陽辛鳳， 龐朝海， 田 海， 郭曉杰， 王 盼

[1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心, 海南 海口 571101；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱作產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(?？?, 海南 海口 571101；3.海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南 ?？?571101；5.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院, 海南 ?？?570208]

芒果苷是漆樹科植物芒果樹葉片、百合科植物知母根莖、龍膽科植物藏茵陳等中藥材的主要活性成分，具有鎮(zhèn)咳、殺菌、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂等藥理活性[1-4]。芒果苷為2015年版《中國藥典》規(guī)定的知母等中藥材鑒別和質(zhì)量控制的重要檢測指標(biāo)[5]，因此，準(zhǔn)確測定芒果苷含量對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制有重要意義。然而目前尚無芒果苷標(biāo)準(zhǔn)樣品，與芒果苷檢測相關(guān)的研究都是基于芒果苷對(duì)照品而開展的。國內(nèi)外公司出售的芒果苷對(duì)照品，均未按照國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性和定值試驗(yàn)，純度沒有進(jìn)行不確定度評(píng)價(jià)，不具有溯源性，難以作為標(biāo)準(zhǔn)樣品使用。

定值與不確定度評(píng)價(jià)是標(biāo)準(zhǔn)樣品制備的重要環(huán)節(jié)，質(zhì)量平衡法可直接溯源到國際單位制(SI)中的質(zhì)量(kg)，是一種潛在的基準(zhǔn)方法[6]，也是GB/T 15000.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則中推薦的方法[7]，它主要由主成分測定及雜質(zhì)測定兩部分構(gòu)成，主成分測定常用方法是液相色譜法或氣相色譜法，以面積歸一化法計(jì)算主成分純度；雜質(zhì)則主要是指水分、灰分和揮發(fā)性成分，其操作簡單、可重復(fù)性好，在標(biāo)準(zhǔn)樣品定值中應(yīng)用廣泛。天然產(chǎn)物類標(biāo)準(zhǔn)樣品在農(nóng)產(chǎn)品、食品、中草藥等領(lǐng)域需求很大，近年來天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制以及對(duì)其特性量值的檢驗(yàn)、定值及不確定度評(píng)價(jià)得到了廣泛關(guān)注，有證標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)量逐漸增多。王尉等報(bào)道了表沒食子兒茶素沒食子酸酯、異補(bǔ)骨脂素、橙皮素、辛弗林、天麻素、黃芩素、芝麻素和水蘇糖等天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制，并采用質(zhì)量平衡法法對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了定值[8-15]。

為了滿足以芒果苷為活性成分的農(nóng)產(chǎn)品及相關(guān)產(chǎn)品的分析檢測、質(zhì)量控制工作的需求，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性，急需制備芒果苷標(biāo)準(zhǔn)樣品。本文參照GB/T 15000.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則，對(duì)研制的芒果苷標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行均勻性與穩(wěn)定性檢驗(yàn)，以及采用質(zhì)量平衡法進(jìn)行定值和對(duì)不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試劑 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)樣品為自制，步驟為將新鮮芒果葉片切碎、粉碎后提取，分離純化，重結(jié)晶，即得到淡黃色針狀結(jié)晶，70%甲醇超聲溶解及定容，制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的供試品溶液。乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，美國賽默飛公司)；水為Milli-Q系統(tǒng)超純水(美國Millipore公司)。

1.2 儀器 Waters 1525高效液相色譜儀，配置紫外檢測器(美國Waters公司)；Triple TOF 5600+超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；Agilent 7890A氣相色譜儀，配置FID檢測器與頂空裝置[安捷倫科技(中國)有限公司]；SKF-1自動(dòng)卡爾費(fèi)休水分測定儀(瑞士Mettler-Toledo公司)；BT25S型電子分析天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司)；JP-180ST超聲波清洗機(jī)(900 W，40 kHz，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)。

1.3 純度分析 采用HPLC法，條件為Waters Xbridge BEH C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)(85∶15)；體積流量1 mL/min；波長258 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 結(jié)構(gòu)分析 條件為電噴霧離子化源(ESI)，負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～900；噴霧電壓-4 500 V；霧化氣溫度550 ℃；氣簾氣40 L/min；霧化氣、輔助氣體積流量55 L/min；去簇電壓-100 V。采用TOF-MS-IDA-MS/MS方法采集數(shù)據(jù)，一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描離子累積時(shí)間分別為200、100 ms；碰撞能量-35 eV；碰撞能量疊加(CES)(-35±15)eV；觸發(fā)二級(jí)的方法為IDA，多重質(zhì)量虧損(MMDF)和動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)為觸發(fā)二級(jí)的條件，滿足該條件的優(yōu)先進(jìn)行二級(jí)掃描。

1.5 均勻性檢驗(yàn) 均勻性檢驗(yàn)包括瓶間、瓶內(nèi)均勻性檢驗(yàn)，其中瓶間均勻性檢驗(yàn)方法為隨機(jī)抽取分裝好的標(biāo)準(zhǔn)樣品15瓶，采用3種抽樣程序，第1組標(biāo)準(zhǔn)樣品瓶序號(hào)為5-60-23-51-19-2-72-33-80-69-26-93-43-85-17，第2組標(biāo)準(zhǔn)樣品瓶序號(hào)為17-85-43-93-26-69-80-33-72-2-19-51-23-60-5，第3組標(biāo)準(zhǔn)樣品瓶序號(hào)為5-23-19-72-80-26-43-17-60-51-2-33-69-93-85；瓶內(nèi)均勻性檢驗(yàn)方法為隨機(jī)抽取分裝好的標(biāo)準(zhǔn)樣品1瓶，重復(fù)測定10次。采用峰面積歸一化法計(jì)算純度，再根據(jù)GB/T 15000-2008工作導(dǎo)則要求，通過方差分析處理均勻性測量數(shù)據(jù)，并進(jìn)行均勻性評(píng)估。

1.6 穩(wěn)定性檢驗(yàn) 穩(wěn)定性檢驗(yàn)包括短期、長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)，其中短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)是將9組標(biāo)準(zhǔn)樣品(每組3瓶)保存在恒溫(40±1)℃烘箱中，第1～7天各取出3瓶，第10、15天各取出3瓶，放于4 ℃下，共15 d，每瓶取3個(gè)子樣，配制成溶液，按“1.3”項(xiàng)下方法分析，檢測在規(guī)定條件下純度隨時(shí)間的變化；長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)是將16組標(biāo)準(zhǔn)樣品(每組6瓶)在4 ℃下保存19個(gè)月，第1～13個(gè)月各取出6瓶，第15、17、19個(gè)月各取出6瓶，按“1.3”項(xiàng)下方法分析。采用峰面積歸一化法計(jì)算純度，再根據(jù)GB/T 15000-2008工作導(dǎo)則要求，通過方差分析處理穩(wěn)定性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估。

1.7 雜質(zhì)分析

1.7.1 水分 采用卡爾費(fèi)休庫倫滴定法[16]測定。

1.7.2 灰分 參照《有機(jī)化工產(chǎn)品灼燒殘?jiān)臏y定》(GB/T 7531-2008)，采用灼燒法[17]，在650 ℃下灼燒至恒重，電子分析天平稱定質(zhì)量。

1.7.3 有機(jī)溶劑殘留 采用靜態(tài)頂空進(jìn)樣-氣相色譜-氫火焰離子化檢測器法(HS-GC-FID)。條件為DB-624色譜柱(30 m×0.25 mm，1.4 μm)；初始溫度45 ℃，恒溫5 min，以7 ℃/min升至60 ℃，15 ℃/min升至80 ℃，50 ℃/min升至235 ℃，恒定0.5 min；體積流量1.0 mL/min；分流比5∶1；進(jìn)樣量1 mL；進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測器溫度260 ℃。取0.100 0 g標(biāo)準(zhǔn)樣品，加DMSO至2 mL，90 ℃頂空30 min，取1 mL頂空氣體進(jìn)行GC測定。

1.8 定值 采用實(shí)驗(yàn)室協(xié)作試驗(yàn)定值法，參加的實(shí)驗(yàn)室數(shù)目為8家，隨機(jī)抽取24瓶標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室送3瓶，每瓶平行測定2次。定值實(shí)驗(yàn)室將標(biāo)準(zhǔn)樣品制成100 μg/mL溶液，采用峰面積歸一化法計(jì)算純度，將所得數(shù)據(jù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室規(guī)定和測定方法進(jìn)行匯總，從技術(shù)上剔除查明原因的可疑值后，通過格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)法從統(tǒng)計(jì)上剔除可疑值。

GB/T 15000-2008規(guī)定，定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度組成，標(biāo)準(zhǔn)樣品特性標(biāo)準(zhǔn)值的測量不確定度uCRM由標(biāo)準(zhǔn)值定值試驗(yàn)的不確定度、均勻性檢驗(yàn)的不確定度ubb和穩(wěn)定性檢驗(yàn)的不確定度ults、水分測量引入的不確定度umoisture、灰分測量引入的不確定度uash、溶劑殘留測量引入的不確定度usolvent組成。根據(jù)上述測定結(jié)果，計(jì)算芒果苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的純度標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度。

2 結(jié)果

2.1 純度分析 圖1顯示，主成分色譜峰只有1個(gè)，保留時(shí)間5.757 min，響應(yīng)值高，并且僅在7.599 min處有1個(gè)響應(yīng)微弱的雜質(zhì)峰，純度高于99.5%。

1.芒果苷?qǐng)D1 芒果苷色譜圖

2.2 結(jié)構(gòu)確證 芒果苷為雙苯吡酮類黃酮類化合物，在負(fù)離子模式下容易解離，因此離子源選擇ESI-，通過針泵進(jìn)樣方式獲得一級(jí)(TOF-MS)、二級(jí)(TOF-MS/MS)質(zhì)譜圖，見圖2。由此可知，在芒果苷一級(jí)質(zhì)譜中,其[M-H]-峰為m/z421.079 8，響應(yīng)最強(qiáng)，為芒果苷脫氫后的母離子，與芒果苷分子(422.084 9)脫氫產(chǎn)物的m/z理論值基本一致；二級(jí)質(zhì)譜的主要碎片峰有m/z301.038 3、331.052 6、271.026 9、259.028 8，均有很強(qiáng)的響應(yīng)值，為芒果苷結(jié)構(gòu)斷裂產(chǎn)物。以上結(jié)果與理論預(yù)測及文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道一致，因此所檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品為芒果苷。

圖2 芒果苷高分辨質(zhì)譜圖

2.3 均勻性檢驗(yàn)

2.3.1 瓶間均勻性 結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 瓶間均勻性檢驗(yàn)結(jié)果(n=3)

表2 瓶間均勻性方差分析

2.3.2 瓶內(nèi)均勻性 結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 瓶內(nèi)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果(n=3)

表4 瓶內(nèi)均勻性方差分析

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.1 長期穩(wěn)定性 將標(biāo)準(zhǔn)樣品在4 ℃下進(jìn)行19個(gè)月試驗(yàn)，采用優(yōu)化HPLC法測定標(biāo)準(zhǔn)樣品純度作為特性量參數(shù)，測得其范圍為99.45%～99.97%。再根據(jù)GB/T 15000-2008工作導(dǎo)則要求，采用方差分析計(jì)算穩(wěn)定性監(jiān)測數(shù)據(jù)，并進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估。

圖3 芒果苷長期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1.2 回歸分析法 以時(shí)間為自變量，純度為因變量，采用回歸分析對(duì)長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果，P=0.082，表示回歸不顯著(對(duì)于95%置信水平而言，P<0.05為顯著)，即未發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)樣品長期穩(wěn)定性穩(wěn)定性良好。

2.4.2 短期穩(wěn)定性 在夏季長途運(yùn)輸時(shí)標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)，可能會(huì)達(dá)到40 ℃的高溫，故本實(shí)驗(yàn)考察芒果苷在40 ℃、15 d內(nèi)的短期穩(wěn)定性，測得其純度范圍為99.81%～99.84%。再根據(jù)GB/T 15000-2008工作導(dǎo)則要求，采用方差分析計(jì)算穩(wěn)定性監(jiān)測數(shù)據(jù)，并進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估。

圖4 芒果苷短期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

直線上各點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差s2=0.000 250 0，取其平方根s=0.015 81，與斜率相關(guān)的不確定度為s(b1)=0.001 165，自由度n-2=1、P=0.95的t因子為12.706，t0.95，n-2×s(b1)=0.014 81，由于|b1|

2.4.2.2 回歸分析法 以時(shí)間為自變量，純度為因變量，采用回歸分析對(duì)短期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果，P=0.22，表示回歸不顯著，即未發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)樣品短期穩(wěn)定性良好。

2.5 雜質(zhì)分析

2.5.1 水分 采用自動(dòng)卡爾費(fèi)休庫倫滴定法測定3次，結(jié)果分別為0.17%、0.15%、0.19%，再進(jìn)行Grubbs檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在0.05水平、檢測次數(shù)3次時(shí)，G95(3)=1.153，水分測量值均為Gi

2.5.2 灰分 3次測定結(jié)果分別為0.174%、0.165%、0.139%，再進(jìn)行Grubbs檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在0.05水平、檢測次數(shù)5次時(shí)，Gi

2.5.3 有機(jī)溶劑殘留值 芒果苷提取分離與重結(jié)晶過程僅使用了甲醇、石油醚、乙酸乙酯，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)三者殘留值進(jìn)行檢測，結(jié)果見表5，再進(jìn)行Grubbs檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在0.05水平、檢測次數(shù)5次時(shí)，G95(5)=1.672，Gi

表5 有機(jī)溶劑殘留測定結(jié)果

2.6 定值分析 對(duì)8家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)采用格拉布斯檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，測得G95(48)(Xij)均小于G95(48)(2.94)，未發(fā)現(xiàn)異常值，呈正態(tài)分布，符合GB/T 15000-2008工作導(dǎo)則要求，同法對(duì)每家實(shí)驗(yàn)室的平均值進(jìn)行檢驗(yàn)，將其看成1組測定值進(jìn)行異常值檢驗(yàn)，也未發(fā)現(xiàn)異常值，故將上述數(shù)據(jù)視為無偏估計(jì)值，計(jì)算其平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表6，方差分析見表7。

表6 定值測定結(jié)果(n=6)

表7 定值方差分析

取包含因子k=2，則標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)展不確定度uCRM(擴(kuò)展)=2×uCRM(合成)=0.20%，純度定值為99.82%，雜質(zhì)包括水分0.17%、灰分0.159%、有機(jī)溶劑殘留0.026%，總計(jì)0.35%，扣除雜質(zhì)后，標(biāo)準(zhǔn)值為(100%-0.35%)×99.82%=99.47%。綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)樣的特性值為99.47%，擴(kuò)展不確定度為0.20%(P=0.95，k=2)。

3 結(jié)論

本研究制備的芒果苷標(biāo)準(zhǔn)樣品瓶間與瓶內(nèi)均勻性良好，在40、4 ℃下的短期和長期穩(wěn)定性分別不少于15 d、19個(gè)月，標(biāo)準(zhǔn)樣品的純度標(biāo)準(zhǔn)值為99.47%，擴(kuò)展不確定度為0.20%。所制備的芒果苷標(biāo)準(zhǔn)樣品滿足GB/T 15000-2008工作導(dǎo)則要求，可用于芒果苷檢測方法校正，以及芒果樹葉、知母等中藥材、提取物與藥品等相關(guān)產(chǎn)品的檢測和質(zhì)量控制。