皮質(zhì)醇用作評(píng)估動(dòng)物壓力程度的指標(biāo)，其具有支持或調(diào)控機(jī)體代謝、免疫及穩(wěn)態(tài)的功能，各種生理或病理因素會(huì)影響血漿皮質(zhì)醇激素含量的變化。宋鵬康等人[22]研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠前、中、后期，與自由產(chǎn)圈的相比，限位欄產(chǎn)圈下母豬皮質(zhì)醇含量有一定程度的增加但差異不顯著。本試驗(yàn)結(jié)果表明，單欄飼喂與圈舍飼養(yǎng)下2組灘羊血漿皮質(zhì)醇激素水平差異不顯著。這與宋鵬康[22]等人的研究結(jié)果基本相一致。說(shuō)明單欄飼喂雖然限定了羊只自由活動(dòng)，但不影響灘羊皮質(zhì)醇的分泌。上述試驗(yàn)經(jīng)由神經(jīng)內(nèi)分泌和血液生理指標(biāo)的轉(zhuǎn)變，提高人體適應(yīng)環(huán)境轉(zhuǎn)變的本領(lǐng)，從而保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。在單欄飼喂第24 d的灘羊ACTH濃度低于對(duì)照組，說(shuō)明在單欄飼喂的過(guò)程中，皮質(zhì)醇和ACTH兩種應(yīng)激激素的分泌并未受到顯著影響，推斷單欄飼喂不對(duì)灘羊產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)或受到的應(yīng)激反應(yīng)很小。