鄭必勝 伍磊 周林 裴運(yùn)林

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 511436；3.廣東丸美生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510530)

多糖因其具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等多項(xiàng)生物活性而一直受研究者的青睞[1]。然而多糖的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和構(gòu)象基本上決定了多糖的生物活性[2]。多糖的分子修飾可以通過引入新的基團(tuán)來改善多糖原有的分子結(jié)構(gòu)，并賦予其新的功能特性[3- 5]。硫酸酯化修飾是通過化學(xué)方法使得多糖分子羥基上的氫被硫酸基團(tuán)取代，能夠增強(qiáng)多糖的水溶性，而且硫酸基團(tuán)的引入能使多糖具有獨(dú)特的抗凝血活性[6- 7]。

裂褶多糖(Schizophyllanpolysacchaeides)是一種從裂褶菌(Schizophyllan)子實(shí)體、菌絲或發(fā)酵液中提取出來的中性多糖，其分子結(jié)構(gòu)為3個(gè)重復(fù)的β- (1，3)-D-吡喃葡萄糖殘基連接一個(gè)β- (1，6)-D-吡喃葡萄糖殘基[8- 9]。研究表明，裂褶多糖具有良好的抗腫瘤[10]、免疫調(diào)節(jié)活性[11]以及保濕性[12]，而且裂褶多糖具有分子質(zhì)量高、黏度高、溶解度低的特點(diǎn)。之前關(guān)于裂褶多糖硫酸酯的研究主要集中在其抗氧化活性上[13- 14]，缺乏對(duì)硫酸酯化裂褶多糖制備工藝及其抗凝血活性的研究。

本研究以裂褶多糖(SPG)為原料，采用三氧化硫-吡啶法對(duì)SPG進(jìn)行硫酸酯化，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，制備高取代度的硫酸酯化裂褶多糖(S-SPG)。通過紫外光譜、紅外光譜、掃描電鏡對(duì)S-SPG進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并研究其抗凝血活性，旨在為研發(fā)具有抗凝活性和治療血栓作用的S-SPG提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裂褶多糖由裂褶菌發(fā)酵而來，廣州丸美生物科技有限公司提供。

本研究使用的主要試劑有三氧化硫-吡啶復(fù)合物、肝素鈉(205 U/mg)，購自上海麥克林生化科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、吡啶，購自上海阿拉丁科技股份有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，購自安耐吉化學(xué)有限公司；APTT(活化部分凝血活酶時(shí)間)、TT(凝血酶時(shí)間)、PT(凝血酶原時(shí)間)試劑，購自日本Sysmex公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

本研究使用的主要儀器有：ZNCL-DL-GX4型智能磁力攪拌器，河南愛博特科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；DU730型核酸蛋白分析儀，美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)；VERTEX 33型傅里葉紅外光譜儀，德國Bruker公司生產(chǎn)；CA620型全自動(dòng)凝血分析儀，日本Sysmex公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以硫酸酯化裂褶多糖的取代度為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，研究不同反應(yīng)溶劑、三氧化硫-吡啶與裂褶多糖的質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)硫酸酯化裂褶多糖取代度的影響。

1.3.1.1 反應(yīng)溶劑對(duì)取代度的影響

裂褶多糖硫酸酯化的方法參考文獻(xiàn)[15]，稍作修改。取100 mg干燥裂褶多糖于三角瓶中，分別加入15 mL吡啶、15 mL DMSO(二甲基亞砜)、15 mL DMF，干燥環(huán)境下浸潤12 h。按照三氧化硫-吡啶與多糖的質(zhì)量比為3加入三氧化硫-吡啶，在70 ℃水浴中反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入60 mL預(yù)冷蒸餾水，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5，經(jīng)醇沉、透析、冷凍干燥得硫酸酯化裂褶多糖，記為S-SPG。

1.3.1.2 三氧化硫-吡啶與裂褶多糖的質(zhì)量比對(duì)取代度的影響

固定反應(yīng)溶劑為DMF，反應(yīng)時(shí)間為3 h，反應(yīng)溫度為70 ℃，探究三氧化硫-吡啶與多糖的質(zhì)量比為2、2.5、3、3.5、4、4.5對(duì)S-SPG取代度的影響，其余步驟參考1.3.1.1節(jié)。

1.3.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)取代度的影響

固定反應(yīng)溶劑為DMF，三氧化硫-吡啶與多糖的質(zhì)量比為3，反應(yīng)時(shí)間為3 h，探究反應(yīng)溫度為50、60、70、80、90 ℃對(duì)S-SPG取代度的影響，其余步驟參考1.3.1.1節(jié)。

1.3.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)取代度的影響

固定反應(yīng)溶劑為DMF，三氧化硫-吡啶與多糖的質(zhì)量比為3，反應(yīng)溫度為70 ℃，探究反應(yīng)時(shí)間為1、2、3、4、5 h對(duì)S-SPG取代度的影響，其余步驟參考1.3.1.1節(jié)。

1.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken模型設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以取代度為響應(yīng)值進(jìn)行分析。3個(gè)因素分別為三氧化硫-吡啶復(fù)合物與裂褶的質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，分別對(duì)應(yīng)A、B、C。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)各因素的設(shè)計(jì)水平表如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及其水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.3 取代度測定

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

硫酸化裂褶多糖的取代度采用硫酸鋇比濁法測定。

y=0.787 1x-0.068 6

(1)

其相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.996 9。

1.3.3.2 樣品取代度的測定

精確稱取10 mg硫酸酯化裂褶多糖，采用10 mL 1 mol/L的HCl溶解，于105 ℃下水解8 h，用 1 mol/L 的HCl補(bǔ)足液體，0.45 μm過濾得1 g/L多糖儲(chǔ)備液。取200 μL S-SPG多糖溶液，按上述方法測定吸光值，得出多糖的硫酸基含量。根據(jù)式(2)計(jì)算取代度：

DS=1.62S/(32-1.02S)

(2)

式中，DS為S-SPG的取代度，S為S-SPG的含硫量。

1.3.4 S-SPG的制備

根據(jù)單因素和響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，制備3種不同取代度的硫酸酯化裂褶多糖，根據(jù)取代度的大小命名為S-SPG1、S-SPG2、S-SPG3。

1.3.5 SPG、S-SPG的組分分析

總糖含量采用硫酸-苯酚法測定；硫酸基含量及取代度按1.3.3節(jié)的步驟測定；蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.3.6 SPG、S-SPG的紅外光譜測定

取2 mg干燥樣品，與KBr混合均勻，并充分研磨成粉末，壓片，在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.3.7 SPG、S-SPG的掃描電鏡

取裂褶多糖、硫酸酯化裂褶多糖粘附于導(dǎo)電膠上，真空噴金，在高壓10 kV的條件下，分別在100、1 000的放大倍數(shù)下觀察多糖表面形貌并拍攝照片。

1.3.8 SPG、S-SPG2的13C NMR

取50 mg裂褶多糖、硫酸酯化裂褶多糖，重水反復(fù)凍溶2-3次，重水作為溶劑，采用5 mm的樣品管，檢測溫度為25 ℃，累加8 266次。

1.3.9 SPG、S-SPG的抗凝血活性測定

血漿制備：取成年家兔，心臟取血，按8%檸檬酸鈉與兔血的體積比1：9混合均勻，3 000 r/min離心15 min，收集上層血漿，-20 ℃保存，用前通過37 ℃水浴快速解凍，并離心除去下層沉淀。

待測樣品用0.9% NaCl溶解、稀釋。陽性對(duì)照為0.025 g/L的肝素鈉，空白對(duì)照為0.9% NaCl溶液。

試驗(yàn)中APTT試劑、0.025 mol/L CaCl2、TT試劑、PT試劑均需在37 ℃下孵育。

1.3.9.1 活化部分凝血酶時(shí)間

取450 μL血漿于玻璃試管中，加入50 μL不同濃度的樣品，混合均勻，將玻璃試管放入血凝儀。儀器自動(dòng)吸取50 μL混合血漿和50 μL APTT試劑，孵育3 min，加入50 μL 0.025 mol/L CaCl2溶液，混勻后儀器自動(dòng)記錄血漿凝固時(shí)間，即為APTT時(shí)間。

1.3.9.2 凝血酶時(shí)間

血漿制樣參照1.3.9.1節(jié)，儀器自動(dòng)吸取100 μL混合血漿，孵育2 min，加入100 μL TT試劑，混勻后儀器自動(dòng)記錄血漿凝固時(shí)間，即為TT時(shí)間。

1.3.9.3 凝血酶原時(shí)間

血漿制樣參照1.3.9.1節(jié)，儀器自動(dòng)吸取50 μL混合血漿，孵育2 min，加入100 μL TT試劑，混勻后儀器自動(dòng)記錄血漿凝固時(shí)間，即為PT時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1(a)所示，在吡啶、DMF和DMSO 3種反應(yīng)溶劑中，當(dāng)DMF作為反應(yīng)溶劑時(shí)，S-SPG的取代度最高，為1.32，故選擇DMF作為裂褶多糖硫酸酯化過程的反應(yīng)試劑。

如圖1(b)所示，隨著三氧化硫-吡啶與多糖質(zhì)量比的增大，S-SPG的取代度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在質(zhì)量比為4時(shí)，S-SPG的取代度最高，為1.85。三氧化硫-吡啶質(zhì)量的增加有利于多糖分子中羥基上的氫被硫酸基團(tuán)充分取代，但三氧化硫-吡啶的量增多，容易在溶劑中結(jié)團(tuán)，造成取代度降低。

如圖1(c)所示，當(dāng)溫度低于70 ℃時(shí)，S-SPG的取代度與溫度呈正相關(guān)，當(dāng)溫度超過70 ℃時(shí)，取代度與溫度呈負(fù)相關(guān)，70 ℃時(shí)取代度最高，為1.32。升溫有利于三氧化硫-吡啶分子在反應(yīng)溶劑中的擴(kuò)散，促進(jìn)酯化劑與多糖分子結(jié)合，加快反應(yīng)速率，有利于取代度的提高。但高溫會(huì)導(dǎo)致多糖降解，從而造成取代度降低。

如圖1(d)所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在1～3 h范圍內(nèi)時(shí)，S-SPG的取代度與時(shí)間呈正相關(guān)，反應(yīng)時(shí)間大于3 h時(shí)，取代度與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。反應(yīng)時(shí)間的延長有利于多糖與酯化劑的充分吸附和反應(yīng)，但長時(shí)間的高溫容易造成酯化劑的分解和多糖的降解，使取代度降低。

(a)反應(yīng)溶劑對(duì)取代度的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以取代度(Y)為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)關(guān)于三氧化硫-吡啶復(fù)合物與裂褶多糖的質(zhì)量比(A)、反應(yīng)溫度(B)以及反應(yīng)時(shí)間(C)的三因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。數(shù)據(jù)經(jīng)二次回歸分析，結(jié)果如表3所示。所得的數(shù)學(xué)模型為

表2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and result of Box-Behnken response surface experiment

Y=8.726A+0.244 95B+1.578C-2.5×10-3AB+

0.025AC-7.25×10-3BC-1.047A2-

1.517 5×10-3B2-0.191 75C2-27.092 5。

表3 回歸模型方差分析1)

2.2.2 交互作用分析

根據(jù)回歸方程得出的兩兩因素的響應(yīng)面和等高線圖如圖2所示。響應(yīng)面的曲面越陡峭，表明該因素對(duì)S-SPG取代度的影響越大；等高線圖呈橢圓形，表明兩個(gè)因素之間存在交互作用，否則交互作用可以忽略不計(jì)。從圖2可以看出，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間之間存在交互作用，其他兩組因素間不存在交互作用。

(a)三氧化硫-吡啶與裂褶多糖的質(zhì)量比和反應(yīng)溫度的響應(yīng)面圖

2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果論證

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得到的最優(yōu)條件為：三氧化硫-吡啶復(fù)合物與裂褶多糖的質(zhì)量比為4.12，反應(yīng)溫度為70.01 ℃，反應(yīng)時(shí)間為3.06 h，此時(shí)取代度最高，為1.87?？紤]到實(shí)際操作，調(diào)整反應(yīng)條件為三氧化硫-吡啶復(fù)合物與裂褶多糖的質(zhì)量比為4，反應(yīng)溫度為70 ℃，反應(yīng)時(shí)間為3 h。在修正的最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，反應(yīng)產(chǎn)物的取代度為1.85±0.03，與理論值較吻合。

2.3 SPG、S-SPG的組分分析

在單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用三氧化硫-吡啶法制備了3種不同取代度的硫酸酯化裂褶多糖，分別命名為S-SPG1、S-SPG2、S-SPG3。S-SPG1、S-SPG2、S-SPG3和SPG理化性質(zhì)的測定結(jié)果如表4所示。SPG的總糖含量為79.68%，含有微量的蛋白。在經(jīng)過硫酸酯化后，S-SPG的總糖含量隨著硫酸基含量的升高而降低，S-SPG1的總糖含量最高，為80.86%，硫酸基含量最低，為28.90%。S-SPG的硫酸基含量最高，為50.69%，總糖含量最低，為40.62%。所有的S-SPG組分均未檢測出蛋白。

表4 SPG、S-SPG硫酸基含量、取代度、總糖和蛋白含量測定2)Table 4 Determination of sulfate group content，degree of substitution，total sugar content，protein content for SPG and S-SPG

2.4 紅外光譜分析

圖3 SPG和S-SPG的紅外光譜譜圖

2.5 掃描電鏡分析

多糖經(jīng)化學(xué)修飾后，原有的空間結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞，掃描電鏡可用來分析多糖在化學(xué)修飾前后表面形態(tài)的變化。裂褶多糖及硫酸酯化裂褶多糖的表面形態(tài)如圖4所示。裂褶多糖呈溝壑狀，其表面呈多孔網(wǎng)狀；經(jīng)過硫酸化后，裂褶多糖的表面形貌發(fā)生了變化。S-SPG1呈片狀，表面光滑且存在不規(guī)則的小孔；S-SPG2呈片狀，表面不光滑，存在較多不規(guī)則的突起；S-SPG3則呈表面粗糙片狀。隨著取代度的增大，在500 μm范圍內(nèi)的S-SPG1、S-SPG2、S-SPG3表面片狀結(jié)構(gòu)逐漸減小，在50 μm范圍內(nèi)S-SPG1、S-SPG2、S-SPG3表面突起逐漸增多。S-SPG的表面形態(tài)與SPG間的差別表明了硫酸酯化修飾改變了裂褶多糖的表面結(jié)構(gòu)。這與之前Wang等[19]和Jing等[20]的研究結(jié)果一致，即經(jīng)過硫酸化修飾，生姜多糖和人工蛹蟲草表面形貌發(fā)生了變化。

(a)500 μm范圍內(nèi)，SPG

2.6 SPG、S-SPG2的13C NMR分析

根據(jù)多糖的化學(xué)位移規(guī)律和相關(guān)文獻(xiàn)[21]，在圖5(a)中，102.95、73.14、83.85、66.94、76.68、60.66處的信號(hào)峰對(duì)應(yīng)裂褶多糖β-(1→3)主鏈上的C1、C2、C3、C4、C5、C6；而103.27、74.09、67.73處則為β-(1→6)支鏈上的C1、C2、C4的信號(hào)峰，68.12處的小峰為主鏈上被支鏈取代的C6。研究表明，多糖羥基上的氫被硫酸基團(tuán)取代后，被取代的碳因與吸電子基團(tuán)(磺酰氧基)相連而向低場移動(dòng)[22- 23]。與SPG相比，S-SPG2(見圖5(b))在60.00附近信號(hào)峰的消失表明C6位已經(jīng)發(fā)生了完全取代，69.13處的信號(hào)峰為C6被硫酸基團(tuán)取代所產(chǎn)生的。若C2上羥基中的氫被取代，C1的信號(hào)峰會(huì)存在分裂[23]。S-SPG2 的C1在100.75處顯示信號(hào)分裂，在78.85處的信號(hào)峰可以歸屬為C2發(fā)生取代產(chǎn)生的共振偏移峰，表明S-SPG2中的C2發(fā)生了少量取代[24]。

(a)SPG

2.7 抗凝血活性分析

以0.025 g/L肝素鈉為陽性對(duì)照、0.9% NaCl為空白對(duì)照，通過APTT、TT、PT 3項(xiàng)凝血指標(biāo)來評(píng)價(jià)硫酸酯化對(duì)裂褶多糖抗凝血活性的影響。從 圖6 可以看出，空白對(duì)照組的APTT、TT、PT分別為(26.40±0.40)s、(12.85±0.05)s、(12.05±0.05)s，0.025 g/L肝素鈉的APTT((185.20±4.40)s)為空白對(duì)照的7.02倍，TT大于90 s，PT為(11.05±0.65)s。從圖6(a)中可以看出，SPG(0.5～4 g/L)對(duì)APTT和PT均沒有延長作用，而對(duì)TT有微弱的作用，但與質(zhì)量濃度無關(guān)。從圖6(b)-6(d)可以看出，S-SPG均以濃度依賴的形式對(duì)APTT、TT有明顯的延長作用。在質(zhì)量濃度為0.2 g/L時(shí)，S-SPG1、S-SPG2、S-SPG3的APTT分別為(76.40±1.70)s、(98.70±2.40)s和(184.35±1.55)s，TT分別為(43.85±3.95)s、(77.10±0.10)s、>90 s。裂褶多糖經(jīng)硫酸化后具有較強(qiáng)的抗凝血活性，但比肝素鈉的凝血活性弱，在APTT和TT試驗(yàn)中需要更高的濃度才能達(dá)到肝素鈉的凝血效果。

(a)SPG對(duì)APTT、TT、PT的影響

裂褶多糖經(jīng)硫酸酯化后具有延長APTT、TT的活性，缺乏對(duì)PT的延長活性，表明S-SPG主要是通過內(nèi)源性凝血途徑來影響血漿的凝固過程，而非外源性凝血途徑[25- 26]，這與其他硫酸化多糖的凝血途徑相似[27- 28]。Chaouch等[7]的抗凝血試驗(yàn)表明硫酸酯化可顯著增強(qiáng)仙人掌果膠多糖的抗凝活性，且其通過延長APTT和TT來體現(xiàn)其抗凝活性。研究表明，硫酸酯化多糖的抗凝血活性與其取代度之間存在正相關(guān)關(guān)系，取代度高的多糖的抗凝血活性更好。在本實(shí)驗(yàn)中，相較于S-SPG1(DS=0.70)和S-SPG2(DS=1.25)，S-SPG3(DS=1.85)在APTT和TT試驗(yàn)中展現(xiàn)出更好的抗凝血活性。在APTT、TT試驗(yàn)中，取代度的增大能夠提高抗凝血活性，表明硫酸基含量是影響抗凝血活性的重要指標(biāo)。這可能是由于高取代度的硫酸改性多糖具有高負(fù)電荷密度，能夠與血漿中帶正電荷的氨基酸殘基結(jié)合，從而提高抗凝血活性[28]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過三氧化硫-吡啶法制備硫酸酯化裂褶多糖。響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳工藝條件為：三氧化硫-吡啶復(fù)合物與裂褶多糖的質(zhì)量比為4，反應(yīng)溫度為70 ℃，反應(yīng)時(shí)間為3 h。最佳工藝條件下制備的硫酸酯化裂褶多糖的取代度為1.85。FT-IR分析表明，S-SPG出現(xiàn)了與硫酸基團(tuán)相關(guān)的特征吸收峰，表明硫酸酯化是成功的；掃描電鏡的結(jié)果表明裂褶多糖經(jīng)硫酸酯化后，其表面形貌發(fā)生了變化；13C NMR的結(jié)果表明，S-SPG2的C6位發(fā)生了完全取代，C2位發(fā)生了部分取代；經(jīng)典凝血試驗(yàn)的結(jié)果表明硫酸酯化能使裂褶多糖獲得較強(qiáng)的抗凝血活性，且取代度是影響抗凝血活性的重要因素；此外，S-SPG是通過抑制內(nèi)源性凝血過程來延長凝血時(shí)間的。因此，硫酸酯化裂褶多糖是一種很有前景的抗凝劑。該研究初步探究了硫酸酯化裂褶多糖的抗凝活性與取代度之間的關(guān)系，但硫酸酯化裂褶多糖抗凝活性的詳細(xì)機(jī)理還值得進(jìn)一步研究。