雷坤陽(yáng)，謝文杰，孫 庭，劉貽富，王 旭

1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，江西 南昌 330006

腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤。盡管手術(shù)切除是治療早期ccRCC的有效方法，但是針對(duì)晚期及合并復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移患者的治療方式仍然十分有限，導(dǎo)致這類(lèi)患者的預(yù)后較差［1］。因此，發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)志物對(duì)ccRCC的診斷及靶向治療具有非常重要的意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200 bp的非編碼RNA，一般定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中［2］。多項(xiàng)研究［3-4］表明，lncRNA與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。例如，Hottip過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)急性白血病的進(jìn)展［3］，MALAT1可以抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移［4］。另外，lncRNA在ccRCC的發(fā)生、發(fā)展中也占有非常重要的地位。已有研究［5］證實(shí)，ASB16-AS1在ccRCC中低表達(dá)，并且與腫瘤的分期及體積負(fù)相關(guān)。Zhu等［6］的研究表明，MIR4435-2HG可以促進(jìn)ccRCC細(xì)胞系的增殖和轉(zhuǎn)移。反義RNA是指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子，也包括與其他RNA互補(bǔ)的RNA分子。由于核糖體不能翻譯雙鏈RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補(bǔ)結(jié)合，會(huì)抑制該mRNA的翻譯。ARAP1-AS1是ARAP1的反義RNA，最早于2019年在膀胱癌中被發(fā)現(xiàn)［7］。目前研究［8-9］已證實(shí)，ARAP1-AS1與乳腺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤密切相關(guān)。然而，ARAP1-AS1在ccRCC中的作用及其機(jī)制尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究將驗(yàn)證ARAP1-AS1在ccRCC中的作用，并對(duì)其分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料和方法

1.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）是由國(guó)內(nèi)科研機(jī)構(gòu)開(kāi)發(fā)的一種交互式網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，用于分析來(lái)自癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等數(shù)據(jù)庫(kù)的腫瘤和正常樣本的RNA測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)可以進(jìn)行差異表達(dá)分析、相關(guān)性分析和生存分析等。我們使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)查找ccRCC患者的癌組織及正常組織中ARAP1-AS1的表達(dá)水平，并分析ARAP1-AS1的表達(dá)水平與患者腫瘤分期和生存率的關(guān)系。

1.2 組織樣本和細(xì)胞系

65對(duì)ccRCC組織和癌旁組織的標(biāo)本來(lái)源于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，所有患者在手術(shù)前均未接受放療或化療。獲取標(biāo)本后立即置于液氮中凍存，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有患者均經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科診斷為ccRCC。本研究獲得南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。人類(lèi)正常腎小管上皮細(xì)胞系HK2及兩種人源ccRCC細(xì)胞系（786-O和OSRC2）均購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.3 RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

用TRIzol（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取組織和細(xì)胞中的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH作為參照，用SYBR Green RTFQ-PCR Master Mix（武漢賽維爾生物科技有限公司）進(jìn)行RTFQ-PCR，用2ΔΔCt法計(jì)算ARAP1-AS1的表達(dá)量。ARAP1-AS1引物的上游序列為5′-ACTGGAAGGAAGGCTGAAGTC-3′，下游序列為5′-ACTCCAGAAGCAGCAGAAA GC-3′；內(nèi)參GAPDH引物的上游序列為5′-GG TCGGAGTCAACGGATTTG-3′，下游序列為5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞放置在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境中，用含有10%胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）和1%青-鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%的密度時(shí)，將si-ARAP1-AS1和si-NC［漢恒生物科技（上海）有限公司］用LipofectamineTM2000（美國(guó)Invitrogen公司）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。sh-ARAP1-AS1和sh-NC慢病毒由漢恒生物科技（上海）有限公司設(shè)計(jì)及合成。將慢病毒按照說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染到786-O細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h用RTFQ-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，并用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。si-ARAP1-AS1的序列為5′-CCGGAGATGATTGCCCTGATTGCC CCTCGAGGCAATCAGGGCAATC-3′，si-NC的序列為5′-CCGGGAGTTTTTCGTTTTTATCACA CTCGAGTGTGATAAAAACGAAAAACTCTTTT TG-3′，sh-ARAP1-AS1的序列為5′-CCGGAGATG ATTGCCCTGATTGCCCCTCGAGGCAATCAGG GCAATC-3′，sh-NC的序列為5′-CCGGGAGTTTT TCGTTTTTATCACACTCGAGTGTGATAAAAAC GAAAAACTCTTTTTG-3′。

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞按照2×103個(gè)/孔接種到96孔板中，在溫箱中培養(yǎng)24、48、72及96 h后，在每孔內(nèi)加入10 μL CCK-8試劑（武漢賽維爾生物科技有限公司），混勻后放入溫箱繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，然后用酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm處的吸光度（D）值。

1.6 Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)

對(duì)于transwell遷移實(shí)驗(yàn)，在下室中加入600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入transwell小室。將細(xì)胞常規(guī)消化、離心后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，在上室中加入細(xì)胞懸液0.2 mL。培養(yǎng)24 h后用甲醛溶液固定，0.1%結(jié)晶紫染色。用棉簽將上室擦洗干凈，風(fēng)干后在顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)除在上室中涂抹基質(zhì)膠外，其余操作步驟與transwell遷移實(shí)驗(yàn)基本相同。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

用RIPA 裂解液（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）將細(xì)胞在冰上裂解3 0 min，離心后收集上清液備用。使用二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）對(duì)所提取的蛋白進(jìn)行定量。將蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃冰箱內(nèi)用一抗溫育過(guò)夜。第2天，用含吐溫-20三乙醇胺緩沖鹽溶液（tris-buffered saline Tween，TBST）將膜清洗3遍，每遍10 min，室溫下溫育二抗1 h，然后用TBST將膜清洗6遍，每遍5 min。用電化學(xué)發(fā)光（eletrochemical luminescence，ECL）試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）進(jìn)行顯影，用ImageJ軟件分析各條帶的灰度值。本研究中所使用的抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.8 裸小鼠移植瘤模型

將6只4周齡的雌性BALB/c裸小鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）隨機(jī)分為兩組，分別在裸小鼠腋下注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-ARAP1-AS1和sh-NC的786-O細(xì)胞，細(xì)胞密度為5×107個(gè)/只。每隔3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，并繪制生長(zhǎng)曲線。腫瘤體積的計(jì)算公式如下：腫瘤體積=0.5×（長(zhǎng)×寬2）。35 d后將裸小鼠處死，切除腫瘤備用。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.9 免疫組織化學(xué)

將腫瘤組織用石蠟包埋、切片、烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蒸餾水沖洗。加入煮沸的抗原修復(fù)液，切片冷卻后滴加3%過(guò)氧化氫，37 ℃溫育10 min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffered saline，PBS）清洗3遍，滴加一抗，放入4 ℃冰箱過(guò)夜。第2天，用PBS清洗切片3遍，滴加二抗，室溫溫育30 min。PBS清洗切片3遍，依次加入二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）和蘇木精進(jìn)行著色。用乙醇脫水后，封片、觀察和拍照。

每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞。按陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按著色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：0%～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度與著色細(xì)胞數(shù)得分相乘，0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽(yáng)性（+），5～7分為中度陽(yáng)性（++），≥8分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 7.0軟件作圖及數(shù)據(jù)分析，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ARAP1-AS1在ccRCC中的表達(dá)及其臨床意義

通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析ARAP1-AS1在ccRCC組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理學(xué)特征及生存率的關(guān)系。結(jié)果顯示，ARAP1-AS1在ccRCC中高表達(dá)，并且表達(dá)水平與生存率呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤分期呈正相關(guān)（圖1A～1C）。采用RTFQPCR檢測(cè)ARAP1-AS1在ccRCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)量，用相對(duì)表達(dá)水平表示，發(fā)現(xiàn)ARAP1-AS1在ccRCC組織中的表達(dá)（8.94±3.15）高于癌旁組織（2.31±1.24）（P＜0.001，圖2A）；ARAP1-AS1在786-O（6.15±0.72）和OSRC2細(xì)胞（4.75±0.13）中的表達(dá)明顯高于HK2細(xì)胞（1.00±0.05）（P＜0.001，圖2B）。以ARAP1-AS1表達(dá)的中位數(shù)為界，將65例RCC患者分為高表達(dá)組（32例）和低表達(dá)組（33例）。高表達(dá)組的隨訪時(shí)間為（35.9±12.7）個(gè)月，低表達(dá)組的隨訪時(shí)間為（42.7±15.3）個(gè)月；至隨訪結(jié)束共存活39例，高表達(dá)組存活15例（28.1%），低表達(dá)組存活24例（72.7%）；高表達(dá)組的總生存率為21.6%，低表達(dá)組的總生存率為57.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2C）。另外，ARAP1-AS1的高表達(dá)與患者的腫瘤體積增大和晚期腫瘤顯著相關(guān)（表1）。

表1 ARAP1-AS1的表達(dá)與ccRCC患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between expression of ARAP1-AS1 and clinicopathological features in patients with ccRCC

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中ARAP1-AS1在ccRCC中的表達(dá)及其與腫瘤分期和患者生存率關(guān)系Fig.1 Expression of ARAP1-AS1 in ccRCC in the GEPIA database and its relation to survival rate and tumor stage of the patients

圖2 ARAP1-AS1在ccRCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)以及生存分析Fig.2 ARAP1-AS1 expression in ccRCC tissues and cell lines and survival analysis of the patients

2.2 ARAP1-AS1對(duì)ccRCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

用si-ARAP1-AS1和si-NC分別轉(zhuǎn)染ccRCC細(xì)胞（786-0和OSRC2），通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ARAP1-AS1對(duì)ccRCC細(xì)胞體外增殖能力的影響，結(jié)果顯示，沉默ARAP1-AS1的表達(dá)可使ccRCC細(xì)胞增殖能力明顯減弱（圖3A）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ARAP1-AS1對(duì)ccRCC細(xì)胞體外遷移能力的影響，結(jié)果顯示，si-ARAP1-AS1組細(xì)胞遷移能力明顯低于si-NC組（786-O：320±42vs115±19；OSRC2：580±75vs155±32，P均＜0.05，圖3B）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ARAP1-AS1對(duì)ccRCC細(xì)胞體外侵襲能力的影響，結(jié)果證實(shí)，si-ARAP1-AS1組細(xì)胞侵襲能力明顯低于si-NC組（786-O：110±12vs35±8；OSRC2：175±21vs40±12，P均＜0.05，圖3C）。

圖3 ARAP1-AS1對(duì)ccRCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effect of ARAP1-AS1 on the proliferation,migration,and invasion capacity of ccRCC cells

2.3 沉默ARAP1-AS1抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路

為驗(yàn)證在ccRCC中ARAP1-AS1是否可以調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，用si-ARAP1-AS1和si-NC分別轉(zhuǎn)染ccRCC細(xì)胞（786-0和OSRC2），用Western blot和圖像分析實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，用相對(duì)表達(dá)水平表示，結(jié)果見(jiàn)圖4，沉默ARAP1-AS1可以顯著抑制兩株ccRCC細(xì)胞內(nèi)β-catenin、c-Myc及cyclin D1的表達(dá)。

圖4 沉默ARAP1-AS1對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響Fig.4 Effect of silencing of ARAP1-AS1 on the Wnt/β-catenin signaling pathway

2.4 沉默ARAP1-AS1抑制ccRCC細(xì)胞的體內(nèi)成瘤性及增殖活性

首先用RTFQ-PCR驗(yàn)證sh-ARAP1-AS1的沉默效率，結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，sh-ARAP1-AS1組細(xì)胞的ARAP1-AS1表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5A）。將轉(zhuǎn)染sh-ARAP1-AS1和sh-NC的786-O細(xì)胞注射至裸小鼠腋下，細(xì)胞數(shù)量為5×107個(gè)/只，每隔3 d測(cè)量腫瘤大小，并繪制生長(zhǎng)曲線，35 d后將裸小鼠處死，切除腫瘤。裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，sh-ARAP1-AS1組裸小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢，且腫瘤的體積更?。▓D5B～5D）。采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)裸小鼠腫瘤組織中Ki-67增值指數(shù)，結(jié)果顯示，sh-ARAP1-AS1組裸小鼠腫瘤組織中的Ki-67增殖指數(shù)明顯低于sh-NC組（17.2%vs43.5%，P＜0.001，圖5E）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默ARAP1-AS1可以抑制ccRCC細(xì)胞的體內(nèi)成瘤性及增殖活性。

圖5 沉默ARAP1-AS1對(duì)ccRCC細(xì)胞的體內(nèi)成瘤性及增殖活性的影響Fig.5 Effect of ARAP1-AS1 on the proliferation,migration,and invasion capacity of ccRCC cells

3 討 論

近年來(lái)，lncRNA一直是分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究［10-11］已經(jīng)通過(guò)lncRNA闡明了多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的復(fù)雜生物學(xué)機(jī)制。作為一種泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，ccRCC的治療一直是一個(gè)棘手的問(wèn)題，尤其是免疫治療。因此，探討lncRNA在ccRCC中的作用具有非常重要的意義。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析了GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中與ccRCC相關(guān)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)ARAP1-AS1在ccRCC組織中高表達(dá)，并且與不良預(yù)后及較高的分期相關(guān)，因此，本研究將ARAP1-AS1作為研究對(duì)象。

本研究顯示，ARAP1-AS1在ccRCC組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，并且與較大的腫瘤體積及較高的腫瘤分期相關(guān)，此外，ARAP1-AS1高表達(dá)組的患者總生存率也低于低表達(dá)組。有研究［9］表明，ARAP1-AS1在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常的結(jié)腸組織和細(xì)胞，并且其高表達(dá)與結(jié)腸癌的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。另外，Zhang等［12］研究表明，ARAP1-AS1在宮頸癌中的表達(dá)量與腫瘤大小、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)。類(lèi)似結(jié)果在胃癌中也可以觀察到［13］。

為驗(yàn)證ARAP1-AS1在ccRCC中的功能，我們進(jìn)行了一系列的體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ARAP1-AS1可以促進(jìn)ccRCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。裸小鼠移植瘤模型結(jié)果顯示，ARAP1-AS1可以在體內(nèi)促進(jìn)ccRCC腫瘤的生長(zhǎng)，并使ccRCC細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)。ARAP1-AS1在其他腫瘤中也有類(lèi)似作用，如在肺癌中ARAP1-AS1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［14］。另外，ARAP1-AS1可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移，從而影響乳腺癌的進(jìn)展［8］。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路存在于各種類(lèi)型的癌癥中，在細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成中發(fā)揮重要作用［15］。Xu等［16］研究表明，SDHA通過(guò)失活Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制ccRCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。另有研究［17］顯示，過(guò)表達(dá)LINC00675通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路可減弱ccRCC細(xì)胞的惡性表型。本研究中，沉默ARAP1-AS1可以抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc及cyclin D1的表達(dá)，說(shuō)明ARAP1-AS1可以通過(guò)靶向Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響ccRCC的進(jìn)展。

綜上所述，ARAP1-AS1在ccRCC中高表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān)。ARAP1-AS1可通過(guò)影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路而影響ccRCC的進(jìn)展。ARAP1-AS1可能是ccRCC潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。