夏婷婷，邵小光，魏晗，劉艷，李丹，印向，王磊

(大連市婦女兒童醫(yī)療中心(集團(tuán))，大連市生殖生命與母子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116000)

反復(fù)種植失敗(repeated/recurrent implantation failure，RIF)目前是輔助生殖診療中的一大棘手問題，其定義尚不統(tǒng)一，現(xiàn)臨床中常用的定義為：年齡<40歲，移植達(dá)3次及以上或移植4～6個(gè)高評分卵裂期胚胎或3個(gè)及以上高評分囊胚均失敗[1]。在輔助生殖技術(shù)助孕的案例中，RIF的發(fā)生率約為5%～10%[2]。當(dāng)排除子宮因素、配子及胚胎異常、以及免疫、內(nèi)分泌功能、移植技術(shù)及心理因素等原因之外的反復(fù)種植失敗，定義為不明原因反復(fù)種植失敗(unexplained recurrent implantation failure，URIF)[3-4]。對于該類患者，目前尚無確切治療或者改善策略，臨床醫(yī)生僅能進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性治療，比如提高胚胎質(zhì)量或者改善子宮內(nèi)膜容受性等，并無可靠證據(jù)顯示以上措施有效。URIF的治療是目前一大難題。

有研究表明，URIF可能與子宮內(nèi)膜容受性異常相關(guān)[5]。子宮內(nèi)膜容受性的評估方式主要包括形態(tài)學(xué)標(biāo)志、分子生物學(xué)標(biāo)志、基因及相關(guān)蛋白、類固醇激素及其受體及超聲下子宮內(nèi)膜容受性的評估。腔內(nèi)三維能量多普勒超聲成像(three dimensionalpower Dopple angiography，3D-PDA)是近幾年廣為應(yīng)用發(fā)展的一項(xiàng)技術(shù)，其將多普勒和血流能量顯相技術(shù)相結(jié)合，對較低速血流靈敏度極高，對子宮內(nèi)膜終末血流信號監(jiān)測較為敏感，并可以對內(nèi)膜的血管新生和血流灌注情況進(jìn)行量化，對于子宮內(nèi)膜容受性的評估具有方便、無創(chuàng)、可重復(fù)及依從性好等優(yōu)點(diǎn)[6]。

粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)近年來開始用于輔助生殖領(lǐng)域，因?yàn)樽訉m內(nèi)膜存在G-CSF受體，故應(yīng)用G-CSF宮腔灌注后可能改善子宮內(nèi)膜容受性，目前主要用于薄性子宮內(nèi)膜患者，也有用于RIF的研究[7-8]。對于URIF患者，G-CSF能否改善妊娠結(jié)局結(jié)論并不一致，有Meta分析支持G-CSF對URIF患者的著床率和臨床妊娠率有積極作用，而對流產(chǎn)率的影響尚無確鑿證據(jù)[9]，尚需更多的隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)來證明G-CSF的有效性。本研究選擇G-CSF用于URIF患者人群，在目前尚無有效治療手段的情況下評估其臨床應(yīng)用效果。對于子宮內(nèi)膜容受性的判斷，采用能更客觀、更準(zhǔn)確反應(yīng)子宮內(nèi)膜局部微循環(huán)狀況的三維彩超方式進(jìn)行評估。通過三維彩超評估子宮內(nèi)膜血流參數(shù)能更好的評估子宮內(nèi)膜容受性，并有利于探索G-CSF宮腔灌注治療的作用機(jī)制。

資料與方法

一、研究對象

本研究采用了前瞻性雙盲隨機(jī)對照(包括自身對照)的研究方法，隨機(jī)選取2019年1月至2020年9月期間就診于大連市婦女兒童醫(yī)療中心(集團(tuán))的擬行人工周期-凍融胚胎移植(HRT-FET)的URIF患者120 例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合RIF診斷標(biāo)準(zhǔn)(年齡<40歲，移植3次及以上或移植4～6個(gè)高評分卵裂期胚胎或3個(gè)及以上高評分囊胚均失敗)；已有卵裂期冷凍胚胎，計(jì)劃HRT-FET。

排除標(biāo)準(zhǔn)：RIF病因篩查后可能存在子宮因素、配子及胚胎異常、以及免疫、內(nèi)分泌功能、移植技術(shù)及心理因素等原因；對G-CSF有過敏史患者；經(jīng)充分知情同意后拒絕參與該項(xiàng)研究者。

共納入120例符合標(biāo)準(zhǔn)的患者，由研究者中指定人員進(jìn)行隨機(jī)(數(shù)字表法)和雙盲處理，通過區(qū)組隨機(jī)法平均分為試驗(yàn)組和對照組，每組60例。

本研究經(jīng)過我院倫理委員會討論通過，所有患者充分知情同意簽署知情同意書。

二、研究方法

1.HRT周期準(zhǔn)備內(nèi)膜：月經(jīng)第3天開始17β雌二醇(雌二醇2 mg/片；芬嗎通，雅培，荷蘭)4～6 mg/d，口服，根據(jù)內(nèi)膜厚度調(diào)整雌激素用量；雌激素用藥第14天在原用藥基礎(chǔ)上加用孕激素轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，黃體酮注射液(20 mg/支；廣州白云山明興制藥)40 mg肌肉注射，地屈孕酮片(達(dá)芙通，雅培，荷蘭)20 mg/d，口服。

2.G-CSF宮腔灌注：雌激素用藥第9天及第12天行宮腔灌注。試驗(yàn)組灌注G-CSF(吉賽欣，華北制藥金坦生物技術(shù))300 μg/1.2 ml，對照組灌注1.2 ml生理鹽水?；颊呷“螂捉厥?，碘伏棉球常規(guī)消毒外陰，戴無菌手套，內(nèi)診了解子宮位置及傾、曲角度，更換無菌手套，鋪無菌洞巾，置入窺器充分暴露宮頸，用鹽水紗球清洗陰道及宮頸3次，無菌棉簽清理宮頸外口粘液，輕柔將人工授精管放入至宮腔中上部(術(shù)前已超聲評估宮腔深度)，拔出管芯，連接裝有灌注液的2 ml注射器，緩慢將灌注液勻速推入宮腔，緩慢撤出人工授精管。囑患者平臥20～30 min后可下地自由活動。

為避免臨床操作中的技術(shù)誤差，所有患者的宮腔灌注均由同一有經(jīng)驗(yàn)醫(yī)師操作。

3.胚胎移植：內(nèi)膜轉(zhuǎn)化第3日解凍1～2枚卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎(6～8細(xì)胞，碎片1～2級)，次日行腹式超聲引導(dǎo)下胚胎移植。所有患者的胚胎移植均由同一高年資醫(yī)生操作。

4.子宮內(nèi)膜容積及子宮內(nèi)膜血流參數(shù)測量：孕激素轉(zhuǎn)化日及孕激素用藥后第3天進(jìn)行三維彩超內(nèi)膜參數(shù)測定?；颊吲趴瞻螂缀髾z查，采用GE Voluson E8三維超聲系統(tǒng)(GE Healthcare，奧地利)及RIC5-9-D陰道探頭(GE Healthcare，奧地利)采集3D-PDA圖像。掃描參數(shù)預(yù)設(shè)：0.5～0.9 KHz，濾波檔low，能量多普勒增益5。利用此參數(shù)對子宮內(nèi)膜進(jìn)行120°慢掃，當(dāng)顯示最完整的子宮內(nèi)膜線時(shí)，按“FREEZE”鍵開始掃描，應(yīng)用多平面成像模型描記感興趣區(qū)域中子宮內(nèi)膜軌跡，軟件處理數(shù)據(jù)，選取虛擬器官計(jì)算機(jī)輔助分析(virtual organ computer-ai-ded analysis，VOCAL)功能，啟動手動描記模式畫出內(nèi)膜界限，按照30°旋轉(zhuǎn)切面，由軟件自動生成內(nèi)膜三維圖像，利用Histogram功能自動計(jì)算子宮內(nèi)膜容積、內(nèi)膜厚度、血流阻力指數(shù)(RI)、血管化指數(shù)(VI)、血流指數(shù)(FI)和血管化血流指數(shù)(VFI)等參數(shù)。每個(gè)研究對象連續(xù)取樣3次，以其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

參照Conen標(biāo)準(zhǔn)，將子宮內(nèi)膜分為A型(內(nèi)膜呈三線型)、B型(為過渡型)、C型(為均質(zhì)強(qiáng)回聲型，超聲下未見明顯宮腔中線的回聲)。根據(jù)內(nèi)膜及內(nèi)膜下血流灌注情況分為I型(內(nèi)膜區(qū)域可見血流信號，并接近宮腔中線)、Ⅱ型(內(nèi)膜區(qū)域可見血流信號，但≤1/2單層內(nèi)膜)、Ⅲ型(內(nèi)膜下區(qū)域可見血流信號)[10]。

5.隨訪及數(shù)據(jù)收集：移植后12 d檢測血清β-HCG，如β-HCG>10 U/L，則判斷為HCG陽性，繼續(xù)用藥；移植后4～6周超聲觀察若可探及妊娠囊、卵黃囊及胎心搏動則診斷為臨床妊娠；早期流產(chǎn)定義為妊娠12周前發(fā)生胚胎停育或自然流產(chǎn)。

收集指標(biāo)包括患者年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)水平；孕激素轉(zhuǎn)化日及轉(zhuǎn)化后第3天內(nèi)膜容積及血流指標(biāo)；臨床結(jié)局指標(biāo)包括胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率等。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般情況比較

本研究共納入擬行HRT-FET周期的URIF患者120例，其中試驗(yàn)組60例、對照組60例。試驗(yàn)組脫落5 例，完整隨訪55 例；對照組脫落4 例，完成隨訪56 例。共111例患者納入最終分析。

兩組患者間平均年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)水平、移植胚胎數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況的比較(-±s)

二、兩組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化前后子宮內(nèi)膜比較

1.子宮內(nèi)膜厚度、形態(tài)：試驗(yàn)組內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度為(9.77±2.36)mm，對照組轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度為(10.52±2.56)mm，兩組內(nèi)膜厚度比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后第3天兩組內(nèi)膜分別為(9.36±2.58)mm和(10.05±2.78)mm，組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日兩組內(nèi)膜形態(tài)比較，試驗(yàn)組A型內(nèi)膜比例較對照組略高，但組間A、B、C形態(tài)的比例均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后第3天A型內(nèi)膜比例試驗(yàn)組較對照組顯著增高(P<0.05)(表2)。

2.兩組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜容積及血流參數(shù)的比較：轉(zhuǎn)化日兩組子宮內(nèi)膜容積以及血流參數(shù)RI、VI、FI、VFI的比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，內(nèi)膜下血流(Ⅰ、Ⅱ/Ⅲ型)比較亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化前后子宮內(nèi)膜狀況比較[(-±s)，n(%)]

表3 兩組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜容積、血流參數(shù)比較[(-±s)，n(%)]

3.兩組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后第3天子宮內(nèi)膜容積及血流參數(shù)的比較：轉(zhuǎn)化后第3日兩組子宮內(nèi)膜容積比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；內(nèi)膜血流參數(shù)RI試驗(yàn)組顯著低于對照組(P<0.05)，VFI試驗(yàn)組顯著高于對照組(P<0.05)，而組間轉(zhuǎn)化后VI、FI及內(nèi)膜下血流類型比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表4)。

表4 兩組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后第3天子宮內(nèi)膜容積、血流參數(shù)比較[(-±s)，n(%)]

三、兩組患者妊娠結(jié)局比較

試驗(yàn)組的胚胎種植率、臨床妊娠率均高于對照組，而早期流產(chǎn)率低于對照組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表5)。

表5 兩組患者HRT-FET結(jié)局比較[(-±s)，%]

討 論

胚胎著床是一個(gè)精細(xì)協(xié)調(diào)的事件，依賴于胚胎和子宮內(nèi)膜之間的多成分雙向信號傳導(dǎo)[11]，成功的著床取決于胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜容受性和出色的移植技術(shù)[12]。RIF的病因非常復(fù)雜，一般涉及胚胎和子宮內(nèi)膜相關(guān)因素。對于不明原因反復(fù)種植失敗(URIF)患者，被認(rèn)為主要與子宮內(nèi)膜容受性差有關(guān)[13]。

粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是一種造血系特異性細(xì)胞因子，以其對與細(xì)胞增殖相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號通路的激活的特異性作用而聞名。一些非造血細(xì)胞，如生殖組織細(xì)胞，也顯示產(chǎn)生G-CSF[14]。目前認(rèn)為G-CSF在妊娠形成過程中具有多種生理作用，即促進(jìn)胚胎卵裂和胚泡形成，通過影響子宮內(nèi)膜相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜血管重塑、局部免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞粘附途徑，從而改善內(nèi)膜發(fā)育狀態(tài)及血流灌注[15]；促進(jìn)子宮內(nèi)膜增厚，改善子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理，從根本上減少妊娠損失，對傳統(tǒng)治療方法無反應(yīng)的薄型內(nèi)膜，G-CSF灌注可對其產(chǎn)生積極影響。一般認(rèn)為在給藥后48～72 h，子宮內(nèi)膜厚度明顯增加[7]。而G-CSF宮腔灌注通過藥物的外源性化學(xué)刺激及灌注操作本身的機(jī)械物理刺激，對多種內(nèi)源性細(xì)胞因子的分泌起到了共同誘發(fā)的作用，從而影響子宮內(nèi)膜的容受性及妊娠結(jié)局[8]，但仍需要更多臨床研究和循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。

本試驗(yàn)基于多篇關(guān)于G-CSF的國內(nèi)外研究，選擇了擬行HRT-FET的URIF患者作為研究對象，進(jìn)行宮腔灌注，并通過三維彩超測量子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜血流等指標(biāo)，比較治療后兩組患者的臨床結(jié)局。

研究結(jié)果顯示，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后第3日試驗(yàn)組A型內(nèi)膜比例較對照組顯著增高(P<0.05)。一般認(rèn)為A型內(nèi)膜的臨床妊娠率高于B、C型，且A型內(nèi)膜適合于胚胎著床的厚度范圍較大；也有學(xué)者認(rèn)為內(nèi)膜增生程度對妊娠率影響較小，內(nèi)膜形態(tài)與妊娠結(jié)局無相關(guān)性，不足以評估臨床妊娠率[16]。

國內(nèi)外學(xué)者就G-CSF對RIF病例的內(nèi)膜厚度變化及臨床結(jié)局進(jìn)行了大量的研究，但結(jié)論并不一致。在我們的研究中，G-CSF灌注對研究對象的子宮內(nèi)膜厚度無明顯影響，G-CSF灌注組的胚胎種植率、妊娠率雖略高于對照組，流產(chǎn)率低于對照組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。即使在大量嚴(yán)格隨機(jī)對照試驗(yàn)(RCT)中，也只有大約一半得出G-CSF可以提高IVF治療后子宮內(nèi)膜厚度、胚胎種植率或臨床妊娠率的結(jié)論，其他仍為陰性[17]。Kalem等[18]對157例新鮮移植的RIF患者進(jìn)行了RCT，該研究剔除了內(nèi)膜厚度<7 mm的薄型內(nèi)膜患者，發(fā)現(xiàn)對子宮內(nèi)膜正常的RIF患者宮腔內(nèi)給予G-CSF干預(yù)，未明顯改變子宮內(nèi)膜厚度、臨床妊娠率和活產(chǎn)率，本研究結(jié)論與之相似。Arefi等[19]采用皮下注射G-CSF的方式進(jìn)行干預(yù)，得出了同樣的結(jié)論。Moustafa等[20]對于112例新鮮移植的RIF患者應(yīng)用皮下注射G-CSF，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜厚度無明顯改變，而胚胎種植和活產(chǎn)率較未注射組亦未有所提高。Kunicki等[21]對62名常規(guī)治療無反應(yīng)的行FET的子宮內(nèi)膜薄患者隨機(jī)分組行G-CSF灌注治療，發(fā)現(xiàn)G-CSF輸注可改善子宮內(nèi)膜厚度，但對臨床妊娠和活產(chǎn)率沒有任何改善。這些研究結(jié)果的不一致性可能是由于給藥途徑的差異以及研究對象之間臨床條件的異質(zhì)性導(dǎo)致的。

在我們的研究中，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化前兩組的子宮內(nèi)膜血流動力學(xué)比較無顯著差異，而內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后試驗(yàn)組的RI低于對照組而VFI高于對照組(P<0.05)。子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜下血液灌注是胚胎著床的重要影響因素。當(dāng)RI較低而VFI較高時(shí)，說明子宮內(nèi)膜血流灌注良好，反之，說明血流灌注較差。有學(xué)者認(rèn)為子宮動脈和螺旋動脈阻力增加，降低子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜下血流灌注，不利于胚胎著床，可能是導(dǎo)致RIF的原因之一，因此應(yīng)盡量減少RIF患者的血流阻力，以改善妊娠率[22]。G-CSF對子宮內(nèi)膜血管重構(gòu)機(jī)制可能對血流阻力的減少起到一定作用。

大量的Meta分析對不同給藥途徑及不同條件的患者進(jìn)行了更詳盡的分析。Zhang等[17]一項(xiàng)包括1 016 個(gè)IVF-ET周期的基于RCTs的Meta分析發(fā)現(xiàn)，G-CSF宮腔內(nèi)灌注和皮下注射均可顯著提高臨床妊娠率，但對胚胎種植率無顯著影響。該研究又對受試者進(jìn)行了亞組分析：針對RIF人群，G-CSF宮腔灌注后其臨床妊娠率和種植率均高于皮下注射組，雖然兩種給藥途徑均可提高IVF患者的臨床妊娠率，但針對RIF人群G-CSF宮腔內(nèi)灌注同時(shí)提高了種植率。而Kamath等[23]一項(xiàng)納入15項(xiàng)RCTs共643名受試者的Meta分析顯示，G-CSF給藥可以提高RIF婦女的臨床妊娠率，但證據(jù)十分低質(zhì)量(RR2.11，95%CI(1.56，2.85)；7 RCTs；受試者=643；I2=0%；低質(zhì)量證據(jù))。Li等[24]認(rèn)為經(jīng)陰道灌注G-CSF與更高的臨床妊娠率顯著相關(guān)，尤其是在亞洲人群中；在子宮內(nèi)膜較薄或RIF患者中，G-CSF組的胚胎種植率和HCG陽性率顯著升高；然而，子宮內(nèi)膜厚度的增加無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Jiang等[9]一項(xiàng)納入11篇文章的Meta分析顯示，無論何種用藥方式，G-CSF對URIF患者的胚胎種植率和臨床妊娠率具有積極作用，皮下注射時(shí)效果更好，但沒有確鑿的證據(jù)表明G-CSF與流產(chǎn)率之間存在關(guān)聯(lián)。薄文嘉等[25]納入10個(gè)RCTs，研究G-CSF灌注治療RIF患者的臨床效果，結(jié)果顯示灌注組的臨床妊娠率、胚胎種植率顯著高于對照組，而流產(chǎn)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另有研究表明，宮腔灌注G-CSF對RIF患者的胚胎種植率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率均有顯著提高，且治療后宮腔液中的INF-γ、IL-17較治療前下降，而IL-10、TGF-β1及VEGF較治療前顯著上升，G-CSF可能改善患者的免疫狀態(tài)[26]。

綜上所述，G-CSF宮腔灌注對URIF患者的內(nèi)膜容受性及臨床結(jié)局的影響仍存在著爭議。宮腔灌注治療具有無創(chuàng)性和經(jīng)濟(jì)性的特點(diǎn)，若能夠驗(yàn)證其效果，在臨床中利于推廣，這也為URIF患者的臨床治療提供了思路。本研究顯示G-CSF灌注對于URIF患者的子宮內(nèi)膜厚度、妊娠結(jié)局并無顯著影響，說明該項(xiàng)技術(shù)對改善URIF患者的臨床結(jié)局證據(jù)不足。未來可繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，并采用亞組進(jìn)一步分析，如薄型內(nèi)膜組、全身G-CSF給藥組和不同G-CSF給藥劑量組等，使研究更有價(jià)值。另外在本研究中，未對胚胎進(jìn)行胚胎種植前遺傳學(xué)檢測-非整倍體篩查(Preimplantation genetic testing for aneuploidies，PGT-A)，這是我們研究的另一個(gè)局限?？傊?，G-CSF對URIF患者子宮內(nèi)膜及臨床結(jié)局的影響有待進(jìn)一步研究。