王家雄，唐慧#，許詠樂#，郭宏，李紅，楊慎敏*，向菁菁*

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 1.生殖與遺傳中心；2.司法鑒定中心，蘇州 215002)

精子在男性生育中的重要作用毋庸置疑，當(dāng)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常時(shí)，精子的受精潛能會(huì)受到直接影響。受益于二代測序技術(shù)的發(fā)展，精子結(jié)構(gòu)異常的遺傳病因被不斷揭示。比如，CFAP43和CFAP44的缺陷會(huì)導(dǎo)致精子鞭毛結(jié)構(gòu)異常從而降低精子活動(dòng)力[1]。此外，DPY19L2缺陷會(huì)導(dǎo)致頂體裝配異常從而影響精卵結(jié)合[2]。無頭精子癥(acephalic spermatozoa syndrome，ASS)是一類典型的精子結(jié)構(gòu)異常，開始被稱為斷頭精子癥(decapitated sperm defect)[3-4]，表現(xiàn)為精子頭頸連接的缺陷[5]，由于其明顯的精子異常表型，吸引了許多研究者的關(guān)注。以往研究顯示SUN5(Sad1 and UNC84 domain containing 5[MIM：613942]) 缺陷是ASS最常見的遺傳病因[5-6]。除此之外，Zhu等[7]還在一對不育的兄弟中鑒定出另一個(gè)致病基因PMFBP1(polyamine modulated factor 1 binding protein 1[HGNC：17728，GenBank：NM_031293.2])。盡管ASS的病例發(fā)掘越來越多，但自然生育的病例還未見報(bào)道。本文報(bào)道一例已自然生育的SUN5缺陷病例。

病例資料

先證者和其家屬來自于我院生殖與遺傳中心，患者的外生殖器發(fā)育正常，雙側(cè)睪丸和激素水平正常，觸診未見雙側(cè)精索靜脈異常。該研究得到南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者及其家人簽署知情同意書。

一、診療鑒定過程

1.精液常規(guī)與精子形態(tài)分析：精液常規(guī)分析按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)手冊(第五版)》進(jìn)行，并檢測兩次。精子形態(tài)通過精子涂片、改良巴氏染色液染色，計(jì)數(shù)200個(gè)精子進(jìn)行分析。形態(tài)缺陷根據(jù)之前的研究分為4類[7]：正常、不正常頭頸連接、斷頭(無頭精子附近可以找到對應(yīng)精子頭部)、無頭，計(jì)算每個(gè)分類所占百分比。

2.掃描與透射電鏡：收集新鮮的精子樣本400g離心15 min，PBS清洗兩次，2.5% 戊二醛固定。經(jīng)過脫水和滲透后，將樣本品包埋在Epon 812樹脂包埋劑(美國SPI)中，并用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對超薄切片進(jìn)行染色。用透射電鏡(TECNAI-10，Philips，荷蘭)以80 kV的加速電壓觀察并記錄超微結(jié)構(gòu)。用離子噴霧儀(ACE200，Leica，德國)噴射膠體金涂覆樣品，并用掃描電鏡(Nova NanoSEM 450，美國)以5 kV的加速電壓進(jìn)行分析。

3.全外顯子測序、Sanger測序以及數(shù)據(jù)分析：基因組DNA通過QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德國)提取。使用至少3 μg患者DNA通過xGenExome research panel v1.0(Integrated DNA Technologies，美國)創(chuàng)建富集的DNA庫。經(jīng)過生物信息學(xué)分析后，過濾并分析數(shù)據(jù)。考慮到表型和遺傳模式，發(fā)現(xiàn)SUN5的一個(gè)復(fù)合雜合突變。然后，直接進(jìn)行Sanger測序以驗(yàn)證推定的突變。通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用引物擴(kuò)增SUN5 exon11和exon13的序列。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，隨后通過ABI 3130遺傳分析儀(Applied Biosystems，美國)進(jìn)行測序。引物序列見表1。

表1 Sanger測序引物序列

4.親子鑒定：使用AGCU EX20 STR試劑盒v1.0(無錫中德美聯(lián)生物)擴(kuò)增患者及其女兒1 ng的DNA，其中包括牙釉基因和19個(gè)常染色體位點(diǎn)(即CSF1PO、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、，D7S820、，D8S1179、FGA、PentaD、PentaE、TH01、TPOX、vWA)。操作嚴(yán)格按照試劑盒中說明書進(jìn)行。PCR后，在ABI 3130遺傳分析儀(Applied Biosystems，美國)上通過毛細(xì)管電泳分離擴(kuò)增的產(chǎn)物，并使用Genemapper ID 3.2軟件(Applied Biosystems，美國)分析數(shù)據(jù)。

二、鑒定結(jié)果

1.SUN5缺陷患者精液檢查結(jié)果及精子形態(tài)學(xué)表型：患者的精子活動(dòng)力低下，兩次檢測均未發(fā)現(xiàn)正常形態(tài)精子，異常頭頸連接、斷頭、無頭精子百分?jǐn)?shù)值較高(表2)。光鏡下，與正常對照精子(圖1A)不同，患者的精子頭頸部交界處異常脆弱，導(dǎo)致許多精子只有孤立的頭或尾，呈現(xiàn)明顯的ASS表型，值得注意的是，雖然許多頸部存在異常，但仍然有完整的精子(圖1B)。掃描電鏡圖像顯示了斷裂的連接點(diǎn)(圖1D)，精子頭中段仍然處于連接狀態(tài)，卻出現(xiàn)嚴(yán)重畸形，如嚴(yán)重的成角彎曲(圖1E、F)，但精子的頭部形狀比較正常。在透射電鏡下，與正常精子(圖1G)不同的是，盡管近端中心體、節(jié)柱、線粒體和所有其他成分在尾部有序排列，ASS患者仍然缺乏完整的植入窩和基底板(圖1H)。

2.測序結(jié)果：測序深度和覆蓋范圍符合后續(xù)分析的條件，結(jié)合患者精子的頭頸連接缺陷，本研究發(fā)現(xiàn)SUN5中的兩個(gè)突變(c.781G>A[p.Val261Met]和c.1043A>T[p.Asn348Ile])，分別是Zhu等[5]在2016年和Shang等[8]在2018年以純合突變形式報(bào)道過的。Sanger測序結(jié)果證實(shí)了該患者的兩個(gè)變異，而患者女兒的c.1043A>T表明該患者為復(fù)合雜合子狀態(tài)(圖2)。

3.親子鑒定結(jié)果：患者的妻子經(jīng)過8年備孕后自然受孕，并生育了一個(gè)女兒。親子鑒定結(jié)果顯示，父親和孩子的19個(gè)常染色體STR基因型，除vWA外，所有位點(diǎn)均符合孟德爾遺傳法，證明了他們之間的生物學(xué)親子關(guān)系(表3)。

表2 患者的精液質(zhì)量參數(shù)

A：光鏡下正常精子形態(tài)(大框示小框區(qū)放大圖)；B：光鏡下ASS患者精子形態(tài)(大框示小框區(qū)放大圖)；C：正常精子掃描電鏡圖；D～F：ASS患者精子掃描電鏡圖；G：正常精子透射電鏡圖；H：ASS患者精子透射電鏡圖；箭頭所示為頭頸連接處。圖1 SUN5缺陷患者精子的形態(tài)學(xué)檢查圖像

箭頭示突變位點(diǎn)。圖2 患者及其女兒的Sanger測序分析結(jié)果

表3 患者和女兒的親子鑒定染色體匹配結(jié)果

討 論

ASS患者的精子存在結(jié)構(gòu)異常，而SUN5是主要致病基因。多胺調(diào)節(jié)因子1結(jié)合蛋白1(polyamine modulated factor 1 binding protein 1，PMFBP1[GenBank：NM_031293.2])[7]、睪丸特異蛋白10(testis specific 10，TSGA10[MIM：607166])[9]、溴區(qū)結(jié)構(gòu)域睪丸相關(guān)蛋白(bromodomain testis associated，BRDT[MIM：602144])[10]以及中心體蛋白112(centrosomal protein 112，CEP112[MIM：])[11]被鑒定與ASS有關(guān)，但后兩個(gè)基因沒有在其他人類患者中被檢測到或沒有被動(dòng)物模型驗(yàn)證。除此之外，在小鼠模型中有許多基因也被報(bào)道與ASS有關(guān)，如OAZ3[12]、CNTROB[13]、SPATA6[14]等等，但是這些突變都沒有在人類身上發(fā)現(xiàn)過。

SUN5也被稱為精子相關(guān)抗原4樣蛋白(sperm-associated antigen 4-like protein，SPAG4 L)，其編碼基因位于染色體20q11.21中，包含15個(gè)外顯子[15]。在精子細(xì)胞中，SUN5蛋白定位于精子核被膜的內(nèi)膜上[6]。如果SUN5存在缺陷，頭頸偶聯(lián)裝置雖然可以很好地組裝，但是它不能連接到核被膜上，就好像吸盤本身沒有組裝問題，但無法吸附到目標(biāo)上。SUN5蛋白包含兩種重要的結(jié)構(gòu)域，分別是其N端的跨膜結(jié)構(gòu)域和C端的保守SUN結(jié)構(gòu)域[16]。本研究中的兩個(gè)突變均位于SUN5蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域，這是與偶聯(lián)裝置蛋白DnaJ熱激蛋白家族(Hsp40)成員B13(DnaJ heat shock protein family(Hsp40) member B13，DNAJB13)相互作用的關(guān)鍵功能域。DNAJB13是精子中與軸絲相關(guān)的成分，在精子發(fā)生過程中位于精子頭尾偶聯(lián)裝置中，SUN5的C末端結(jié)構(gòu)域中的氨基酸變化可能會(huì)破壞SUN5蛋白與DNAJB13之間的相互作用，從而導(dǎo)致ASS[8]。

之前所有的研究均認(rèn)為ASS是一種嚴(yán)重的原發(fā)不育，因?yàn)锳SS患者沒有自然生育的報(bào)道，而卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)被認(rèn)為是幫助其成功孕育的唯一手段[17]。迄今為止，有4篇研究報(bào)道描述了SUN5突變導(dǎo)致的原發(fā)不育[5-6，8，17]，但只有一篇研究記錄顯示ICSI后的成功妊娠[17]。在本研究中，患者經(jīng)過8年的嘗試，自然生育一個(gè)健康的女兒，這是攜帶SUN5致病突變的ASS患者首次自然生育的報(bào)道。因此我們認(rèn)為之前報(bào)道顯示ASS患者ICSI結(jié)局良好，是由于SUN5缺陷僅僅只是破壞了精子頭尾之間耦合裝置的發(fā)生，對精子的頂體發(fā)生和核內(nèi)遺傳完整性沒有影響[6]。本研究報(bào)道表明，盡管ASS患者自然生育存在很大困難，但并非沒有可能，這也預(yù)示著患有此類缺陷的ASS患者的輔助生殖妊娠結(jié)局和后代健康狀況應(yīng)相當(dāng)樂觀。

綜上所述，本中心接收到一例咨詢二胎生育的ASS患者，患者精子表現(xiàn)出典型的ASS表型，即頭頸連接異常，但值得注意的是部分精子頭頸并沒有完全斷開；通過全外顯子測序鑒定，發(fā)現(xiàn)患者是SUN5復(fù)合雜合突變(c.781G>A[p.Val261Met]和c.1043A>T[p.Asn348Ile])。患者第一胎的女兒為患者親生并攜帶c.1043A>T雜合突變，表明該患者為SUN5的復(fù)合雜合突變對蛋白質(zhì)的影響小于純合突變，提示雖然SUN5缺陷將導(dǎo)致ASS，但對于輕度患者仍然有自然生育的機(jī)會(huì)。本研究為ASS患者的遺傳咨詢和輔助生殖治療提供了臨床參考，但需要進(jìn)一步的分子功能機(jī)制研究來解釋由不同的SUN5突變類型引起的不同表型。