覃 薇, 殷梓辛, 華維維, 王玉潔, 王 楊,鄧嘉林, 蔡曌穎, 錢亞云, 2

(1. 揚州大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚州, 225001;2. 國家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室, 江蘇 揚州, 225001)

胃癌(GC)[1]為全球發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤之一，早期癥狀難以察覺，多數(shù)患者確診時已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶甚至進(jìn)展為晚期。胃癌的治療主要依賴化療和放療，但腫瘤細(xì)胞的耐藥性以及化療的毒副作用會嚴(yán)重影響治療效果，降低患者生活質(zhì)量[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[3-4]表明，中藥聯(lián)合用藥治療腫瘤可提高放化療的有效性，減輕副作用，調(diào)節(jié)免疫力，很大程度上提高腫瘤患者生存質(zhì)量。通關(guān)藤[Marsdeniatenacissima(Roxb.)Wight et Arn.,MT]又稱烏骨藤，主要產(chǎn)于中國云南省，味苦，微寒，歸肺經(jīng)，具有止咳平喘、祛痰、清熱解毒的功效[5]?，F(xiàn)代中藥研究[6]中, MT被證實具有抗癌、平喘、抑菌、保肝、利尿及免疫調(diào)節(jié)的作用，其制劑消癌平注射液已被廣泛應(yīng)用于臨床，并取得良好治療效果。本研究探討MT的具體抗癌活性物質(zhì)及分子作用機制，以期更好地指導(dǎo)臨床用藥。

1 資料與方法

1.1 MT的活性成分與靶點篩選

在Pubmed、知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫等中英文檢索平臺輸入關(guān)鍵詞“通關(guān)藤” “烏骨藤”“Marsdeniatenacissima”, 獲取通關(guān)藤相關(guān)活性成分，并通過Chemical Book、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫、化源網(wǎng)分別對活性成分相關(guān)信息、化合物結(jié)構(gòu)、CAS號進(jìn)行補充及篩選，用PubChem確認(rèn)活性成分的結(jié)構(gòu)及名稱，得到通關(guān)藤候選活性成分。Swiss ADME中，化合物符合Lipinski[21]、Ghose[22]、Veber[23]、Egan[24]、Muegge[25]中2種及以上的類藥性原則，則被視為具有較好的成藥潛力; 腸胃吸收(gatrointestinal absortion, GI absortion) 結(jié)果為“High”[26], 則表示該化合物具有較好的口服生物利用度。以同時具有較好成藥潛力及口服生物利用度為標(biāo)準(zhǔn)[27], 篩選出MT有效活性成分。將MT有效活性成分SMILES格式文件分別導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，每個活性成分取前100個“probability”值大于0的潛在作用靶點，匯總后得到MT活性成分靶點，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一規(guī)范為基因名。資料收集與處理使用的網(wǎng)站及數(shù)據(jù)庫見表1。

表1 網(wǎng)站及數(shù)據(jù)庫匯總

1.2 GC相關(guān)靶點搜集及共同靶點獲取

在DrugBank、OMIM、TTD、GeneCards等數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“gastric cancer”, 得到GC相關(guān)靶點，并采用Uniprot規(guī)范為基因名。將MT與GC基因名取交集后得到交集基因，由Cytoscape構(gòu)建可視化“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

將交集基因?qū)隨tring，以Interaction score>0.9篩選交集基因，并剔除游離基因，得到關(guān)鍵基因，作PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出為tsv(*. tsv)文件并使用Cytoscape打開，構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖，使用MCC算法篩選前10個核心基因(Hub Gene)。

1.4 分子對接

為了驗證Hub Gene，本研究通過分子對接技術(shù)來探討活性成分與基因蛋白的相互結(jié)合作用。MT關(guān)鍵成分中, Kaempferol及Caffeic acid已有大量抗腫瘤的實驗研究基礎(chǔ)，因此，選擇Kaempferol及Caffeic acid分別與9個Hub Gene小分子蛋白(其中RHOA未檢索到其pdb格式文件，不予納入)進(jìn)行分子對接。對接蛋白核心結(jié)構(gòu)的pdb文件格式(*. pdb)下載于RCSB PDB數(shù)據(jù)庫: SRC[1CSK(PDB ID，下同)]、PIK3CA(6GVF)、PIK3R1(3HHM)、EGFR(3IKA)、ERBB2(2A91)、VEGFA(6T9D)、GRB2(1JYU)、PTK2(6I8Z)、10HSP90AA1(5NJX); 使用PyMOL對蛋白進(jìn)行去水、去除有機物等處理。在ZINC平臺下載活性化合物MOL2格式文件，PyMOL轉(zhuǎn)換為pdb格式，運行AutoDock和AutodockTools，獲取對接最低結(jié)合能，根據(jù)對接結(jié)果篩選出最具可能性的蛋白結(jié)合位點。

1.5 富集分析

基于前10個Hub Gene做富集分析。利用DAVID網(wǎng)站中的基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)相關(guān)數(shù)據(jù)庫對其相關(guān)生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行富集分析與整合，建立數(shù)據(jù)文件。

根據(jù)P<0.05確定KEGG中涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并根據(jù)P值大小取前20條繪制氣泡圖，采用Cytoscape制作通路-靶點可視化網(wǎng)絡(luò)圖。確定BP、CC、MF涉及的相關(guān)條目，各選取前20條結(jié)果繪制條形圖。

2 結(jié) 果

2.1 活性成分獲取

根據(jù)數(shù)據(jù)庫篩選出33個MT有效活性成分，候選活性成分中，由于Tenacissoside A、H、I有大量文獻(xiàn)支持，故將此3種成分也納入后續(xù)研究，得到總有效活性成分36個，見表2。

表2 MT有效活性成分

2.2 MT活性成分及GC潛在靶點獲取

共得到MT活性成分潛在靶點499個, GC相關(guān)靶點871個，名稱轉(zhuǎn)換為基因名后利用Venn圖取交集得到130個交集基因，見圖1。

圖1 交集基因Venn圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

String數(shù)據(jù)庫共篩選出116個關(guān)鍵基因，制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并由Cytoscape可視化制作“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2), Kaempferol、Tenasogenin、Drevogenin A等在MT抗GC作用中最突出。由MCC篩選的10個Hub Gene中(見圖3),SRC、PIK3CA、PIK3R1與MT治療GC作用機制的相關(guān)度較高。

A: String PPI網(wǎng)絡(luò)圖; B: “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖

圖3 Hub Gene篩選圖

2.4 分子對接

分子對接的最低結(jié)合能見表3, 根據(jù)表3絕對值作雷達(dá)圖將數(shù)據(jù)可視化，可以看出SRC、PTK2分別與Kaempferol及Caffeic acid對接最穩(wěn)定，見圖4。圖5為蛋白位點結(jié)合模擬圖，充分說明了MT對GC的穩(wěn)定作用。

表3 最低結(jié)合自由能 kcal/mol

圖4 分子對接數(shù)據(jù)可視化雷達(dá)圖

A: SRC與Kaempferol在THR-42、ASP-27、THR-23、TRP-47、ASP-44位點結(jié)合; B: SRC與Caffeic acid在LYS-43、LYS-67、ARG-68位點結(jié)合; C: PTK2與Kaempferol在ARG-550、PRO-585、ASN-628、LEU-584位點結(jié)合; D: PTK2與Caffeic acid在CYS-502、ASP-564、ILE-428位點結(jié)合。圖5 分子對接蛋白位點結(jié)合圖

2.5 富集分析

KEGG富集分析預(yù)測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路57條，主要涉及ErbB、VEGF、EGFR、PI3K/Akt等，與以上信號通路最相關(guān)的基因為PIK3CA、PIK3R1、EGFR、ERBB2、GRB2(見圖6)。

A: KEGG通路富集分析氣泡圖; B: 通路-靶點可視化網(wǎng)絡(luò)圖。圖6 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析

GO富集預(yù)測BP相關(guān)條目62個, CC相關(guān)條目16個, MF相關(guān)條目24個，各選取前20條繪制條形圖(見圖7)。MT抗GC作用過程與酪氨酸激酶受體2(ERBB2)信號通路、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)信號通路、表皮生長因子受體(EGFR)信號通路、黏著斑等相關(guān)，其中可能涉及細(xì)胞質(zhì)膜(plasma membrane)、頂端質(zhì)膜(apical plasma membrane)、質(zhì)膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的外源成分(extrinsic component of cytoplasmic side of plasma membrane)等CC, 并受Ⅰ型磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶(phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3-kinase activity)、蛋白磷酸酶結(jié)合(protein phosphatase binding)、蛋白酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)等MF的影響。

A: GO-BP; B: GO-CC; C: GO-MF。圖7 GO富集分析

3 討 論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，整體評價MT與GC的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并預(yù)測了MT作用于GC的分子機制。本研究通過搜索文獻(xiàn)及平臺大數(shù)據(jù)篩選并確定MT活性成分36種，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度值較大的Kaempferol、Tenacissoside H、Scopoletin、Caffeic acid等均可能在后續(xù)研發(fā)抗腫瘤新藥的過程中成為先導(dǎo)化合物。大量藥理研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), Kaempferol[37]具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用, Tenacissoside H[38-39]可通過影響PI3K/Akt/mTOR 信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬, Scopoletin[40]具有抗氧化和抗炎特性，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬上發(fā)揮重要作用, Caffeic acid[41]可直接靶向Erk1/2以降低癌癥發(fā)生率，這提示MT治療GC的機制可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡與自噬最為相關(guān)。

116個關(guān)鍵基因中通過MCC算法篩選出Hub Gene 10個，其中PTK2是非受體蛋白酪氨酸激酶，又叫黏著斑激酶(FAK), 可激活PI3K/Akt通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移[42];SRC能影響Ras/Raf/MEK/ERK及SRC/FAK通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長分化及遷移[43-44]; 此外,PIK3CA也參與調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路影響腫瘤生成[45]。

GO富集分析中，VEGFR相關(guān)信號通路在BP富集較高，影響MT抗GC的主要生物過程，臨床已有針對VEGFR的治療藥物—單克隆抗體雷莫蘆及酪氨酸激酶抑制藥阿帕替尼，用于延長患者生存時間[46-47]; 帕尼單抗、西妥昔單抗及尼妥珠單抗則可作用于另一富集較高的EGFR抑制胃癌進(jìn)展[48]。BP高富集的ERBB2可能對開發(fā)新靶向藥物具有指導(dǎo)意義。MF富集較高的蛋白酪氨酸激酶活性相關(guān)抑制藥物已被應(yīng)用于臨床[47], 蛋白磷酸酶結(jié)合過程及Ⅰ型磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶也可能成為新藥研發(fā)的突破點。結(jié)合KEGG富集, MT可能通過影響PI3K/AKT、Ras/Raf/MEK/ERK、SRC/FAK等信號通路抑制GC的發(fā)生與發(fā)展。分子對接結(jié)果驗證了MT活性成分Kaempferol及Caffeic acid能夠與SRC、PTK2、HSP90AA1、PIK3CA、PIK3R1、EGFR、ERBB2、VEGFA、GRB2等受體蛋白自發(fā)結(jié)合，充分說明了預(yù)測結(jié)果的可信性。

目前，化療仍是晚期GC的主要治療手段，而腫瘤細(xì)胞耐藥及胃癌特效藥缺乏是近年來急需突破的難點，中藥聯(lián)合化療可增效減毒，提高患者生活質(zhì)量。MT制劑現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于肝癌、肺癌、胃癌、食管癌的聯(lián)合化療，對其活性成分進(jìn)行研究不僅能為后續(xù)相關(guān)藥理研究提供理論基礎(chǔ)，還可能為GC相關(guān)通路中蛋白調(diào)節(jié)提供新的研究方向，對中晚期GC臨床用藥具有指導(dǎo)意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為兼具系統(tǒng)層次及生物網(wǎng)絡(luò)的新興學(xué)科，對臨床用藥指導(dǎo)及新藥研發(fā)產(chǎn)生了巨大影響，但其分析過程中存在較多不確定性[49], 因此本研究尚需進(jìn)行蛋白水平實驗、細(xì)胞模型實驗、動物模型實驗及臨床試驗對MT治療GC分子機制加以驗證[50], 以完善本藥物理論研究。