張亞莉， 劉 穎， 謝詩婷， 蘇薇薇， 姚宏亮， 彭 維*

(1.廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510260；2.中山大學(xué)廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510275；3.廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣西 南寧 530033)

生發(fā)片收載于《中藥成方制劑》第十七冊，由何首烏，女貞子，黑豆、黑棗、墨旱蓮等12味中藥組成，具有滋補(bǔ)肝腎，益氣養(yǎng)血，生發(fā)烏發(fā)的功效，用于肝腎不足、氣血虧虛所致的頭發(fā)早白、脫落；斑禿，全禿，脂溢性脫發(fā)。近年來對生發(fā)片生產(chǎn)工藝、質(zhì)量的研究較少，主要針對其中有效成分二苯乙烯苷和特女貞苷的含量[1]等。生發(fā)片處方中的君藥用的是何首烏，具有一定肝毒性及瀉下作用[2-6]，致肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是其所含的蒽醌類成分大黃素及其衍生物、大黃酸[7-8]；瀉下作用的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是結(jié)合蒽醌[9-10]。生發(fā)片服用療程較長，為2周或1個(gè)月，故應(yīng)建立蒽醌類成分檢測方法。黑豆對何首烏有減毒的作用[11-12]，生發(fā)片注冊工藝中何首烏與黑豆、黑棗分開煎煮，廠家嘗試何首烏與黑豆、黑棗合并煎煮，工藝流程見圖1。本研究建立影響生發(fā)片安全性的蒽醌類成分總大黃素和結(jié)合蒽醌的檢測方法，探討不同煎煮工藝對兩者的影響，并研究生產(chǎn)過程中其傳遞性規(guī)律，以期全面監(jiān)控和評價(jià)該制劑質(zhì)量和安全性。

圖1 生發(fā)片工藝流程

1 材料

DMF-8A中藥粉碎機(jī)(浙江溫嶺市銘大藥材機(jī)械設(shè)備有限公司)；MS205DU電子分析天平(十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Simplicity SIMS00000超純水器(美國Millipore公司)；UFLC超快速高效液相色譜儀(配置LC-20AD-XR二元泵、SIL-20AC-XR 自動(dòng)進(jìn)樣器、CYO-20AC柱溫箱、SPD-M20A PDA檢測器，日本島津公司)；Triple TOF 5600+四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、Sciex.Library數(shù)據(jù)庫(美國AB SCIEX公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(配置G1311B四元泵、G1316A柱溫箱、G1329B進(jìn)樣器、G1315D DAD檢測器)；Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀(配置DGP-3600SD雙三元泵、SRD-3600脫氣機(jī)、WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC3000-RS柱溫箱、DAD檢測器、Chromeleon7.2數(shù)據(jù)處理軟件，美國Dionex公司)。大黃素(批號110756-201512，純度98.7%)、大黃素甲醚(批號110758-201616，純度99.0%)對照品(中國食品藥品檢定研究院)。甲醇、三氯甲烷(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；鹽酸(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國霍尼韋爾公司)；磷酸(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。生發(fā)片共11批，工藝研究用何首烏飲片、中間體及成品3批，均來源于廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，具體見表1。

表1 生發(fā)片及其中間體信息

2 方法與結(jié)果

2.1 蒽醌類成分結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 供試品溶液制備 取本品適量，去糖衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入10 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲(功率300 W、頻率40 kHz)處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 色譜條件 Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～105 min，5%～60%A；105～110 min，60%～90%A；110～115 min：90%～5% A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.3 質(zhì)譜條件 ESI電噴霧離子源，電壓-4 500 V；噴霧氣3.8×105Pa；輔助加熱氣3.8×105Pa；離子源溫度550 ℃；氣簾氣2.4×105Pa；碰撞氣壓力6.8×104Pa；掃描范圍m/z100～2 000；負(fù)離子模式檢測。

2.1.4 結(jié)果分析 總離子流圖見圖2，通過碎片離子分析及文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道，共鑒定了7種蒽醌類成分，見表2。

圖2 生發(fā)片UFLC-Triple TOF-MS/MS總離子流圖

表2 蒽醌類成分鑒定結(jié)果

2.2 蒽醌類成分含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，甲醇制成分別含大黃素83.42 μg/mL、大黃素甲醚41.34 μg/mL的貯備液，各精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得(含大黃素8.342 μg/mL、大黃素甲醚4.134 μg/mL)。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品適量，去除糖衣，研細(xì)，混勻，取約5.0 g(濃縮液5.0 g、干膏粉2.5 g、制粒顆粒5.0 g、素片5.0 g)，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min取出，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液A(測定游離蒽醌用)。另取上述續(xù)濾液25 mL，置于具塞錐形瓶中，水浴蒸干，精密加入8%鹽酸20 mL，超聲(功率100 W、頻率40 Hz)處理5 min，加三氯甲烷20 mL，水浴加熱回流1 h，取出，立即冷卻，置于分液漏斗中，少量三氯甲烷洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，酸液再用三氯甲烷振搖提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液B(測定總蒽醌用)。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 按照處方工藝，制備缺何首烏的陰性樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.4 色譜條件 Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-乙腈(B)-0.1%磷酸(C)，梯度洗脫(0～20 min，8%A，42%～50%B；20～30 min，8%A，50%B；30～38 min，8%A，50%～64%B；38～52 min，8%A，64%～68%B；52～55 min，8%A，68%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm；供試品溶液A、陰性樣品溶液A進(jìn)樣量50 μL，對照品溶液、供試品溶液B、陰性樣品溶液B進(jìn)樣量10 μL。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.3.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖3～4。由此可知，蒽醌類成分分離度大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于3 000，溶劑和陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖3 游離蒽醌HPLC色譜圖

圖4 總蒽醌HPLC色譜圖

2.2.6 定量限 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下對照品溶液0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，在“2.3.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定5次，測得大黃素、大黃素甲醚定量限分別為0.834 2、0.413 4 μg/mL，噪音比均大于10。

2.2.7 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，在“2.3.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知蒽醌類成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.8 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液(批號1710062)，在“2.3.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得游離大黃素、大黃素甲醚、總大黃素、大黃素甲醚峰面積RSD分別為0.38%、1.69%、0.27%、0.49%，表明儀器精密度良好。

表3 蒽醌類成分線性關(guān)系

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品(批號1710062)適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得游離大黃素、大黃素甲醚、總大黃素、大黃素甲醚含量RSD分別為2.81%、2.70%、3.06%、2.51%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(批號1710062)適量，于0、2、4、8、12、24、48、72、120 h在“2.3.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得游離大黃素、大黃素甲醚、總大黃素、大黃素甲醚峰面積RSD分別為0.52%、0.92%、1.14%、1.41%，表明溶液在120 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取蒽醌類成分含量已知的同一批(批號1710062)片劑，除去糖衣片，研細(xì)，分別取粉末約5.0 g(測定游離蒽醌用)、2.5 g(測定總蒽醌用)，精密稱定，各平行9份，置于具塞錐形瓶中，按照2015年版《中國藥典》四部要求，使對照品加入量相當(dāng)于樣品量的50%、100%、150%，精密加入對照品溶液(含32.55 μg/mL大黃素、6.029 μg/mL大黃素甲醚，測定游離蒽醌用；含41.66 μg/mL大黃素、12.06 μg/mL大黃素甲醚，測定總蒽醌用)1、2、3 mL，各3份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，游離大黃素、游離大黃素甲醚加樣回收率分別為101.47%、100.98%，RSD分別為3.06%、3.72%；總大黃素、總大黃素甲醚加樣回收率分別為107.35%、104.38%，RSD分別為3.20%、5.71%。

2.3 樣品含量測定 取本品適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備2份供試品溶液，在“2.3.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 蒽醌類成分含量測定結(jié)果(n=2)

2.4 傳遞性研究 結(jié)果見表5。

表5 飲片-中間體-成品蒽醌類成分的傳遞性測定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 安全性成分和限量的確定 生發(fā)片中蒽醌成分為游離蒽醌(大黃素、大黃素甲醚)和以大黃素、大黃素甲醚為母核的結(jié)合蒽醌，故本研究以總大黃素作為生發(fā)片肝毒性指標(biāo)成分，結(jié)合型蒽醌(大黃素、大黃素甲醚)作為瀉下指標(biāo)成分。閔曉春等[15]曾以高劑量(12 mg/kg)大黃素灌胃給予大鼠連續(xù)2個(gè)月，發(fā)現(xiàn)無明顯肝損傷，推算生發(fā)片中大黃素含量不超過7.41 mg/片可避免產(chǎn)生肝損傷風(fēng)險(xiǎn)。趙榮華[16]發(fā)現(xiàn)，何首烏高溫清蒸后結(jié)合蒽醌含量在2.09 mg/g時(shí)(給藥劑量25 g/kg)小鼠無瀉下作用，推算生發(fā)片結(jié)合蒽醌含量小于66.99 mg/片時(shí)可避免發(fā)生腹瀉風(fēng)險(xiǎn)。11批生發(fā)片蒽醌類成分含量遠(yuǎn)在安全限量以下，說明按療程長期服用是安全的。

3.2 不同煎煮工藝分析 表5中生發(fā)片不同煎煮工藝飲片至濃縮液總大黃素、結(jié)合蒽醌轉(zhuǎn)移率P值分別為0.09、0.18，均表明原注冊煎煮工藝合理。

3.3 生產(chǎn)過程中蒽醌類成分傳遞規(guī)律分析 從表5轉(zhuǎn)移率結(jié)果來看，煎煮濃縮、干燥環(huán)節(jié)是影響生發(fā)片安全性的關(guān)鍵步驟，制粒、壓片到成品未受到高溫影響的生產(chǎn)環(huán)節(jié)的蒽醌類穩(wěn)定轉(zhuǎn)移。

4 結(jié)論

本研究對生發(fā)片中蒽醌類成分進(jìn)行了鑒定，同時(shí)建立了簡便準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)的HPLC法測定其含量，證明了該制劑的安全性和生產(chǎn)工藝的合理性，揭示了蒽醌類成分的傳遞規(guī)律，為修訂相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及控制其安全性、有效性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。