史鵬杰， 黃豆豆， 徐艾娜， 程嘉希， 董志穎， 孫連娜

(上海中醫(yī)藥大學中藥學院，上海 201203)

趕黃草是虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜PenthorumchinensePursh.的干燥地上部分，主產(chǎn)于四川古藺，始載于明代《救荒本草》[1],其水提取物主要具備抗脂肪肝、抗肝纖維化及治療和保護肝損傷的作用[2]，還有一定解酒[3]、降糖[4]、緩解體力[5]、抗衰老[6]的作用。課題組前期研究結(jié)果表明，趕黃草中以黃酮苷連接沒食子酰基的酚酸類化合物pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose(PHG)、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl-3″-galloyl]-β-D-glucose(PGHG)、thonningianin A具有較強的抗肝纖維化及保肝活性[7-9]，同時三者降糖活性較好[4]，開發(fā)前景廣闊。大孔樹脂作為環(huán)?？稍偕募兓盍?，具有性質(zhì)穩(wěn)定、成本低、樣品回收率高的特點[10-12]，故本實驗以大孔樹脂為填料，對趕黃草中大環(huán)多酚純化工藝進行優(yōu)化，以期為進一步對該該成分的后續(xù)開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；XS105DU、XS104電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Centrifuge5810R高速臺式冷凍離心機(德國Eppendolf公司)；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會社)。

1.2 試劑與藥物 PHG(批號20181117)、thonningianin A(批號20181103)、PGHG(批號20181103)對照品均為自制，經(jīng)HPLC歸一化法檢測其純度均≥98%。大孔樹脂AB-8、D-101、HPD-400(天津正天成澄清技術(shù)有限公司)；DM-130、HP-20、HPD-450、HPD-600、HPD-750、BS-30、ABS-21、DA-201(蚌埠市遼源新材料有限公司)；sepLite LX-17、sepLite LX-60、sepLite LX-3020、ztc-1、sepLite LX-12、sepLite XDA-8(西安藍曉科技新材料股份有限公司)。趕黃草由四川新荷花中藥飲片有限公司提供，批號19050701，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學孫連娜副教授鑒定為虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜PenthorumchinensePursh.的干燥地上部分，保存于上海中醫(yī)藥大學中藥資源與生物技術(shù)研究中心。乙腈為色譜純(美國賽默飛公司)；甲酸為色譜純(上海麥克林生化科技有限公司)；乙醇、甲醇為分析純(德國Greagent公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 大環(huán)多酚含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取PHG、PGHG、thonningianin A對照品適量，80%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.600 8、0.598 4、0.499 2 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材適量，80%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.5%甲酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，28%～30%A；10～20 min，30%～36%A；20～22 min，36%～39%A；22～30 min，39%～40%A；30～35 min，40%～90%A；35～37 min，90%～28%A；37～40 min，28%A)；體積流量1 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.PHG 2.PGHG 3.thonningianin A圖1 各成分HPLC色譜圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 將“2.1.1”項下對照品溶液依次稀釋2、4、10、50、100倍，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得PHG、PGHG、thonningianin A方程分別為Y=19 108.510 7X-0.055 4(R2=1.000 0)，Y=22 849.421 6X-2.119 0(R2=1.000 0)，Y=23 226.107 9X+6.499 1(R2=1.000 0)，分別在6.01～600.80、5.98～598.40、4.99～499.20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 上樣液制備 根據(jù)課題組前期優(yōu)化所得趕黃草中大環(huán)多酚的最優(yōu)提取工藝提取藥材，具體方法為將藥材切成3～5 cm小段，10倍量80%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至無醇味(液體體積-藥材質(zhì)量=4∶1)，向濃縮液中加入適量95%乙醇，調(diào)節(jié)體積分數(shù)至30%，4 000 r/min離心20 min，取上清液，即得。

2.3 靜態(tài)吸附性能考察 取預(yù)處理好的大孔樹脂抽濾，各精密稱取1 g，精密量取20 mL質(zhì)量濃度為3.85 mg/mL的上樣液，在恒溫搖床上50 r/min、25 ℃振搖吸附24 h后抽濾，取濾液，測定大環(huán)多酚含量，去離子水清洗樹脂2次，抽濾至干，精密加入95%乙醇40 mL，在相同條件下振搖解吸24 h，取上清液，測定大環(huán)多酚含量，計算吸附率、解吸附率，公式如下，其中C0為上樣液中大環(huán)多酚初始質(zhì)量濃度(mg/mL)，C1為吸附后上清液中大環(huán)多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)，C2為解吸后上清液中大環(huán)多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)，V1為上樣液體積(mL)，V2為解析溶液體積(mL)，W為樹脂質(zhì)量(g)，結(jié)果見表1。綜合考慮吸附、解吸附效果，選擇HPD-400型大孔樹脂進行動態(tài)吸附性能考察。

2.4 吸附考察

表1 不同型號大孔樹脂吸附率、解吸附率測定結(jié)果

圖2 不同上樣質(zhì)量濃度下吸附曲線

2.4.2徑高比對吸附效果的影響 取“2.3”項下上樣液，調(diào)節(jié)大環(huán)多酚總含量為1.89mg/mL，將其以3BV/h的體積流量通入裝有處理好的HPD-400型大孔樹脂、徑高比分別為1∶4、1∶8、1∶12的色譜柱中，填料質(zhì)量(體積)分別為12g(20mL)、24g(40mL)、36g(60mL)。每1BV為1個流分，測定流出液中大環(huán)多酚總含量，計算泄漏點的吸附率[13]，吸附曲線見圖3。由此可知，隨著徑高比增加泄漏點提前，總吸附率呈降低趨勢，故選擇1∶4作進一步研究。

圖3 不同徑高比下吸附曲線

2.4.3上樣體積流量 取“2.3”項下上樣液，調(diào)節(jié)大環(huán)多酚總含量為1.89mg/mL，將其分別以1、2、3BV/h的體積流量通入裝有處理好的HPD-400型大孔樹脂、徑高比為1∶4的色譜柱中，填料質(zhì)量(體積)為12g(20mL)，每1BV為1個流分，測定流出液中大環(huán)多酚總含量，計算泄漏點前吸附率，吸附曲線見圖4。由此可知，上樣體積流量較低時吸附率高，但耗時長，故結(jié)合生產(chǎn)實際選擇2～2.5BV/h作進一步研究。

圖4 不同體積流量下吸附曲線

2.4.4上樣量 取“2.2.3”項下上樣液，調(diào)節(jié)其大環(huán)多酚總含量為1.89mg/mL，將其以2～2.5BV/h的體積流量通入裝有處理好的12g(20mL)HPD-400型大孔樹脂、徑高比為1∶4的色譜柱中，每1BV為1個流分，測定流出液中大環(huán)多酚含量直至泄漏點，吸附曲線見圖5。由此可知，上樣量為10BV時流出液中大環(huán)多酚總含量為0.255mg/mL，已超過泄漏點，為減少樣品損失，故選擇9BV作進一步研究。

圖5 不同上樣量下吸附曲線

2.5 解吸附考察

2.5.1 洗脫液(乙醇)體積分數(shù) 平行裝柱(填料質(zhì)量12 g，20 mL)，按“2.4”項下最優(yōu)方式上樣(大環(huán)多酚含量為1.89 mg/mL)，依次加入體積分數(shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇各8 BV，以1.0～1.5 BV/h體積流量洗脫，計算洗脫液中大環(huán)多酚總量、洗脫部位質(zhì)量、大環(huán)多酚含量，結(jié)果見表2。由此可知，大環(huán)多酚集中于40%～60%乙醇洗脫部位，含量在19.47%～35.43%之間。

表2 洗脫液體積分數(shù)考察結(jié)果

2.5.2 雜質(zhì)洗脫體積分數(shù) 平行裝柱(填料質(zhì)量12 g，20 mL)，按“2.4”項下最優(yōu)方式上樣，分別用體積分數(shù)為30%、33%、37%、40%、43%的乙醇各8 BV洗脫除雜，收集洗脫液，減壓干燥后稱定質(zhì)量，測定大環(huán)多酚含量，結(jié)果見圖6。由此可知，隨著乙醇體積分數(shù)增加，大環(huán)多酚損失率逐漸升高，為了在洗去較多雜質(zhì)的同時減少損失，選擇雜質(zhì)洗脫體積分數(shù)為40%。

圖6 雜質(zhì)洗脫體積分數(shù)對大環(huán)多酚含量的影響

2.5.3 雜質(zhì)洗脫液用量 平行裝柱(填料質(zhì)量96 g，160 mL)，按“2.4”項下最優(yōu)方式上樣，40%乙醇洗脫除雜，收集洗脫液，減壓干燥后稱定質(zhì)量，結(jié)果見圖7。由此可知，雜質(zhì)洗脫液用量為14 BV時親水性雜質(zhì)基本被洗脫完全。

圖7 雜質(zhì)洗脫曲線

2.5.4 洗脫劑(乙醇)體積分數(shù) 平行裝柱(填料質(zhì)量96 g，160 mL)，按“2.4”項下最優(yōu)方式上樣，14 BV40%乙醇洗脫除雜后分別用體積分數(shù)為45%、50%、55%、60%的乙醇各8 BV洗脫，收集洗脫液，檢測大環(huán)多酚含量，計算其轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見圖8。由此可知，洗脫劑體積分數(shù)為50%時，大環(huán)多酚含量接近70%，轉(zhuǎn)移率高于50%；隨著洗脫劑體積分數(shù)進一步增加，轉(zhuǎn)移率升高，但含量明顯降低，故綜合考慮后確定為50%。

圖8 洗脫劑體積分數(shù)對大環(huán)多酚、轉(zhuǎn)移率的影響

2.5.5 洗脫劑(乙醇)用量 裝好大孔樹脂柱(填料質(zhì)量96 g，160 mL)，按“2.4”項下最優(yōu)方式上樣，以體積流量1.0～1.5 BV/h梯度洗脫，先用14 BV 40%乙醇洗脫除雜，再用50%乙醇洗脫，收集1～2、3～4、5～6、7～8、9～10 BV段，減壓濃縮至干，稱定質(zhì)量，測定大環(huán)多酚含量，結(jié)果見圖9。由此可知，洗脫10 BV時基本可洗脫完全，故選擇其作為洗脫劑用量。

圖9 洗脫劑用量對大環(huán)多酚含量的影響

2.6 驗證試驗 稱取處理好的HPD-400型大孔樹脂2.4 kg(4 L)裝柱，調(diào)節(jié)上樣液中大環(huán)多酚質(zhì)量濃度至1.60～2.20 mg/mL(溶液質(zhì)量濃度約為20 mg/mL)，以2～2.5 BV/h體積流量通入徑高比為1∶4的HPD-400型大孔樹脂柱中，上樣量9 BV，以14 BV 40%、10 BV 50%乙醇依次洗脫，收集50%乙醇洗脫部位，測定大環(huán)多酚含量、轉(zhuǎn)移率、得率，平行3批，結(jié)果見表3，可知該工藝穩(wěn)定可靠。

3 討論

3.1 大孔樹脂選擇 大孔樹脂是一類具有較好吸附性能的有機高聚物吸附劑，性質(zhì)穩(wěn)定，是一類理想的純化填料。本實驗中考察了16種大孔樹脂，涵蓋了非極性、弱極性、中極性、極性、高表面活性5種不同性質(zhì)的大孔樹脂，通過考察靜態(tài)吸附、解析附以及靜態(tài)吸附飽和時間，HPD-400型大孔樹脂具有較高的吸附率及最高的解吸附率，解吸附效果最佳，趕黃草中大環(huán)多酚屬極性中等偏大，與HPD-400型大孔樹脂性質(zhì)一致，故選其為純化填料。

表3 驗證試驗結(jié)果(n=3)

3.2 上樣液制備 前期趕黃草藥材經(jīng)提取后濃縮至無醇味，大環(huán)多酚在水中溶解度低，呈泥漿狀，隨溶媒乙醇體積分數(shù)升高溶解度增大。根據(jù)預(yù)實驗，該類成分在本實驗選擇型號大孔樹脂下，40%乙醇沖洗即可被洗脫，為了減少該類成分損失，選擇30%乙醇溶液作為溶媒。

3.3 結(jié)果分析 本實驗采用HPLC法測定PHG、PGHG、thonningianin A含量，并以其總含量在所得部位中的占比及其總轉(zhuǎn)移率為指標進行純化工藝考察。通過3次放大驗證此純化過程，大環(huán)多酚洗脫率可達90%，純化所得產(chǎn)品中大環(huán)多酚轉(zhuǎn)移率達50%以上，含量由上樣前的8%提高至65%以上，得率為6.56%，RSD均小于5%，說明該型號大孔樹脂較為適用于趕黃草中大環(huán)多酚成分的純化，且環(huán)?？芍貜屠?，成本低，為趕黃草中該類成分的進一步開發(fā)研究提供了有力支持。