劉文穎 馮曉文 程青麗 王卓然 谷瑞增

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，北京 100083；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015；3.北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206)

我國約有60%的人口以大米為主要糧食，其中2021年1月至4月我國累計(jì)進(jìn)口大米192萬噸，同比增加155.2%，創(chuàng)我國階段性大米進(jìn)口的歷史紀(jì)錄[1- 2]。大米蛋白主要是大米淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，也可從米糠和碎米中直接提取[3]。大米蛋白營(yíng)養(yǎng)豐富，含人體必需的各種氨基酸，其氨基酸組成平衡、合理，接近“完全蛋白”，生物價(jià)高達(dá)77%，與蝦仁、牛肉等相似[4]。此外，與其他谷物蛋白質(zhì)相比，大米蛋白還具有低過敏性、不含抗?fàn)I養(yǎng)因子、消化率高、無色素干擾及味道柔和等特點(diǎn)[3- 4]。近年來，從動(dòng)植物蛋白質(zhì)中獲取生物活性肽成為食品科學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。通過采用溫和的酶法水解大米蛋白制備大米肽，可以提高大米蛋白附加值，實(shí)現(xiàn)對(duì)大米蛋白的精深加工與利用，并且有效改善其功能屬性，更易消化吸收[5- 6]。

人體過多的自由基會(huì)造成機(jī)體功能紊亂，導(dǎo)致多種疾病，如心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病、動(dòng)脈硬化等。人工合成抗氧化劑如BHA(丁基羥基茴香醚)、BHT(2，6- 二叔丁基- 4- 甲基苯酚)、TBHQ(叔丁基對(duì)苯二酚)等雖然具有很強(qiáng)的抗氧化活性，但長(zhǎng)期服用會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒副作用。作為天然安全的生物抗氧化劑，抗氧化活性肽能夠減少自由基，抑制或消除氧化反應(yīng)，降低自動(dòng)氧化速率和脂肪的過氧化物含量，保護(hù)細(xì)胞抵御自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，從而達(dá)到抗衰老的功能[7]。與化學(xué)抗氧化劑相比，動(dòng)植物來源的抗氧化活性肽安全性高、無毒副作用，作為天然抗氧化劑在食品和醫(yī)藥行業(yè)中具有強(qiáng)大的競(jìng)爭(zhēng)力，是研究人員探索最多的一種生物活性肽。目前已報(bào)道了烏雞、雞蛋、牛奶、大豆等多種蛋白來源活性肽的抗氧化作用，并且有研究表明抗氧化肽的活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)[7- 9]。目前，關(guān)于大米低聚肽結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的系統(tǒng)、全面研究還鮮見報(bào)道。

本研究以大米蛋白粉為原料，經(jīng)生物酶解、分離純化等步驟制得大米低聚肽，在對(duì)其基礎(chǔ)理化成分分析的基礎(chǔ)上，利用相對(duì)分子質(zhì)量分布、氨基酸組成、掃描電鏡、紫外光譜和圓二色光譜分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，然后通過羥基自由基清除能力、鐵離子還原能力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)和還原能力4種不同的體外抗氧化評(píng)價(jià)體系考察其體外抗氧化作用，旨在為大米低聚肽功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米蛋白粉，北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供；堿性蛋白酶(≥400 000 DU/g)、中性蛋白酶(≥1 600 AU/g)，購自杜邦丹尼斯克公司；FRAP測(cè)定試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所；分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)、Fluorescein(熒光指示劑)、Trolox(水溶性維生素E)，均購自美國Sigma公司；其他分析純?cè)噭?，購自北京化工廠。

UV- 1780紫外可見分光光度計(jì)，日本SHIMADZU公司生產(chǎn)；Spectra MR多功能酶標(biāo)儀，美國DYNEX公司生產(chǎn)；LC- 20A高效液相色譜儀，日本SHIMADZU公司生產(chǎn)；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀，美國MD公司生產(chǎn)；A300全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國曼默博爾公司生產(chǎn)；QSY- Ⅱ型凱式定氮儀，北京強(qiáng)盛分析儀器制造中心生產(chǎn)；HH- 501型超級(jí)恒溫水浴鍋，常州國宇儀器制造有限公司生產(chǎn)；DHG- 9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京陸?？萍加邢薰旧a(chǎn)；LG10- 2.4A型高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大米低聚肽的制備

稱取500 g大米蛋白粉，溶解于蒸餾水中，然后置于50 ℃水浴鍋中，調(diào)節(jié)pH值至8.5，之后加入堿性蛋白酶4.0 g，酶解2 h后，調(diào)節(jié)水解液pH值為6.0，然后加入中性蛋白酶4.2 g，繼續(xù)酶解2 h。期間用0.1 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)水解液，使pH值保持不變。酶解結(jié)束后在100 ℃沸水浴條件下滅酶，冷卻至室溫后，6 000g離心10 min，取上清液，用孔徑為200 nm的陶瓷膜過濾，取濾過清液，然后用截留相對(duì)分子質(zhì)量為1 000的超濾膜超濾，得到相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的濾過液，之后將溶液濃縮并冷凍干燥，得到大米低聚肽粉[10]。

1.2.2 基礎(chǔ)理化成分測(cè)定

參照相關(guān)國標(biāo)方法，即按GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，按GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》中的方法測(cè)定酸溶蛋白含量，按GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》中的方法測(cè)定脂肪含量，按GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》中的方法測(cè)定水分含量，按GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》中的方法測(cè)定灰分含量。

1.2.3 大米低聚肽的結(jié)構(gòu)表征

1.2.3.1 氨基酸組成測(cè)定

按照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》中的方法，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)大米低聚肽的水解氨基酸和游離氨基酸組成進(jìn)行分析。測(cè)定大米低聚肽的水解氨基酸含量時(shí)，大米低聚肽的水解方法為：稱取0.1 g大米低聚肽樣品于水解管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液和3滴苯酚，然后充氮?dú)? min，封口；放在110 ℃的電熱鼓風(fēng)恒溫箱內(nèi)，水解22 h后取出，冷卻至室溫。打開水解管，將水解液過濾至50 mL容量瓶?jī)?nèi)，用水定容至相應(yīng)刻度，振蕩混勻。準(zhǔn)確吸取0.2 mL濾液，使用氮吹儀吹干，加入1 mL稀釋液復(fù)溶，振蕩混勻后，吸取溶液通過0.22 μm濾膜后，轉(zhuǎn)移至儀器進(jìn)樣瓶，供測(cè)定使用。

1.2.3.2 相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定

利用流動(dòng)相配制質(zhì)量濃度為1 g/L的樣品溶液，經(jīng)孔徑0.2 μm聚四氟乙烯過濾膜過濾后，用高效液相色譜儀進(jìn)行凝膠過濾，通過紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，使用GPC軟件處理色譜數(shù)據(jù)。同時(shí)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過膜后進(jìn)樣，制作相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線。4種肽標(biāo)準(zhǔn)品為：乙氨酸- 乙氨酸- 乙氨酸(相對(duì)分子質(zhì)量為189)、乙氨酸- 乙氨酸- 酪氨酸- 精氨酸(相對(duì)分子質(zhì)量為451)、桿菌酶(相對(duì)分子質(zhì)量為1 450)、細(xì)胞色素C(相對(duì)分子質(zhì)量為12 500)。色譜條件為：色譜柱，TSKgel G2000 SWXL型，300 mm×7.8 mm；流動(dòng)相，體積比V(乙腈)：V(水)：V(三氟乙酸)為45：55：0.1；流速，0.5 mL/min；進(jìn)樣體積，10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)，220 nm；柱溫，30 ℃[11]。

1.2.3.3 掃描電鏡分析

將大米低聚肽干粉樣品涂抹在樣盤雙面膠上，然后進(jìn)行氮吹處理。處理好的樣品放入掃描電鏡中抽真空，施加一定的電壓，調(diào)整束斑尺寸，待聚焦清晰后分別在500倍和1 000倍下獲取圖像，觀察它們的區(qū)別[12]。

1.2.3.4 紫外光譜掃描

將大米低聚肽配制成2.0 g/L的溶液，利用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行紫外光譜掃描，掃描波長(zhǎng)為245～330 nm[11]。

1.2.3.5 圓二色光譜掃描

稱取大米低聚肽于超純水中，配制成1.0 g/L的溶液，進(jìn)行圓二色光譜掃描。步長(zhǎng)為0.2 nm，帶寬為2.0 nm，光譜范圍為190～250 nm，掃描速度為200 nm/min。從每個(gè)光譜中減去緩沖液的基線光譜，并使用Jasco軟件內(nèi)置的分析函數(shù)將得到的值轉(zhuǎn)換為摩爾橢圓率(θ)[12]。

1.2.4 大米低聚肽的體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.4.1 羥基自由基清除能力測(cè)定

采用水楊酸法[13]，依次加入100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液、200 μL 5 mmol/L水楊酸乙醇溶液、200 μL 5 mmol/L FeSO4溶液，實(shí)驗(yàn)組(吸光值為AX)以100 μL 5 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)；對(duì)照組(吸光值為A0)以等體積蒸餾水啟動(dòng)反應(yīng)；空白對(duì)照組(吸光值為A1)以等體積蒸餾水代替樣品。渦旋振蕩，37 ℃反應(yīng)1 h后取200 μL反應(yīng)液于96孔板中，在510 nm處測(cè)定吸光值。羥基自由基清除率(η，%)的計(jì)算如下：

(1)

將7.5 mL TPTZ(三吡啶基三嗪)稀釋液和750 μL TPTZ溶液充分混勻后加入750 μL檢測(cè)緩沖液，配制成FRAP工作液，于37 ℃孵育備用。在96孔板的檢測(cè)孔中加入180 μL FRAP工作液，空白對(duì)照孔中加入5 μL蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入5 μL各種濃度(0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L)的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入5 μL樣品溶液，輕輕混勻。37 ℃孵育5 min后于593 nm處測(cè)定吸光值，結(jié)果表示為mmol/L(以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì))[14]。

1.2.4.3 ORAC值測(cè)定

將25 μL樣品溶液和100 μL的Fluorescein(0.8 μmol/L)于96孔板中混合，然后加入75 μL 150 mmol/L偶氮類化合物AAPH啟動(dòng)反應(yīng)，此為實(shí)驗(yàn)組。分別用25 μL Trolox標(biāo)準(zhǔn)品(6.25、12.5、25、50、100、250、500 μmol/L)代替樣品作為陽性對(duì)照(制作標(biāo)準(zhǔn)曲線)、25 μL磷酸緩沖液(pH=7.4，75 mmol/L)代替樣品為空白對(duì)照，于37 ℃保溫20 min，熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm，每隔5 min測(cè)定一次，測(cè)定總時(shí)間為120 min；另外做不加AAPH的對(duì)照。根據(jù)樣品的熒光衰退曲線的保護(hù)面積和標(biāo)準(zhǔn)品的熒光衰退曲線的保護(hù)面積之比計(jì)算樣品的ORAC值，結(jié)果表示為μmol/g(以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì))[15]。

1.2.4.4 還原能力測(cè)定

反應(yīng)體系為100 μL樣品溶液、100 μL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.6)和100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀，50 ℃水浴中保溫20 min后，加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸。取100 μL反應(yīng)液，加入100 μL蒸餾水和20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液，放置10 min后，于700 nm下測(cè)定吸光值[16]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米低聚肽的基礎(chǔ)理化成分

大米低聚肽中總蛋白質(zhì)含量為95.75%±1.72%，脂肪含量為0.20%±0.02%，灰分含量為2.46%±0.13%，水分含量為5.17%±0.15%。酸溶蛋白質(zhì)含量為92.27%±1.08%，占總蛋白質(zhì)的96.39%±2.03%，游離氨基酸含量為3.16%±0.20%，經(jīng)計(jì)算，低聚肽含量為89.11%±0.94%。由此可見，大米低聚肽蛋白質(zhì)含量較高，其他成分含量很低，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物。

第二天晚上，見到爸爸進(jìn)入洗澡間后，皮皮在門外耐心等待，見爸爸一直不開門，又開始哭鬧，皮皮媽力挺女兒，皮皮爸終于打開了門。女兒一看，大哭：“嗚……我不要你穿游泳褲洗澡，脫掉脫掉！嗚……”皮皮爸低頭，一言不發(fā)，滿臉通紅，憋了足足1分鐘后脫下游泳褲。女兒仔細(xì)觀察爸爸私處，然后用手摸摸，說道：“哦，原來是這樣的啊，早給我看不就完了嘛?！闭f完滿意地離開，從此不再騷擾爸爸洗澡了。

2.2 大米低聚肽的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 大米低聚肽的氨基酸組成

大米低聚肽的氨基酸組成(以100 g大米低聚肽為基準(zhǔn))如表1所示。大米低聚肽中谷氨酸、天門冬氨酸和精氨酸含量較高，總含量為33.00 g，而色氨酸、胱氨酸和蛋氨酸含量較低，總含量?jī)H為3.23 g。大米低聚肽含有8種必需氨基酸，總含量為24.98 g，占氨基酸總和的30.56%。第一限制性氨基酸賴氨酸含量為3.31 g，較為豐富，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表1 大米低聚肽的氨基酸組成

1)以100 g大米低聚肽為基準(zhǔn)。

大米低聚肽的抗氧化活性與其氨基酸組成特點(diǎn)有一定的相關(guān)性。研究表明，許多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，如組氨酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、色氨酸、丙氨酸等[17]。芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸可作為抗氧化肽的活性位點(diǎn)，通過提供氫原子，使自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)減慢或終止[18]。大米低聚肽富含抗氧化性氨基酸，其中亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸含量較高。疏水性氨基酸占氨基酸總和的33.24%，堿性氨基酸占16.10%，酸性氨基酸占31.01%，有報(bào)道證明，疏水性氨基酸及其殘基含量較多的肽呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化作用[19- 20]。李佳南等[10]的研究表明，大米肽具有明顯的自由基淬滅能力和抑制亞油酸自然氧化的作用，氨基酸序列測(cè)定結(jié)果表明，其抗氧化作用與其氨基酸組成有關(guān)。

2.2.2 大米低聚肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布

由圖1可知，相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：lgMW=-0.212 630 9t+6.889 731，R2=0.996 566 9，其中MW為重均相對(duì)分子質(zhì)量，t為洗脫時(shí)間。相對(duì)分子質(zhì)量分布凝膠色譜圖見圖2，經(jīng)計(jì)算得到大米低聚肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布，如表2所示。大米低聚肽為小分子肽段混合物，相對(duì)分子質(zhì)量分布主要集中在1 000以下，其占比高達(dá)91.84%。其中，相對(duì)分子質(zhì)量在150～1 000的小肽占85.66%，而1 000～2 000、2 000～3 000、3 000～5 000、>5 000的多肽占比分別為7.06%、0.91%、0.18%、0.01%，說明大米低聚肽的主要成分為1 000以下的小肽。研究表明，肽的抗氧化活性與相對(duì)分子質(zhì)量大小有關(guān)。Dong等[21]使用截留相對(duì)分子質(zhì)量 5 000、3 000、1 000的超濾膜將牡蠣肽分離純化為不同組分，并考察了其抗氧化活性，結(jié)果表明相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的肽組分表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化活性。這與其他研究人員的研究結(jié)果一致，即低分子肽具有更強(qiáng)的抗氧化活性[22- 23]。本試驗(yàn)中，大米低聚肽相對(duì)分子質(zhì)量小于 1 000 的小肽占90%以上，同時(shí)小肽還能產(chǎn)生離子化的氨基和羧基，可提供電子或氫原子抑制氧化反應(yīng)，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[24]。

表2 大米低聚肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布

圖1 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 大米低聚肽相對(duì)分子質(zhì)量分布凝膠色譜圖Fig.2 Gel filter chromatogram of relative molecular weight distribution of rice oligopeptides

2.2.3 掃描電鏡結(jié)果與分析

大米低聚肽的掃描電鏡圖見圖3。由圖可以看出，在500倍和1 000倍放大倍數(shù)下，大米低聚肽為明顯的球體顆粒狀，表面有不規(guī)則的褶皺和小的

(a)放大500倍

氣孔，這可能是由于酶解過程使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，從而使粒徑變小，表面暴露出了更多的疏水性基團(tuán)[25]。

2.2.4 紫外光譜分析

圖4 大米低聚肽的紫外光譜圖

2.2.5 圓二色光譜分析

利用圓二色光譜檢測(cè)大米低聚肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，譜圖上的峰位和峰形顯示，大米低聚肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)以多種構(gòu)象并存(見圖5)，大米低聚肽在198 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)有負(fù)吸收，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β- 折疊。利用CDNN軟件分析得到大米低聚肽各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量：α- 螺旋含量為6.0%±0.3%，平行式β- 折疊的為3.3%±0.2%，反平行式β- 折疊的為40.2%±1.9%，β- 轉(zhuǎn)角的為19.5%±1.0%，無規(guī)則卷曲的為32.1%±2.5%。與蛋白質(zhì)相比，肽的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，主要具有肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)[27]。大米低聚肽中緊密且沒有空腔的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)即α- 螺旋結(jié)構(gòu)含量較少，β- 折疊及無規(guī)則卷曲含量較多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面疏水性變大[28]。這可能是由于酶解使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)展開，蛋白質(zhì)分子內(nèi)無序結(jié)構(gòu)含量相對(duì)較高，β- 折疊和無規(guī)則卷曲增加，使得隱藏在內(nèi)部的疏水性位點(diǎn)更多地顯露出來，從而發(fā)揮特定的功能作用[29]，這可能也是大米低聚肽表現(xiàn)出一定抗氧化能力的原因所在。

圖5 大米低聚肽的圓二色光譜圖

2.3 大米低聚肽的體外抗氧化作用

2.3.1 大米低聚肽的羥基自由基清除能力

大米低聚肽和陽性對(duì)照Vc的羥基自由基清除能力如圖6所示。在質(zhì)量濃度0～25 g/L范圍內(nèi)，大米低聚肽對(duì)羥基自由基清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增加，在質(zhì)量濃度為25 g/L時(shí)，清除率為83.35%±2.53%，可見其對(duì)羥基自由基有很強(qiáng)的清除作用，半抑制濃度(IC50值)約為11.1 g/L。這表明大米蛋白被酶解成低聚肽后，能夠暴露更多的活性基團(tuán)或位點(diǎn)，作為供氫體還原自由基，從而終止自由基連鎖反應(yīng)，呈現(xiàn)出抗氧化能力[21]。Vc對(duì)羥基自由基的清除率先迅速增加，然后趨于平緩，IC50值約為0.07 g/L。大米低聚肽的羥基自由基清除能力弱于強(qiáng)抗氧化劑Vc，但是作為一種天然的功能活性物質(zhì)，其安全性高，且無潛在毒副作用。趙佳佳[30]考察了大米肽的抗氧化能力，結(jié)果表明，大米肽的羥基自由基清除能力也與質(zhì)量濃度呈量效關(guān)系，其IC50值為12.01 g/L，稍弱于本研究中大米低聚肽的清除能力。

(a)大米低聚肽

2.3.2 大米低聚肽的鐵離子還原能力

利用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖7所示。大米低聚肽和Vc的FRAP值見圖8。在質(zhì)量濃度10～30 g/L范圍內(nèi)，大米低聚肽的FRAP值與其質(zhì)量濃度呈明顯的正比關(guān)系，F(xiàn)RAP值隨質(zhì)量濃度的增加而增加。這表明大米低聚肽能夠通過氫原子轉(zhuǎn)移阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程而實(shí)現(xiàn)抗氧化作用[31]。Vc在較低的質(zhì)量濃度(0.015～0.08 g/L)下就能展示出較強(qiáng)的鐵離子還原能力。雖然大米低聚肽的FRAP值明顯低于Vc在各質(zhì)量濃度下的FRAP值(P<0.05)，但與其他抗氧化肽的FRAP值相近[14]。張文敏等[32]以亞麻籽粕為原料，通過不同蛋白酶酶解制備抗氧化活性肽，結(jié)果表明，分子質(zhì)量較低的亞麻籽粕肽的FRAP值較高，這可能是由于其包含某些活性氨基酸序列，或者具有大量疏水區(qū)的肽段特定結(jié)構(gòu)，從而提高了抗氧化活性。

圖7 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線

(a)大米低聚肽

(b)Vc

2.3.3 大米低聚肽的氧自由基吸收能力

Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的動(dòng)態(tài)熒光衰減曲線見圖9，由此繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖10所示。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算大米低聚肽和Vc的ORAC值，分別為(498.88±18.29)、(976.42±33.42)μmol/g，可見大米低聚肽的氧自由基吸收能力約為Vc的50%。盡管大米低聚肽的氧自由基吸收能力不如Vc強(qiáng)，但大米低聚肽作為天然抗氧化物質(zhì)，已表現(xiàn)出較強(qiáng)的氧自由基吸收能力，具有很高的利用價(jià)值。推測(cè)可能由于大米蛋白酶解后，空間構(gòu)型、氨基酸組成和分子空間排列等發(fā)生變化，原先包埋于蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的抗氧化性氨基酸斷裂成末端氨基酸或折疊肽段暴露出來，釋放出具有抗氧化活性的小肽，產(chǎn)生離子化的氨基或羧基等供氫體，從而終止自由基連鎖反應(yīng)，達(dá)到清除或抑制自由基的目的[33]。

圖9 不同濃度Trolox的動(dòng)態(tài)熒光衰減曲線Fig.9 Dynamic fluorescence attenuation curve of Trolox at different concentrations

圖10 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.4 大米低聚肽的還原能力

圖11給出了大米低聚肽和Vc的還原能力，由圖可見，大米低聚肽和Vc的吸光值均隨其質(zhì)量濃度的增加而增大，吸光值越大，還原能力越強(qiáng)，抗氧化活性就越強(qiáng)。這表明大米低聚肽是良好的電子供體，具有一定的抗氧化能力。賈俊強(qiáng)等[34]通過中性蛋白酶酶解大米蛋白制備大米肽，并研究了其還原能力，與本研究結(jié)果相似，大米肽的還原能力與其質(zhì)量濃度成正比，質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)吸光值約為0.085。曹輝等[35]以大米蛋白為原料，利用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，制備出大米肽，考察其還原能力，結(jié)果表明在質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)吸光值約為0.09。本研究中大米低聚肽的還原能力均高于上述實(shí)驗(yàn)獲得的大米肽。由于大米低聚肽具有原料易得、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此作為天然安全的抗氧化劑具有廣闊的應(yīng)用前景。

(a)大米低聚肽

3 結(jié)語

通過二步法制備的大米低聚肽蛋白質(zhì)和肽含量較高，具有良好的羥基自由基清除能力、鐵離子還原能力、氧自由基吸收能力和還原能力，是一種有效的抗氧化活性肽。大米低聚肽富含亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸等抗氧化性氨基酸，主要成分為相對(duì)分子質(zhì)量1 000以下的小肽。產(chǎn)物為明顯的球體顆粒狀，表面有不規(guī)則褶皺和氣孔，在270 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰；二級(jí)結(jié)構(gòu)以多種構(gòu)象并存，主要為β- 折疊。后續(xù)研究將通過離子色譜、反相高效液相色譜、凝膠色譜等方法分離純化大米低聚肽，鑒定高活性的抗氧化肽段，進(jìn)一步明確大米低聚肽的抗氧化功能構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)理。