古軍霞， 孫會(huì)改， 李 陽(yáng)， 鄭玉光， 鄭 倩， 嚴(yán)玉平， 韓曉偉

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050200)

糖尿病是全世界最主要的慢性非傳染病之一，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。中醫(yī)認(rèn)為，糖尿病是“氣陰兩虛，氣虛血瘀”之癥[2]，基于多項(xiàng)臨床研究[3-4]、名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[5-6]及數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果顯示[7-8]，它主要分為肺胃陰虛熱盛、肝腎陰虛、氣陰兩虛、陰陽(yáng)兩虛等7類(lèi)，臨床治則清熱養(yǎng)陰、溫陽(yáng)補(bǔ)腎、祛濕化痰、益氣健脾、活血化瘀。北沙參為陰虛及氣陰兩虛型處方的核心藥物之一[9-10]，臨床上常用于治療肺熱燥咳、勞嗽痰血、胃陰不足、熱病傷津、咽干口渴等癥[11]，含聚炔類(lèi)、苯丙素類(lèi)、黃酮類(lèi)、甾體類(lèi)、萜類(lèi)、多糖類(lèi)等成分[12-14]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保肝等作用[15-19]，但關(guān)于它治療糖尿病的研究還較少。臨床報(bào)道，北沙參生脈散可以治療氣陰兩虛型的糖尿病，療效明顯[20]，但分子機(jī)理尚不清楚。

本研究以北沙參8種主要成分為基礎(chǔ)，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，探討干預(yù)糖尿病的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制，為相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 活性成分與中藥靶點(diǎn)的篩選 活性成分從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù) (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)獲取，以關(guān)鍵詞“北沙參”得到相關(guān)信息。以口服生物利用度(OB)、類(lèi)藥性(DL)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出同時(shí)滿足OB≥30%、DL≥0.18及對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2 糖尿病靶點(diǎn)篩選與預(yù)測(cè) 把“Diabetes Mellitus”關(guān)鍵詞輸入NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索糖尿病患者高通量數(shù)據(jù)，下載了以GPL22448 Phalanx Human lncRNA One Array v1_mRNA為平臺(tái)，來(lái)源包括糖尿病患者與正常人的基因芯片數(shù)據(jù)集GSE95849，得到糖尿病的差異表達(dá)基因。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，限定物種為人, 進(jìn)行蛋白互作分析，選取0.7的高置信度并保存結(jié)果，從而確保數(shù)據(jù)的可靠性。利用Cytoscape軟件將導(dǎo)出文件中的node1、node2和combined score信息導(dǎo)入并繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)(node)大小表示度值(Degree)的大小，邊(edge)的粗細(xì)表示combined score的大小。

1.4 生物過(guò)程與通路分析 運(yùn)用cluster Profiler對(duì)與糖尿病相關(guān)的“活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的蛋白分別進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG信號(hào)通路分析，從而獲得顯著富集的基因功能和信號(hào)通路。

1.5 成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在Excel表中將58種成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和通路分析構(gòu)建“藥材-藥效成分”“藥效成分-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-通路”“通路-疾病”之間的相互關(guān)系,以藥材、藥效成分、靶點(diǎn)蛋白、通路和疾病為5類(lèi)節(jié)點(diǎn),它們之間有相互關(guān)系的分別用邊相連, 采用Cytoscape 3.6.1軟件的關(guān)聯(lián) (Merge) 功能構(gòu)建北沙參-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)模型。

1.6 分子對(duì)接 采用Systems Dock Web Site(http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index)對(duì)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的4個(gè)靶點(diǎn)與北沙參主要藥效成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。以二甲雙胍(Metformin)為對(duì)照，整理對(duì)接結(jié)果中的docking score并分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分 活性成分共8種，見(jiàn)表1。

表1 北沙參中活性成分

2.2 作用靶點(diǎn)篩選(差異基因) 從GEO下載并導(dǎo)出平臺(tái)文件和矩陣文件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋?zhuān)瑢⑻结樏Q(chēng)轉(zhuǎn)換為基因名稱(chēng)，并且將正常組和實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，原始數(shù)據(jù)以P<0.05為條件進(jìn)行過(guò)濾后，選取糖尿病組織/正常組織上、下調(diào)差異倍數(shù)>1.51作為選取條件，共得到5 817個(gè)疾病靶點(diǎn)及熱圖(圖1)、火山圖(圖2)。取北沙參活性成分作用靶點(diǎn)和糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)的交集，共獲得58個(gè)靶點(diǎn)。

圖1 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)差異熱圖

圖2 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)差異火山圖

圖3 活性成分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) “藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖3，有61個(gè)節(jié)點(diǎn)、81條邊，紅色三角表示靶點(diǎn)基因(共58個(gè))，玫紅橢圓表示北沙參中的8種活性成分，藍(lán)色菱形為北沙參3種主要成分[甾醇類(lèi)(Sterol)、香豆素類(lèi)(Coumarin)和酚酸類(lèi)(Phenolic Acids)]；度值最高的活性成分為槲皮素(Quercetin)，其次為豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇(beta-Sitosterol)。

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.4.1 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 北沙參可與3 320個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生直接或間接作用，不同靶點(diǎn)之間聯(lián)系達(dá)82 802種。

2.4.2 關(guān)鍵靶點(diǎn) 采用Bisogenet插件，以Degree>81、Betweenness≥400為條件，對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)56個(gè)，見(jiàn)表2，篩選策略見(jiàn)圖4。

2.5 GO、KEGG富集分析 GO富集分析見(jiàn)圖5，分子功能集中在RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(DNA-binding transcription factor binding)、核激素受體結(jié)合(nuclear hormone receptor binding)等，生物過(guò)程集中在響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)水平(response to nutrient levels)、響應(yīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)(response to oxidative stress)、響應(yīng)抗生素(response to antibiotic)、細(xì)胞響應(yīng)化學(xué)脅迫(cellular response to chemical stress)、細(xì)胞響應(yīng)細(xì)菌源的分子(cellular response to molecule of bacterial origin)，細(xì)胞組成集中在膜區(qū)域(membrane region)、膜筏板(membrane raft)和膜微區(qū)(membrane microdomain)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體(transcription regulator complex)和內(nèi)腔囊泡(vesicle lumen)。

KEGG富集分析見(jiàn)圖6，58個(gè)潛在靶點(diǎn)基因所涉及到的通路共有168條，前10條分別為內(nèi)分泌抵抗(Endocrine resistance)、NF-kappa B信號(hào)通路(NF-kappa B signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)、細(xì)胞衰老(Cellular senescence)、Ras信號(hào)通路(Ras signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、FoxO信號(hào)通路(FoxO signaling pathway)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、P53信號(hào)通路(P53 signaling pathway)。

表2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖4 核心靶點(diǎn)篩選策略示意圖

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG富集分析

2.6 KEGG網(wǎng)絡(luò) 網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖7，藍(lán)色代表通路，紅色代表靶點(diǎn)，可知北沙參作用于金屬基質(zhì)蛋白MMP-9、血管細(xì)胞黏附分子VCAM1、B型單胺氧化酶MAOB、絲裂原活化蛋白MAPK、血清高遷移率族蛋白IL1B、緊密連接蛋白CLDN4等多個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)NF-kappa B信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、P53信號(hào)通路等進(jìn)行協(xié)同調(diào)控來(lái)干預(yù)糖尿病。另外，節(jié)點(diǎn)面積越大，干預(yù)影響越大。

圖7 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.7 活性成分與糖尿病關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接 在KEGG信號(hào)通路中選取4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)作為靶點(diǎn)蛋白，分別是MAPK1、IL1B、NCOA2和PTGS1，代號(hào)(PDB ID)分別為4DEP、4IZ5、4p6x和1cqe，與主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，見(jiàn)圖8，與靶點(diǎn)蛋白的氫鍵結(jié)合力見(jiàn)表3。

槲皮素通過(guò)殘基ASP-337、THR-181、ALA-26和TYR-62與MAPK1蛋白質(zhì)分子對(duì)接，VAL-233與IL1B蛋白質(zhì)分子對(duì)接，ARG-558、GLY-547、GLU-748與NCOA2蛋白質(zhì)分子對(duì)接，GLY-66、CYS-57和CYS-59與PTGS1蛋白質(zhì)分子對(duì)接。豆甾醇與MAPK1之間無(wú)氫鍵，沒(méi)有分子對(duì)接，通過(guò)殘基NAG-403與IL1B蛋白質(zhì)分子對(duì)接，VAL-538與NCOA2蛋白質(zhì)分子對(duì)接，LYS-253、GLU-268與PTGS1蛋白質(zhì)分子對(duì)接。β-谷甾醇與MAPK1之間無(wú)氫鍵，沒(méi)有分子對(duì)接，通過(guò)殘基ASN-229與IL1B蛋白質(zhì)分子對(duì)接，ARG-558與NCOA2蛋白質(zhì)分子對(duì)接，LEU-494與PTGS1蛋白質(zhì)分子對(duì)接。前胡內(nèi)酯通過(guò)殘基NAG-403和SER-213與IL1B蛋白質(zhì)分子對(duì)接，LYS-151、ADP-900、GLU-33與MAPK1蛋白質(zhì)分子對(duì)接，ARG-614、GLU-537與NCOA2蛋白質(zhì)分子對(duì)接，GLY-214與PTGS1蛋白質(zhì)分子對(duì)接。別異歐前胡內(nèi)酯通過(guò)殘基TYR-310、AGR-308、ALA-325與IL1B蛋白質(zhì)分子對(duì)接，ASP-30、GLU-12與MAPK1蛋白質(zhì)分子對(duì)接，LYS-743、GLU-748與NCOA2蛋白質(zhì)分子對(duì)接，ASP-497、ILE-498、GLN-479與PTGS1蛋白質(zhì)分子對(duì)接。佛手素通過(guò)殘基NAG-403與IL1B蛋白質(zhì)分子對(duì)接，THR-190與MAPK1蛋白質(zhì)分子對(duì)接，ASP-549、ARG-558與NCOA2蛋白質(zhì)分子對(duì)接，HIS-442、ARG-179與PTGS1蛋白質(zhì)分子對(duì)接。異歐前胡素通過(guò)殘基ILE225與IL1B蛋白質(zhì)分子對(duì)接，ARG-67、TYR-187、JYR-30與MAPK1蛋白質(zhì)分子對(duì)接，GLY-547和ARG-558與NCOA2蛋白質(zhì)分子對(duì)接，GLU-347與PTGS1蛋白質(zhì)分子對(duì)接。異珊瑚菜素通過(guò)殘基GLU-217、VAL-233與IL1B蛋白質(zhì)分子對(duì)接，LYS-117與MAPK1蛋白質(zhì)分子對(duì)接，GLY-547、ARG-558、ASP-549與NCOA2蛋白質(zhì)分子對(duì)接，PRO-514、SER-516、HIS-90與PTGS1蛋白質(zhì)分子對(duì)接。

圖8 活性成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接模型

表3 活性成分與靶點(diǎn)蛋白的氫鍵結(jié)合力

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，北沙參8種活性成分有5 817個(gè)疾病靶點(diǎn)，其中58個(gè)與糖尿病的治療相關(guān)；可與3 320個(gè)疾病靶點(diǎn)產(chǎn)生直接或間接作用，不同靶點(diǎn)之間的相互聯(lián)系達(dá)82 802種，體現(xiàn)了其多成分、多靶點(diǎn)干預(yù)糖尿病的特點(diǎn)。

北沙參發(fā)揮治療糖尿病作用的成分可能為香豆素類(lèi)、酚酸類(lèi)和甾醇類(lèi)。研究表明，香豆素類(lèi)對(duì)小鼠2型糖尿病具有一定干預(yù)作用，對(duì)2型糖尿病相關(guān)的生化指標(biāo)和組織病理具有一定的改善作用，其機(jī)制可能通過(guò)激活A(yù)kt或AMPK磷酸化下游底物，促進(jìn)GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[21]；酚酸類(lèi)雖然不能直接降低血糖，但能夠顯著改善大鼠血管黏稠度，改善血脂代謝，從而降低糖尿病腎病的發(fā)病概率[22]；甾醇類(lèi)化合物可通過(guò)減弱自由基誘導(dǎo)的糖毒素來(lái)改善高血糖狀態(tài)，從而改善胰島素功能[23]。

PPI蛋白互作篩選出56個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，度值最高的是MAPK、IL1B、PTGS1、NCOA2。MAPK可通過(guò)激活外源胰島素從而調(diào)節(jié)胰島素水平來(lái)治療妊娠期糖尿病[24]；IL1B能刺激胰島素分泌、增強(qiáng)胰島素的活性和促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿，從而達(dá)到降低血糖的作用[25]；NCOA2在脂肪代謝和糖代謝平衡方面有重要的作用，其多態(tài)性與2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)[26]；PTGS1與炎癥相關(guān)，糖尿病患者機(jī)體處于低度炎癥狀態(tài)，其程度與血糖高低呈正相關(guān)[27-28]，四者能與北沙參活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，是其治療糖尿病的核心靶點(diǎn)。

KEGG富集表明，上述靶點(diǎn)主要集中在NF-kappa B信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、P53信號(hào)通路等168條信號(hào)通路。在糖尿病的治療過(guò)程中，MAPK信號(hào)通路是與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路；HIF-1是缺氧誘導(dǎo)因子，也是參與細(xì)胞應(yīng)答缺氧基因的關(guān)鍵因子[29]，通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、控制糖酵解、促進(jìn)糖異生從而影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)[30]；脂肪酸、炎性因子和活性氧及相關(guān)靶蛋白可激活P53繼而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能紊亂甚至凋亡[31]，還可通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路等多條途徑來(lái)干預(yù)胰島素抵抗[32]。由此可見(jiàn)，北沙參中的多種成分通過(guò)作用于多個(gè)靶點(diǎn)、調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路來(lái)改善糖尿病及其并發(fā)癥。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步闡述了北沙參干預(yù)糖尿病的潛在活性成分、作用靶點(diǎn)、發(fā)揮藥效的關(guān)鍵生物學(xué)通路，從分子水平揭示了可能機(jī)制。但上述結(jié)果只是預(yù)測(cè)，還需要通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步驗(yàn)證。