李 偲， 張東旭， 劉羽康， 張愛杰， 劉興超， 樊慧蓉*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津 300192；3.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；4.河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050200)

耳聾丸收載于2020年版《中國藥典》一部，由龍膽、黃芩、梔子、地黃、木通、當(dāng)歸、澤瀉、九節(jié)菖蒲、羚羊角、甘草組成，具有清肝瀉火、利濕通竅之功效，臨床上常用于肝膽濕熱所致的頭暈頭痛、耳聾耳鳴和耳內(nèi)流膿等病癥。耳聾膠囊由耳聾丸組方藥材經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝加工而成，具有生物利用度高、服用方便等優(yōu)點(diǎn)，療效顯著[1-3]。

目前，關(guān)于耳聾膠囊化學(xué)成分尚缺乏系統(tǒng)研究，僅有少數(shù)報(bào)道針對(duì)黃芩苷[4-5]和梔子苷[5]進(jìn)行含量測(cè)定，無法全面反映該制劑活性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS/MS法，結(jié)合對(duì)照品、HR-MS/MS Spectral Library1.1質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)耳聾膠囊化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，并明確其藥材歸屬，完善其化學(xué)成分譜，以期為其后續(xù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

Nexera UPLC LC-30A色譜儀(日本島津公司)；Triple TOF 4600高分辨質(zhì)譜儀、Analyst 1.7.1 色譜工作站、PeakView 2.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國AB Sciex公司)；色譜柱(上海沃特世科技有限公司)。

耳聾膠囊(唐山景忠山國藥有限公司，批號(hào)190802)。對(duì)照品甘草素(批號(hào)ZZS-20-076-A4)、綠原酸(批號(hào)ZZS-20-114-A8)、龍膽苦苷(批號(hào)ZZS-20-193-D6)、黃芩苷(批號(hào)ZZS-20-103-A1)、黃芩素(批號(hào)ZZS-19-017-A6)、漢黃芩素(批號(hào)ZZS-20-193-N5)、23-乙酰澤瀉醇B(批號(hào)ZZS-20-193-K2)、木通苯乙醇苷B(批號(hào)ZZS-20-193-P7)、阿魏酸(批號(hào)ZZS-20-087-B5)、藁本內(nèi)酯(批號(hào)ZZS-20-196-A2)、甘草酸(批號(hào)ZZS-20-193-O6)、甘草次酸(批號(hào)ZZS-20-196-A7)、京尼平(批號(hào)ZZS-20-196-J9)、京尼平苷酸(批號(hào)ZZS-20-193-M9)、原兒茶酸(批號(hào)ZZS-20-104-A2)均購自甄準(zhǔn)生物科技有限公司；梔子苷(批號(hào)110749-201718)、甘草苷(批號(hào)111610-201607)、山柰酚(批號(hào)D3ON-QH1T)、槲皮素(批號(hào)110759-201105)、熊果酸(批號(hào)110742-201622)均購自中國食品藥品鑒定研究院；7-羥基香豆素(批號(hào)50112)購自Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司；毛蕊花糖苷(批號(hào)wkq16062004)、梓醇(批號(hào)wkq17030904)、甘草酸銨(批號(hào)wkq16082203)均購自四川省維克奇生物科技有限公司；5-羥甲基糠醛(批號(hào)G1040044)購自DRC公司；丁香酚(批號(hào)D-064-161216)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。甲醇(美國Fisher Scientific公司)、甲酸(天津大茂化學(xué)試劑有限公司)均為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1 檢測(cè)條件

2.1.1 色譜條件 Waters Atlantis T3色譜柱(4.6 mm×100 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～2 min，96% B；2～6 min，96%～35% B；6～41 min，35%～0% B；41～48 min，0% B；48～48.5 min，0%～96% B；48.5～56 min，96% B)；體積流量0.6 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧正、負(fù)離子模式，MS掃描范圍m/z50～1 000，MS2掃描范圍m/z50～1 000；離子源溫度500 ℃；離子噴霧電壓5 500 V/-4 500 V；離子源氣體1、2均為60 psi(1 psi=6.895 kPa)；氣簾氣壓力35 psi；去簇電壓±40 V；MS碰撞能±10 eV，MS2碰撞能±35 eV。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各固體對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成含各成分1 mg/mL的溶液，各取100 μL混合，甲醇稀釋至20 μg/mL，即得，過0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取膠囊內(nèi)容物1 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入65%甲醇20 mL，超聲(250 W、40 kHz)處理50 min，放冷，65%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，12 000 r/min離心5 min后取上清液過0.22 μm微孔濾膜，續(xù)濾液稀釋10倍，即得。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 對(duì)于有對(duì)照品的成分，通過比對(duì)對(duì)照品及其保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片特征進(jìn)行鑒定；對(duì)于沒有對(duì)照品的成分，一是應(yīng)用Analyst IF1.7.1、Peakview2.2軟件結(jié)合HR-MS/MS Spectral Library 1.1數(shù)據(jù)庫在規(guī)定的質(zhì)量數(shù)偏差5×10-6內(nèi)對(duì)供試品溶液化學(xué)成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)分析；二是通過查閱中英文相關(guān)文獻(xiàn)，收集已報(bào)道的組方藥材中化學(xué)成分信息，包括名稱、分子式、CAS號(hào)、化學(xué)結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜碎片離子信息等，建立耳聾膠囊的初步化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。最終，采用“對(duì)照品-數(shù)據(jù)庫-文獻(xiàn)報(bào)道”綜合分析策略對(duì)耳聾膠囊所含化學(xué)成分進(jìn)行鑒定和辨識(shí)。

3 結(jié)果

基峰色譜圖見圖1，共鑒定出130種成分，包括46種黃酮及其苷類、30種萜類、10種苯酞類、4種香豆素類、6種苯乙醇苷類、12種有機(jī)酸類、13種含氮類、9種其他類，其中9種來源于君藥龍膽，21種來源于臣藥黃芩，36種來源于臣藥梔子，16種來源于地黃，3種來源于木通，11種來源于澤瀉，19種來源于當(dāng)歸，4種來源于九節(jié)菖蒲，9種來源于羚羊角，23種來源于甘草，山柰酚為龍膽和梔子的共有成分，綠原酸及亞油酸為梔子和當(dāng)歸的共有成分，蔗糖和棕櫚酸歸屬于全部藥味。各成分鑒定結(jié)果和藥材歸屬結(jié)果見表1(化合物1～66為正離子模式下檢測(cè)得到，化合物67～130為負(fù)離子模式下檢測(cè)得到)。

3.1 黃酮類 該類化合物裂解方式主要有糖苷鍵斷裂、RDA裂解重排、脫去中性碎片、丟失羰基、糖環(huán)裂解和交叉環(huán)切除等。典型化合物104在保留時(shí)間9.69 min時(shí)檢測(cè)到準(zhǔn)分子離子峰m/z285.040 6[M-H]-，經(jīng)質(zhì)譜軟件和元素組成預(yù)測(cè)分子式C15H10O6，碎片離子有m/z257.047 3[M-H-CO]-、 239.032 4[M-H-CO-H2O]-、 211.041 0[M-H-2CO-H2O]-，同時(shí)母離子發(fā)生RDA裂解脫去C4H4O3和C8H6O2分子，得到碎片離子m/z185.057 7和151.034 2，與對(duì)照品和文獻(xiàn)[16]比對(duì)后推測(cè)為山柰酚，為君藥龍膽和臣藥梔子的共有成分，其質(zhì)譜裂解途徑見圖2。

圖1 耳聾膠囊基峰色譜圖Fig.1 BPC chromatograms of Erlong Capsules

圖2 山柰酚質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathway of kaempferol

3.2 萜類

3.2.1 環(huán)烯醚萜及其苷類 該類化合物裂解途徑主要為糖苷鍵斷裂及丟失CO2、H2O、CH3OH、CH3COOH等中性分子或母核上的一些取代基。典型化合物86在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z357.117 6，推測(cè)其分子式C16H20O9，二級(jí)質(zhì)譜可見碎片離子m/z195.064 9[M+H-Glu]+、177.054 0[M+H-Glu-H2O]+、149.059 4[M+H-Glu-H2O-CO]+，結(jié)合對(duì)照品、數(shù)據(jù)庫匹配和文獻(xiàn)[12]推測(cè)為龍膽苦苷，為君藥龍膽的《中國藥典》含量測(cè)定指標(biāo)性成分，其質(zhì)譜裂解途徑見圖3，保留時(shí)間7.94 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z411.126 3[M+Na]+，推斷分子式C17H24O10，其質(zhì)譜裂解途徑見圖4，結(jié)合對(duì)照品信息、文獻(xiàn)[13]和數(shù)據(jù)庫匹配推測(cè)為梔子苷，為臣藥梔子的《中國藥典》含量測(cè)定指標(biāo)性成分。

表1 耳聾膠囊化學(xué)成分鑒定和藥材歸屬結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

圖3 龍膽苦苷質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathway of gentiopicroside

圖4 梔子苷質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathway of geniposide

3.2.2 三萜及其苷類 該類化合物常丟失一分子或多分子糖基形成苷元離子，苷元離子則易失去一分子水，準(zhǔn)分子離子可通過C-23和C-24之間重排得到碎片離子。典型化合物61準(zhǔn)分子離子峰m/z515.372 6[M+H]+，保留時(shí)間為28.12 min，預(yù)測(cè)可能分子式C32H50O5，二級(jí)質(zhì)譜中可見m/z497.363 5[M+H-H2O]+、 437.340 5[M+H-H2O-CH3COOH]+、383.292 1[M+H-H2O-C6H10O2]+、365.284 4[M+H-2H2O-C6H10O2]+，通過對(duì)照品比對(duì)、文獻(xiàn)[24-25]和數(shù)據(jù)庫匹配可以確定為23-乙酰澤瀉醇B，為組方藥材澤瀉的《中國藥典》含量測(cè)定指標(biāo)性成分，其質(zhì)譜裂解途徑見圖5。

圖5 23-乙酰澤瀉醇B質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathway of Alisol-B 23-acetate

3.3 苯酞類 該類化合物裂解特征主要分為2類，一是側(cè)鏈斷裂脫烯，產(chǎn)生[M+H-CnH2n]+等碎片離子；另一類則表現(xiàn)為開環(huán)連續(xù)丟失H2O和CO分子。典型化合物38保留時(shí)間為15.35 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z191.106 9，推測(cè)分子式C12H14O2，二級(jí)裂解碎片可見m/z173.096 0[M+H-H2O]+、163.111 1[M+H-C2H4]+、149.059 5[M+H-C3H6]+、145.100 9[M+H-HCOOH]+、117.069 5[M+H-HCOOH-C2H4]+和105.070 1[M+H-HCOOH-C3H4]+，結(jié)合對(duì)照品信息、文獻(xiàn)報(bào)道[22]及數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果推測(cè)為Z-藁本內(nèi)酯，為組方藥材當(dāng)歸的主要活性成分之一，其質(zhì)譜裂解途徑見圖6。

圖6 Z-藁本內(nèi)酯質(zhì)譜裂解途徑Fig.6 Fragmentation pathway of Z-Ligustilide

3.4 香豆素類 該類化合物二級(jí)裂解特征主要為母離子丟失中性分子。典型化合物15保留時(shí)間為8.02 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z193.049 7[M+H]+，推測(cè)分子式C10H8O4，二級(jí)裂解可見碎片離子m/z165.055 4[M+H-CO]+、147.055 1[M+H-CO-H2O]+、137.059 0[M+H-2CO]+和119.049 0[M+H-2CO-H2O]+，結(jié)合文獻(xiàn)[9，15]和數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果推測(cè)為東莨菪內(nèi)酯，為組方臣藥梔子的主要活性成分之一，其質(zhì)譜裂解途徑見圖7。

圖7 東莨菪內(nèi)酯質(zhì)譜裂解途徑Fig.7 Fragmentation pathway of Scopoletin

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，中耳炎等耳部疾病與肝火上擾證密切相關(guān)；西醫(yī)認(rèn)為，其發(fā)病機(jī)制主要為氧化損傷、炎性因子、微循環(huán)障礙、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)損傷和免疫反應(yīng)等[37-39]。本研究較為全面地闡明了耳聾膠囊的化學(xué)成分，基本涵蓋了10味組方藥材，其中多數(shù)成分與耳部疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān)。例如，在氧化損傷、抗炎和微循環(huán)調(diào)節(jié)方面，君藥龍膽中龍膽苦苷可降低腫瘤壞死因子-α、白介素-6、一氧化氮和丙二醛含量[40]；臣藥黃芩中黃芩苷、黃芩素對(duì)羥基自由基、超氧自由基和過氧自由基都具有一定的清除能力[41]；臣藥梔子中梔子苷和東莨菪內(nèi)酯能夠顯著抑制體內(nèi)外TNF-α、IL-6和白介素-1β的產(chǎn)生[42-43]；地黃中梓醇[44]和5-羥甲基糠醛[45]也具有一定的抗氧化損傷作用；澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B具有抗炎[46]作用；當(dāng)歸中苯酞類如藁本內(nèi)酯和黃酮類化合物具有較好的抗氧化和抗炎作用[47]；九節(jié)菖蒲中β-細(xì)辛醚可能通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄與表達(dá)而起到抗炎作用[48]；甘草中甘草苷可以通過提高超氧化物歧化酶活性來減少自由基[49]，抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)主要為甘草酸、甘草次酸和甘草總黃酮[50]。在細(xì)胞凋亡方面，山柰酚可以抑制常見耳毒性藥物順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[51]，地黃中梓醇可通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax基因表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡[52]；在神經(jīng)損傷方面，地黃中梓醇和毛蕊花糖苷被證實(shí)具有神經(jīng)保護(hù)作用[53-55]；在免疫反應(yīng)方面，地黃中(異)毛蕊花糖苷具有免疫調(diào)節(jié)的作用[56]。

綜上所述，UPLC-Q-TOF-MS /MS法可對(duì)耳聾膠囊化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，而“對(duì)照品-數(shù)據(jù)庫-文獻(xiàn)報(bào)道”策略能有效提高鑒定準(zhǔn)確性和可信度，為其后續(xù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制、質(zhì)量控制研究提供參考。