仝立國， 牛艷艷， 吉海杰， 宋美卿， 楊 鈐， 馮瑪莉， 汪欣文

(山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012)

扶正固本顆粒由黃芩、淫羊藿、女貞子、何首烏、地黃、茜草等8味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、涼血解毒的功效，適用于對食管癌、胃寒氣陰兩虛兼熱毒癥患者放化療時(shí)合并用藥，收載于國家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(WS-5250(B-0250)-2002)[1]，但目前該制劑質(zhì)量控制方法仍以單一成分為指標(biāo)，難以全面確保其質(zhì)量穩(wěn)定性。

中藥指紋圖譜具有信息量大、特征性強(qiáng)等特點(diǎn)，能從整體上把握其質(zhì)量，在評價(jià)質(zhì)量一致性及產(chǎn)品穩(wěn)定性方面具有明顯的優(yōu)勢[2]。前期已有很多對中藥藥味指紋圖譜、含量測定及成分分析的報(bào)道[3-10]，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上建立扶正固本顆粒HPLC指紋圖譜，以期為后續(xù)制定與該制劑功效相關(guān)的多成分含量測定方法提供依據(jù)，也為建立其系統(tǒng)全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配置G1322A真空脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1329A自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315D DAD二極管陣列檢測器、HP Chemstation色譜工作站；超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)(美國Waters公司)，包括ACQUITY UPLC I Class-G2-XS QTOF、MassLynx V4.1 質(zhì)譜工作站、ESI離子源。XS105電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；超純水器(美國Millipore公司)；S60H超聲波清洗機(jī)(德國艾爾瑪公司)。

1.2 試劑與藥物 黃芩苷(110715-201318)、黃芩素(111595-200604)、淫羊藿苷(110737-201516)、寶藿苷I(111852-201603)、漢黃芩素(111514-201706)、漢黃芩苷對照品(112002-201702)，2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯基葡萄糖苷對照品(110844-201109)、大黃素(110756-201512)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。黃芩、淫羊藿、女貞子、何首烏、地黃、茜草、黃精、人參均由山西振東開元制藥有限公司提供，經(jīng)山西省藥品檢驗(yàn)所高天愛主任藥師鑒定為正品。扶正固本顆粒共10批，均來源于山西振東開元制藥有限公司，批號分別為20160603、20161104、20170806、20170401、20171012、20180302、20180601、20181002、20190301、20190603。甲醇、乙腈為色譜純(迪馬科技公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～20 min，5%～40%A；20～38 min，40%～50%A；38～62 min，50%A；62～68 min，50%～65%A；68～73 min，65%A；73～80 min，65%～75%A；80～85 min，75%～80%A；85～90 min，80%～90%A；90～98 min，90%A；98～100 min，90%～5%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長0～9.25 min 275 nm，9.25～10.5 min 285 nm，10.5～12.5 min 260 nm，12.5～14.5 min 250 nm，14.5～24 min 275 nm，24～25.5 min 320 nm，25.5～100 min 275 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 參考文獻(xiàn)[11]報(bào)道。XEVO G2-XS ESI離子源，正/負(fù)離子模式；錐孔電壓40 V；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔氣體積流量50 L/h；脫溶劑氣體積流量700 L/h；掃描范圍m/z100～1 500；校正液亮氨酸-腦啡肽，[M+H] 556.277 1，[M-H] 554.261 5。采用Masslynx4.1工作軟件，在MSEContinuum模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，掃描速率0.2/s，碰撞能量20～35 V。

2.3 供試品溶液制備 取本品約2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL80%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲(250 W、40 Hz)處理30 min，放冷，80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷、淫羊藿苷、漢黃芩素、漢黃芩苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯基葡萄糖苷、大黃素對照品適量，甲醇溶解，即得。

2.5 單味藥材溶液制備 稱取黃芩、淫羊藿、何首烏、女貞子、生地黃、茜草、黃精、人參適量，粉碎為粗粉，提取2次，第1次加10倍量水，第2次加8倍量水，每次1 h，合并提取液，濃縮，80 ℃干燥。稱取上述提取物適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，精密吸取2 mL至10 mL量瓶中，80%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.6 陰性樣品溶液制備 分別稱取缺黃芩、缺淫羊藿、缺何首烏、缺女貞子、缺生地黃、缺茜草、缺黃精、缺人參陰性樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，精密吸取2 mL至10 mL量瓶中，80%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度試驗(yàn) 取同一批本品(批號20170806)適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定7次，以黃芩苷為參照，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD在0～0.14%范圍內(nèi)，相對峰面積RSD在0～2.83%范圍內(nèi)，表明儀器精密度良好。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品(批號20170806)適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以黃芩苷為參照，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD在0～0.08%范圍內(nèi)，相對峰面積RSD在0～2.40%范圍內(nèi)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批本品(批號20170806)適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、3.5、7、10.5、14、19、24、30、36 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以黃芩苷為參照，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD在0～0.18%范圍內(nèi)，相對峰面積RSD在0～2.37%范圍內(nèi)，表明溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.4 耐用性試驗(yàn) 采用Dimak Diamonsil C18、TIANHE Kromasil C18、ELITE SinaChrom C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以黃芩苷為參照，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD在0～3.52%范圍內(nèi)，相對峰面積RSD在0～2.33%范圍內(nèi)，表明色譜柱耐用性良好。

2.8 HPLC指紋圖譜建立 參考文獻(xiàn)[2,12]報(bào)道，取10批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，將所得圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012.130723版)，設(shè)定S1樣品圖譜作為參照，采用平均數(shù)法，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1，經(jīng)過多點(diǎn)校正后自動匹配，共有36個(gè)共有峰，見圖1～2。

圖1 對照指紋圖譜

圖2 10批樣品HPLC指紋圖譜

再取供試品、對照品、單味藥材溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，通過保留時(shí)間和紫外吸收光譜數(shù)據(jù)對各共有峰進(jìn)行歸屬，在“2.2”項(xiàng)質(zhì)譜條件下對其進(jìn)行指認(rèn)。

3 結(jié)果

3.1 相似度評價(jià) 10批樣品相似度均大于0.99，表明各批之間成分一致，質(zhì)量穩(wěn)定。

3.2 共有峰歸屬及成分分析 圖3顯示，12號峰為2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯基葡萄糖苷(m/z405.120 8, M-H)，17號峰為黃芩苷(m/z455.091 3, M-H)，23號峰為漢黃芩苷(m/z459.104 9, M-H)，25號峰為黃芩素(m/z269.049 7, M-H)，26號峰淫羊藿苷(m/z721.231 4, M-H)，31號峰為漢黃芩素(m/z283.065 1, M-H)，33號峰為寶藿苷I(m/z513.181 5, M-H)，35號峰為大黃素(m/z269.049 7, M-H)。各單味藥材成分與顆粒成分基本對應(yīng)，其中黃芩、淫羊藿、何首烏、女貞子對共有峰的貢獻(xiàn)較大，地黃、人參、茜草、黃精貢獻(xiàn)較小，見圖4、表1。

圖3 各成分質(zhì)譜圖

圖4 供試品、單味藥材溶液HPLC色譜圖

4 討論

4.1 提取溶劑優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)比較了50%甲醇、80%甲醇、甲醇所制備供試品溶液的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)50%、80%甲醇對2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯基葡萄糖苷的提取較充分，而3種溶劑對其他成分的提取均無明顯差異。由于50%甲醇黏度大于80%甲醇，微孔濾膜過濾時(shí)耗費(fèi)時(shí)間較長，故最終確定80%甲醇作為提取溶劑。

4.2 流動相優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)曾采用乙腈-0.1%磷酸進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)相似的色譜峰較集中，分離度較差，故最終確定洗脫能力較弱的甲醇作為流動相，取得了較為滿意的分離度。

4.3 檢測波長優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測器對供試品溶液中各色譜峰的紫外吸收進(jìn)行全波長掃描，確定了每個(gè)指紋峰最大吸收波長，并采用不同時(shí)間改變最大吸收波長的方法進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)指紋圖譜中各指紋峰均能滿足分析要求。

表1 各共有峰歸屬

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了10批扶正固本顆粒的HPLC指紋圖譜，確定了36個(gè)共有峰，覆蓋了方中5味中藥主要特征成分，共有峰面積達(dá)90%以上，并對2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯基葡萄糖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、淫羊藿苷、漢黃芩素、寶藿苷I、大黃素進(jìn)行了指認(rèn)，能在整體上對該制劑質(zhì)量進(jìn)行控制，也為制定規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的相關(guān)質(zhì)量控制方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。