王晶晶，陳書強(qiáng)，董 杰，雷 暉，王曉紅

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，陜西西安 710038

微波通常指頻率為300 MHz～ 300 GHz 的電磁波，是一種非電離性電磁輻射。既往研究表明，微波輻射所屬的電磁波區(qū)域是輻射產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵區(qū)域[1]。微波技術(shù)在國防、通訊、醫(yī)療和日常生活等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用(雷達(dá)L 波段1～2 GHz、S 波段2～ 4 GHz，手機(jī)1.8～ 2 GHz，微波爐915～ 2 450 MHz)，在給人們工作生活帶來便利的同時，也對人們的健康造成了潛在危害。卵巢是女性的重要生殖腺，也是微波輻射作用敏感的靶器官之一[2]。有研究報道，不同頻率的微波輻射可以影響生殖細(xì)胞的形態(tài)、功能以及細(xì)胞的凋亡，高頻微波輻射可以明顯增加不孕不育風(fēng)險，甚至導(dǎo)致死胎、畸胎、流產(chǎn)和發(fā)育畸形[3-5]。目前微波輻射及其生殖損傷的研究主要集中在男性，對女性的研究相對較少，微波輻射對女性生殖系統(tǒng)的損傷是亟須解決的一個重要問題。本研究主要探討2 GHz(屬于S 波段雷達(dá)和手機(jī)的工作頻率)微波輻射暴露對雌性小鼠卵巢及功能的近期影響。

材料與方法

1 實驗動物 ICR 小鼠64 只購自西安交通大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在23℃左右，濕度保持在50%左右，飼料為Co60照射的全價營養(yǎng)飼料。室內(nèi)照明采用12 h/12 h 明暗交替。

2 實驗分組 將64 只性成熟雌性ICR 小鼠按照輻射強(qiáng)度隨機(jī)分為4 組，每組16 只，對照組不進(jìn)行輻射(0 w/m2)。輻射組采用高功率連續(xù)波微波輻射裝置(由西北核技術(shù)研究所提供。信號源：美國安捷倫Agilent 公司；功率放大器：德國波恩BONN 公司)，頻率設(shè)置為2 GHz(屬于雷達(dá)S 波段和手機(jī)的工作頻率)，設(shè)置3個輻射梯度：0.5 w/m2(低劑量組)，1.5 w/m2(中劑量組)，2.5 w/m2(高劑量組)。每天固定在8：00 -9：00 進(jìn)行1 h 輻射，連續(xù)輻射14 d。

3 血清激素水平檢測 連續(xù)微波輻射14 d 后，每組隨機(jī)選擇6 只雌鼠稱重，之后取雌鼠眼球血置于1.5 mL 的EP 管中，室溫靜置6 h，3 000 r/min離心10 min，取上清移至新的潔凈EP 管中，于-80℃保存。按照試劑盒說明書(武漢賽培生物)，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 檢測雌鼠血清促卵泡激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體激素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)水平。

4 卵巢指數(shù)分析及卵巢HE 染色 脫頸法處死雌鼠，分離卵巢組織，用濾紙吸干表面水分后稱重。卵巢指數(shù)=卵巢重量(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。一側(cè)卵巢置于3%多聚甲醛中固定24 h，之后包埋切片并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE 染色)，分析卵巢的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

5 卵巢氧化應(yīng)激水平檢測 另一側(cè)卵巢進(jìn)行勻漿，按照試劑盒步驟(南京建成生物)，通過化學(xué)比色法，檢測卵巢組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)的活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度。

6 子宮指數(shù)分析及相關(guān)因子檢測 分離子宮，用濾紙吸干表面水分后稱重。子宮指數(shù)=子宮重量(mg)/體 質(zhì) 量(g)×100%。采 用qRT-PCR 檢 測 小鼠子宮中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 及血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取子宮組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin 作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因在mRNA 相對表達(dá)水平，引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 基因引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

7 定點(diǎn)交配 輻射14 d 后，將各組剩余的10 只雌性小鼠，與既往曾交配過的正常雄性小鼠(9 周齡) 合籠(雌雄比例=2∶1)。次日上午8：00 左右觀察雌鼠陰道口是否出現(xiàn)陰栓，如觀察到陰栓則視為交配成功，記作妊娠0.5 d。若未見陰栓，可于下午5：00 左右繼續(xù)合籠交配，持續(xù)1 周。

8 雌鼠生育力評估 妊娠18.5 d 后將孕鼠脫頸法處死，解剖后記錄每只孕鼠窩仔數(shù)，并統(tǒng)計受孕率(受孕數(shù)/雌鼠總數(shù))。根據(jù)胎鼠肛門與生殖器的距離以及形態(tài)鑒別子代性別(雌鼠肛門距生殖器較近，肛門和生殖器之間形態(tài)為縫狀；雄鼠肛門距生殖器較遠(yuǎn)，肛門和生殖器之間形態(tài)為柱狀)。

9 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以表示，多組間行單因素方差分析，兩兩比較采用HSD-q檢驗；計數(shù)資料用率(%) 表示，進(jìn)行χ2檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 微波輻射暴露對雌鼠激素水平的影響 比較四組雌鼠的性激素水平，LH 和FSH 水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。E2及卵巢指數(shù)均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。與對照組相比，3個暴露組的血清LH、FSH 水平略有升高，但差異無統(tǒng)計意義(P＞0.05)，高劑量組血清E2及卵巢指數(shù)明顯降低，和其他各組的差異多有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 微波輻射暴露對雌鼠激素水平的影響(n=6)Tab.2 Effect of microwave radiation exposure on the hormone level of estrogen in mice (n=6)

2 微波輻射暴露對雌鼠卵巢的影響 比較雌鼠的卵巢組織結(jié)構(gòu)，對照組小鼠卵巢結(jié)構(gòu)清晰完整，各級卵泡豐富且發(fā)育良好，顆粒細(xì)胞層次多且排列整齊，閉鎖卵泡很少(圖1A)；暴露組卵巢結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的損傷，HE 染色表現(xiàn)黃體數(shù)目減少，顆粒細(xì)胞層變薄且層次紊亂，顆粒細(xì)胞數(shù)目減少，成熟卵泡個數(shù)明顯減少，閉鎖卵泡個數(shù)明顯增多(圖1B～ 圖1D)。

圖1 微波輻射暴露對雌鼠卵巢結(jié)構(gòu)的影響(200×。黑色箭頭示正常卵泡；黃色箭頭示閉鎖卵泡)A：對照組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組Fig.1 Effect of microwave radiation exposure on the ovarian structure of female mice (200×.Black arrows:normal follicles;yellow arrows:atretic follicles)A:control group;B:low-dose group;C:middle-dose group;D:high-dose group

3 微波輻射暴露對雌鼠卵巢氧化應(yīng)激水平的影響 比較四組雌鼠卵巢的氧化應(yīng)激水平，SOD、CAT和MDA 水平均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。與對照組相比，高劑量組暴露后，雌鼠卵巢組織中SOD和CAT 含量顯著降低，MDA 水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 微波輻射暴露對雌鼠卵巢氧化應(yīng)激的影響(n=6)Tab.3 Effect of microwave radiation exposure on the oxidative stress in the ovaries of female mice (n=6)

4 微波輻射暴露對雌鼠子宮的影響 比較四組雌鼠子宮指數(shù)和子宮組織中標(biāo)志分子的表達(dá)水平，子宮指數(shù)和子宮組織中VEGF 的水平均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，子宮組織中VEGFR2 的水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與對照組相比，低劑量組和中劑量組的子宮指數(shù)、子宮組織中VEGF 和VEGFR2 的表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05)；高劑量組輻射暴露后，雌鼠子宮指數(shù)、子宮組織中VEGF 和VEGFR2 的表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表4 微波輻射暴露對雌鼠子宮的影響(n=6)Tab.4 Effect of microwave radiation exposure on the uterus of female mice (n=6)

5 微波輻射暴露對子代窩仔數(shù)和性別比的影響 比較四組雌鼠的受孕率和窩仔數(shù)，受孕率無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，窩仔數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。與對照組相比，高劑量組的受孕率和窩仔數(shù)顯著降低，中劑量組和高劑量組的窩仔數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。比較各組雌鼠和雄鼠的數(shù)量，差異均統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。比較雌鼠的比例，各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見表5。

表5 微波輻射暴露對子代窩仔數(shù)和性別比的影響(n=10)Tab.5 Influence of microwave radiation exposure on litter size and sex ratio of offspring (n=10)

討 論

目前，電磁輻射已經(jīng)成為繼大氣污染、水資源污染、噪聲污染后的“第四大環(huán)境污染源”，其給人們生活帶來便利的同時，也對人們及后代的健康構(gòu)成威脅[6]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO) 調(diào)查顯示，世界范圍內(nèi)育齡夫婦不孕不育發(fā)病率高達(dá)8%～ 12%，其中女性因素約占40%，且呈逐年遞增趨勢[7]。研究證實，女性生殖腺卵巢是微波輻射敏感的靶器官之一，容易遭受微波輻射的損傷，但微波電磁輻射對女性生殖功能的影響及其相關(guān)機(jī)制尚未闡明。

目前國內(nèi)外有關(guān)微波輻射對雌性生殖功能的影響及相關(guān)機(jī)制研究，主要基于動物模型。馬惠榮等[8-9]的研究結(jié)果顯示，輻射組大鼠血清E2水平較正常組顯著降低，卵泡和黃體直徑均小于正常組，顆粒細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量減少。Roshangar等[10]在對暴露于低頻電磁場的孕鼠子代進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，發(fā)育期暴露于電磁場中會影響雌鼠的卵母細(xì)胞分化和卵泡生成，并可能通過減少卵巢儲庫而導(dǎo)致生育能力下降。Sagioglou 等[11]發(fā)現(xiàn)，手機(jī)微波輻射可以加速小鼠卵母細(xì)胞凋亡。以上研究表明微波輻射可以影響雌性生殖健康。本研究同樣發(fā)現(xiàn)2 GHz 微波輻射暴露可以導(dǎo)致雌鼠血清E2水平顯著降低且卵巢結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的損傷，同時降低受孕率和子代窩仔數(shù)，導(dǎo)致雌鼠生育力降低。

VEGF 是一種高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂因子，通過與VEGFR 結(jié)合引起一系列的信號反應(yīng)，可釋放多種細(xì)胞因子與生長因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，進(jìn)而促進(jìn)血管生成，在胚胎植入及妊娠維持過程中發(fā)揮重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，2 GHz 微波輻射暴露可以導(dǎo)致雌鼠的子宮指數(shù)顯著降低，且子宮組織中VEGF 和VEGFR2 的表達(dá)水平均受到抑制，說明微波輻射暴露可影響子宮組織的血管生成，進(jìn)而影響胚胎植入和妊娠維持。

關(guān)于微波輻射對雌性生育力影響的機(jī)制，國內(nèi)外研究主要集中在微波輻射可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)和產(chǎn)生過量氧自由基，引起細(xì)胞毒性進(jìn)而損傷生殖功能[13-14]。孫靈嬌等[15]發(fā)現(xiàn)，妊娠期900 MHz(370 μW/cm2) 手機(jī)頻率電磁輻射可引起大鼠不良妊娠結(jié)局，可能與胎盤組織SOD 和谷胱甘肽過氧化物酶活力降低，胎盤組織氧化損傷存在密切關(guān)系。Shahin 等[16]研究顯示，2.45 GHz 微波照射暴露小鼠卵巢組織中NO 水平和抗氧化酶活性顯著降低，并影響小鼠胚胎著床。Sangun 等[17]的同樣發(fā)現(xiàn)2.45 GHz 微波照射暴露后，雌性Wistar 大鼠大腦和卵巢組織中總氧化狀態(tài)和氧化應(yīng)激指數(shù)顯著增加，進(jìn)而影響其生殖功能。而抗氧化藥物(如褪黑素、輔酶Q10、維生素C/E)的應(yīng)用，可以有效緩解微波輻射所造成的女性生育力損傷[18-19]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)2 GHz 微波輻射暴露可以導(dǎo)致雌鼠卵巢組織中SOD 和CAT 含量顯著降低，MDA水平顯著升高。

綜上可知，本研究發(fā)現(xiàn)2 GHz 微波輻射可對雌性ICR 小鼠生殖功能造成一定程度損傷，主要體現(xiàn)在血清E2水平降低、卵巢結(jié)構(gòu)紊亂、子宮指數(shù)降低、子宮血管生成受到抑制、受孕率降低和子代窩仔數(shù)減少。探究其原因，可能是因為微波輻射誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多氧自由基，引起細(xì)胞毒性進(jìn)而損傷雌鼠生殖功能，但具體機(jī)制尚未闡明。同時，本研究也存在一些不足之處，如納入樣本量較少且未進(jìn)行深入的機(jī)制研究，后期可以從線粒體功能層面對損傷機(jī)制進(jìn)行深入探索。