彭憲星, 王遠波, 孫啟朋

(棗莊礦業(yè)集團中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科一病區(qū), 山東 棗莊, 277000)

動脈粥樣硬化(AS)是一種常見的高發(fā)病率、高死亡率的心血管疾病，是冠心病、心肌梗死和周圍血管疾病的主要病因[1]。內(nèi)皮細胞在維持血管系統(tǒng)的動態(tài)平衡中起著重要作用，其損傷和功能障礙是AS的早期標志。在高血壓、高血脂等因素刺激下，內(nèi)皮細胞表達的黏附分子可促進氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的局部積累，誘導促炎反應、氧化應激和內(nèi)皮細胞凋亡，最終導致AS斑塊形成。因此，闡明ox-LDL介導血管內(nèi)皮細胞凋亡的分子機制對開發(fā)有效的AS治療方法意義重大。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是序列高度保守、長度大于200 nt的RNA轉(zhuǎn)錄本，其通過染色質(zhì)重塑、剪切調(diào)控、吸附微小RNA(miRNA)等多種機制參與基因表達調(diào)控，在癌癥、心血管疾病等病理過程中具有重要作用[2-3]。研究[4-5]顯示, lncRNA DDX11反義RNA 1(DDX11-AS1)在肝癌、結(jié)腸癌中表達上調(diào)，其通過調(diào)控細胞增殖和凋亡對癌癥進展具有促進作用。miR-627-3p已被證實[6]在骨肉瘤等惡性腫瘤中具有抑癌作用，上調(diào)miR-627-3p表達可抑制腫瘤形成。靶基因預測顯示miR-627-3p是DDX11-AS1的潛在靶點，但DDX11-AS1是否靶向miR-627-3p調(diào)控AS進展并不清楚。本研究分析ox-LDL誘導后，人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)中DDX11-AS1、miR-627-3p表達水平，探討DDX11-AS1參與HUVEC增殖和凋亡的分子機制，以期為AS防治提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

HUVEC購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏中心; 杜爾伯格伊戈爾培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、ox-LDL購自美國Sigma公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green master mix購自大連寶生物科技公司; 兩步法miRNA熒光定量聚合酶鏈反應檢測試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司; DDX11-AS1過表達質(zhì)粒(pcDNA-DDX11-AS1)及其對照(pcDNA-con)、miR-627-3p抑制物(anti-miR-627-3p)及其對照(anti-miR-con)、DDX11-AS1小干擾RNA(si-DDX11-AS1)及其對照(si-con)、miR-627-3p模擬物(miR-627-3p mimics)及其對照(miR-con)、熒光素酶報告載體購自上海凱基生物公司; 細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)、TRIzol試劑、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin-V-FITC/PI)試劑盒、放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解緩沖液購自北京索萊寶生物公司; 兔源細胞周期素D1(CyclinD1)、核因кB(NF-кB)、p65亞基(p-p65)、裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase-3)單克隆抗體購自上海艾博抗生物技術(shù)公司; 兔源磷酸化的NF-кB抑制蛋白α(p-IкBα)抗體、羊抗兔IgG二抗購自上海賽信通生物技術(shù)公司。

1.2 動脈粥樣硬化細胞模型構(gòu)建

HUVEC用添加10%的胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用50 μg/mL的ox-LDL刺激HUVEC 48 h, 構(gòu)建動脈粥樣硬化細胞模型。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測LncRNA DDX11-AS1和miR-627-3p的表達

用TRIzol試劑分離HUVEC中總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green master mix進行反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR反應。使用兩步法miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒測定miR-627-3p表達水平。分別以β-actin、U6為內(nèi)參, 2-ΔΔCt法分析DDX11-AS1、miR-627-3p相對表達水平。DDX11-AS1引物序列: 上游5′-CAGCAACCTTTCTGGGAAGC-3′, 下游5′-ACAAG AGCTGAGCTTGTCTTT-3′。miR-627-3p引物序列: 上游5′-CACTCATCTTTTCTTTG-3′, 下游5′-GAGTCTCTTGAGAGT ACAT-3′。U6引物序列: 上游5′-CTCGCTTCGGCAGCA CA-3′, 下游5′-ACGCTTCACGAATTTGC-3′。β-actin引物序列: 上游5′-TCAC CCACACTGT GCCCATCTACGA-3′, 下游5′-CAGCGGAACCGCTC ATTGCCAATGG-3′。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染和實驗分組

將對數(shù)期HUVEC接種96孔板，用Lipofectamine 2000將pcDNA-con、pcDNA-DDX11-AS1、anti-miR-con、anti-miR-627-3p、pcDNA-DDX11-AS1+miR-con、pcDNA-DDX11-AS1+miR-627-3p mimics分別轉(zhuǎn)染HUVEC細胞, 48 h后用50 μg/mL的ox-LDL刺激HUVEC 48 h, 依次記為ox-LDL+pcDNA-con組、ox-LDL+ pcDNA-DDX11-AS1組、ox-LDL+anti-miR-con組、ox-LDL+ anti-miR-627-3p組、ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+ miR-con組、ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+miR-627-3p組。收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖

將轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的HUVEC(3×103個/孔)接種到96孔板，設置3個重復。采用50 μg/mL的ox-LDL孵育48 h, 按10 μL/孔加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。酶標儀檢測450 nm處光密度(OD)值。細胞存活率=(實驗組OD-對照組OD)×100%

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

ox-LDL刺激48 h后，胰蛋白酶消化，結(jié)合緩沖液重懸各組HUVEC。分別加入5 μL的Annexin V-FITC、PI, 室溫下于黑暗環(huán)境中染色15 min, 流式細胞儀檢測凋亡細胞。以早期(Annexin V-FITC染色, PI染色陰性)和晚期凋亡率(Annexin V-FITC和PI染色均為陽性)之和表示細胞凋亡率。

1.7 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測Cleaved-caspase-3、p-p65、CyclinD1和p-IкBα蛋白表達水平

使用RIPA裂解緩沖液裂解各組HUVEC。聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白質(zhì)，然后進行濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶緩沖液25 ℃孵育膜1 h以防止非特異性結(jié)合。然后加入一抗溶液4 ℃孵育過夜，二抗溶液室溫孵育1 h后，使用增強型化學發(fā)光試劑檢測膜中的蛋白條帶。Image J軟件分析目的條帶相對灰度值。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

LncBase Predicted v.2在線預測miR-627-3p與DDX11-AS1之間存在潛在互補序列。將含有miR-627-3p結(jié)合位點的DDX11-AS1序列插入pmirGLO熒光素酶報告載體構(gòu)建野生型(WT)DDX11-AS1報告載體(DDX11-AS1-WT), 同時通過突變(MUT)miR-627-3p的結(jié)合位點得到相應的突變體(DDX11-AS1-MUT)。用DDX11-AS1-WT、DDX11-AS1-MUT分別與miR-con、miR-627-3p共轉(zhuǎn)染HUVEC, 熒光素酶活性分析試劑盒檢測轉(zhuǎn)染48 h后熒光素酶活性。為證實DDX11-AS1對miR-627-3p的調(diào)控作用，將pcDNA-con、pcDNA-DDX11-AS1、si-con、si-DDX11-AS1分別轉(zhuǎn)染HUVEC, RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染48 h后miR-627-3p表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 ox-LDL處理的HUVEC中LncRNADDX11-AS1、miR-627-3p的表達情況

ox-LDL處理48 h后, RT-qPCR檢測HUVEC中LncRNA DDX11-AS1和miR-627-3p表達, ox-LDL組HUVEC細胞中LncRNA DDX11-AS1表達水平低于對照組, miR-627-3p表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ox-LDL處理的HUVEC中LncRNA DDX11-AS1、miR-627-3p的表達情況

2.2 上調(diào)DDX11-AS1表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

CCK-8、流式細胞術(shù)、RT-qPCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較, ox-LDL組HUVEC存活率、DDX11-AS1表達水平、CyclinD1蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與ox-LDL+pcDNA-con組比較, ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1組HUVEC存活率、DDX11-AS1表達水平、CyclinD1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明上調(diào)DDX11-AS1表達可抑制OX-LDL誘導的HUVEC凋亡，促進細胞增殖。見圖1、表2。

A: 流式細胞儀檢測細胞凋亡圖; B: Western blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達; C: CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達的柱狀統(tǒng)計圖。與對照組比較, ?P<0.05; 與ox-LDL+pcDNA-con組比較, #P<0.05。圖1 上調(diào)DDX11-AS1表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

表2 上調(diào)DDX11-AS1表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

2.3 下調(diào)miR-627-3p表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

CCK-8、流式細胞術(shù)、RT-qPCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，與ox-LDL+anti-miR-con組比較, ox-LDL+anti-miR-627-3p組HUVEC凋亡率、miR-627-3p表達水平、Cleaved-caspase-3蛋白表達降低，存活率和CyclinD1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明下調(diào)miR-627-3p表達可抑制ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，促進細胞增殖。見圖2、表3。

A: 流式細胞儀檢測細胞凋亡圖; B: Western blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達; C: CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達的柱狀統(tǒng)計圖。與ox-LDL+anti-miR-con組比較, ?P<0.05。圖2 下調(diào)miR-627-3p表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

表3 下調(diào)miR-627-3p表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

2.4 LncRNA DDX11-AS1靶向miR-627-3p

LncBase Predicted v.2預測到miR-627-3p與LncRNA DDX11-AS1存在特異結(jié)合位點，見圖3。雙熒光素酶活性檢測顯示，與轉(zhuǎn)染miR-con比較，轉(zhuǎn)染miR-627-3p mimics可降低DDX11-AS1-WT的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而對DDX11-AS1--MUT的熒光素酶活性無顯著影響，見表4。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示, pcDNA-DDX11-AS1組HUVEC中miR-627-3p表達水平較pcDNA-con組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); si-DDX11-AS1組HUVEC中miR-627-3p表達水平較si-con組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。表明DDX11-AS1靶向負性調(diào)控miR-627-3p表達。

圖3 LncRNA DDX11-AS1靶向miR-627-3p

表4 雙熒光素酶活性檢測

表5 RT-qPCR檢測miR-627-3p的表達

2.5 上調(diào)miR-627-3p表達可以逆轉(zhuǎn)DDX11-AS1上調(diào)對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

CCK-8、流式細胞術(shù)、RT-qPCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，與ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+miR-con組比較, ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+ miR-627-3p組HUVEC凋亡率、miR-627-3p表達水平、Cleaved-caspase-3蛋白表達升高，存活率和CyclinD1蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、表6。表明上調(diào)miR-627-3p表達可逆轉(zhuǎn)DDX11-AS1上調(diào)對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響。

A: 流式細胞儀檢測細胞凋亡圖; B: Western blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達; C: CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達的柱狀統(tǒng)計圖。與ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+miR-con組比較, ?P<0.05。圖4 上調(diào)miR-627-3p表達可以逆轉(zhuǎn)DDX11-AS1上調(diào)對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

表6 上調(diào)miR-627-3p表達可以逆轉(zhuǎn)DDX11-AS1上調(diào)對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

2.6 NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較, ox-LDL組HUVEC細胞中p-p65和p-IкBα表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與ox-LDL+pcDNA-con組比較, ox-LDL+ pcDNA-DDX11-AS1組HUVEC細胞中p-p65和p-IкBα表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+miR-con組比較, ox-LDL+ pcDNA-DDX11-AS1+miR-627-3p組HUVEC細胞中p-p65和p-IкBα表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5、表7。表明DDX11-AS1靶向miR-627-3p在AS進展中的作用可能與抑制NF-κB途徑有關(guān)。

A: Western blot檢測p-p65、p-IкBα蛋白的表達; B: p-p65、p-IкBα蛋白表達的柱狀統(tǒng)計圖。與對照組比較, ?P<0.05; 與ox-LDL+pcDNA-con組比較, #P<0.05; 與ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+miR-con組比較, &P<0.05。圖5 NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達

表7 NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達

3 討 論

研究[7]表明, lncRNA參與包括心血管疾病在內(nèi)的多種人類疾病的病理生理過程。本研究旨在闡明AS中DDX11-AS1對血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響及其分子機制。

DDX11-AS1位于染色體12p11.21位點，與胃癌、膀胱癌進展密切相關(guān)[8-10]。研究[8]顯示, DDX11-AS1在胃癌組織和細胞中表達升高，下調(diào)DDX11-AS1表達，顯著降低胃癌細胞的增殖和克隆形成能力，誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡。DDX11-AS1通過靶向miR-326調(diào)節(jié)奧沙利鉑耐藥胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡[9]。此外, DDX11-AS1通過直接與miR-499b-5p促進腫瘤生長，進而加劇膀胱癌進展[10]。這些研究表明DDX11-AS1在人類疾病中起重要作用。本研究顯示, ox-LDL刺激HUVEC存活率顯著降低，凋亡率顯著升高，這與霍鑫等[11]報道一致。同時，本研究顯示ox-LDL刺激降低DDX11-AS1水平，提示DDX11-AS1低表達可能參與ox-LDL誘導的HUVEC損傷。功能分析顯示，上調(diào)DDX11-AS1可減輕ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，下調(diào)促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表達，上調(diào)CyclinD1蛋白表達，提高細胞存活率。以上結(jié)果提示，上調(diào)DDX11-AS1表達可抑制ox-LDL誘導的HUVEC損傷，抑制AS發(fā)生發(fā)展。

研究[12-13]表明, lncRNAs通過與特異性miRNA結(jié)合調(diào)節(jié)下游靶基因表達參與膽固醇代謝、血管內(nèi)皮細胞凋亡、炎癥反應等AS進展的多個生物學過程。miR-627-3p在肺癌中具有抑癌功能，敲除lncRNA RP11-284F21.9, 通過上調(diào)miR-627-3p可抑制肺癌腫瘤形成[14]。本研究顯示, ox-LDL刺激后HUVEC中miR-627-3p表達顯著升高，轉(zhuǎn)染anti-miR-627-3p下調(diào)miR-627-3p表達，可抑制ox-LDL誘導的HUVEC存活率下降和細胞凋亡，促進CyclinD1表達，抑制Cleaved-caspase-3表達，與上調(diào)DDX11-AS1表達的作用一致。采用雙熒光素酶報告基因和RT-qPCR檢測進一步驗證二者關(guān)系發(fā)現(xiàn), DDX11-AS1對miR-627-3p具有靶向負調(diào)控作用。此外，上調(diào)miR-627-3p表達，還可逆轉(zhuǎn)DDX11-AS1上調(diào)對ox-LDL處理的HUVEC增殖、凋亡的影響，這進一步說明DDX11-AS1通過靶向miR-627-3p抑制ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，促進細胞增殖，抑制AS進展。

NF-κB是炎癥和免疫穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑，其激活可誘導促炎因子表達、內(nèi)皮損傷和脂質(zhì)沉積，從而導致AS的形成和進展[15-16]。本研究顯示, ox-LDL刺激可抑制p65和IкBα的磷酸化，上調(diào)DDX11-AS1表達，則降低ox-LDL對p65和IкBα磷酸化的影響，而上調(diào)miR-627-3p表達，可逆轉(zhuǎn)DDX11-AS1上調(diào)的作用。以上研究說明, DDX11-AS1靶向miR-627-3p在AS進展中的作用可能與抑制NF-κB途徑有關(guān)。

綜上所述, LncRNA DDX11-AS1通過靶向miR-627-3p能夠抑制ox-LDL誘導HUVEC凋亡，促進細胞增殖，其機制可能與抑制NF-κB途徑有關(guān)。因此，靶向DDX11-AS1/miR-627-3p有望成為臨床防治AS的重要策略。