謝麗雪，張小艷，張立杰，鄭姍，李韜

侵染西番蓮的東亞西番蓮病毒全基因組序列特征及TC-RT-PCR檢測技術

謝麗雪，張小艷，張立杰，鄭姍，李韜

福建省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，福州 350013

【目的】東亞西番蓮病毒（East Asian passiflora virus，EAPV）是西番蓮（百香果）上危害嚴重的一種病毒。本研究對我國大陸地區(qū)東亞西番蓮病毒福建分離物（EAPV-FJ）的全基因組序列進行測定，明確其基因組序列特征，并建立適用于EAPV特異性檢測的TC-RT-PCR（tube capture RT-PCR）技術，旨在為該病毒的檢測、監(jiān)測及防治提供理論依據(jù)和技術支持?！痉椒ā坎捎眯NA深度測序技術結合分段克隆方法和RACE技術，測定EAPV-FJ的全基因組序列，對獲得的序列進行序列特征、系統(tǒng)發(fā)育關系和重組分析；通過反應條件及反應體系優(yōu)化，建立用于EAPV快速檢測的TC-RT-PCR技術，測定其特異性和靈敏度，并應用建立的TC-RT-PCR技術對福建省西番蓮果園采集的樣品進行檢測，同時利用普通RT-PCR檢測方法進行驗證。【結果】測序獲得的EAPV-FJ核苷酸序列全長為10 065 nt（不含polyA尾），含有一個長度為9 663 nt的開放閱讀框，編碼3 220 aa的多聚蛋白（polyprotein），經(jīng)剪切后最終生成P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb和CP 10個蛋白。基因組序列一致性分析結果表明，EAPV-FJ全基因組與GenBank登錄的4個EAPV代表分離物核苷酸序列一致性為80%—99%，其中與AO株系的越南分離物EAPV-GL1（GenBank登錄號：MT450870）一致性最高，為99%；EAPV-FJ多聚蛋白核苷酸、氨基酸序列與GenBank登錄的4個EAPV代表分離物一致性分別為79%—99%、82%—98%。基于多聚蛋白核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育關系分析顯示，EAPV分離物共分為兩個類群（Group I為AO株系、Group Ⅱ為IB株系），未表現(xiàn)出明顯的地理相關性，其中EAPV-FJ屬于Group I，與已報道的越南分離物EAPV-GL1親緣關系最近。重組分析結果表明，EAPV-FJ為非重組分離物。建立的TC-RT-PCR檢測技術具有較好的特異性和靈敏度，僅能檢測到感染EAPV的西番蓮樣品，而黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、西番蓮潛隱病毒（passiflora latent virus，PLV）、木槿潛隱皮爾斯堡病毒（hibiscus latent Fort Pierce virus，HLFPV）、蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV）、大豆花葉病毒（soybean mosaic virus，SMV）、夜來香花葉病毒（telosma mosaic virus，TeMV）等其他病毒及健康樣品均無法檢測到；靈敏度最低可以檢測到稀釋10倍的EAPV西番蓮病葉提取液原液，與普通RT-PCR檢測方法的靈敏度相當。應用建立的TC-RT-PCR技術從福建省西番蓮果園采集的60份疑似病樣中檢出EAPV共13份，該結果與普通RT-PCR檢測結果一致。【結論】首次報道了我國大陸地區(qū)EAPV全基因組序列，該分離物（EAPV-FJ）基因組結構與已報道的其他分離物一致，在系統(tǒng)發(fā)育關系上與越南分離物EAPV-GL1親緣關系最近，且未檢測到重組位點；建立的TC-RT-PCR檢測技術具有操作簡便、特異性強、靈敏度高和成本低的優(yōu)點，能有效用于西番蓮果園樣品上EAPV的實際檢測。

西番蓮；東亞西番蓮病毒；全基因組；TC-RT-PCR檢測

0 引言

【研究意義】西番蓮（），又稱百香果，因其營養(yǎng)價值高、風味獨特，深受國內(nèi)外消費者歡迎。西番蓮在栽培過程中易受病毒病的危害，對其產(chǎn)量和品質(zhì)造成不同程度的影響。東亞西番蓮病毒（East Asian Passiflora virus，EAPV）是近年來西番蓮上發(fā)生較為嚴重的一種病毒，能夠引起西番蓮木質(zhì)化病，給西番蓮生產(chǎn)安全帶來巨大的威脅[1]。為防控EAPV在我國的發(fā)生與危害，明確EAPV分離物全基因組序列及其分子特征，建立操作簡便、特異、靈敏、經(jīng)濟的檢測技術具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】EAPV是馬鈴薯Y病毒科（）馬鈴薯Y病毒屬（）成員，最早在日本西番蓮上被報道[2]，現(xiàn)分布于日本、韓國、越南、馬來西亞、烏干達以及我國的臺灣和福建地區(qū)[1-3]。EAPV包括AO和IB兩個株系，侵染西番蓮均可引起葉片花葉，但在果實上引起的癥狀不同，AO株系主要引起果實畸形和木質(zhì)化，IB株系引起果實斑駁[2,4]。此外，AO和IB兩個株系的寄主范圍存在一定的差異[2]。EAPV基因組為正義單鏈RNA，AO、IB株系的全基因組序列大小分別約10 046和9 982 nt。與其他馬鈴薯Y病毒屬病毒一樣，EAPV含有一個長的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼多聚蛋白（polyprotein）。經(jīng)病毒自身編碼的蛋白酶切割后，多聚蛋白可以產(chǎn)生10種成熟蛋白[4]，包括P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb和CP。Iwai等[3]首次報道了AO株系的全基因組序列；Fukumoto等[5]測定了IB株系的全基因組序列，并與AO株系進行比較，發(fā)現(xiàn)兩個株系的基因組在5′端非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）和P1基因區(qū)域具有較高的多樣性；Fukumoto等[1]采用RT-PCR測定2005—2010年日本鹿兒島西番蓮上EAPV的CP和多蛋白編碼區(qū)，分析了EAPV群體遺傳結構與變異，結果表明該地區(qū)僅存在AO株系，且在負選擇壓力作用下顯示出較低的多樣性；Chiaki等[4]以日本鹿兒島兩個不同地區(qū)的EAPV分離物為對象，進一步開展了重組、系統(tǒng)發(fā)育、選擇壓力、遺傳分化和基因流等群體遺傳學分析，發(fā)現(xiàn)兩個地區(qū)的EAPV種群各自獨立進化；Chong等[6]測定了我國臺灣地區(qū)的EAPV全基因組序列，序列分析結果表明在臺灣地區(qū)引起西番蓮木質(zhì)化病的病原應為EAPV，而非之前報道的西番蓮木質(zhì)化病毒（passionfruit woodiness virus，PWV）；2018年，筆者[7]采用血清學ELISA、RT-PCR和序列測定的方法，從福建西番蓮上檢出EAPV，在我國大陸地區(qū)首次報道了EAPV的發(fā)生?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于EAPV全基因組序列的報道較少，EAPV中國分離物僅臺灣地區(qū)有報道，大陸地區(qū)分離物尚未見報道。此外，國內(nèi)外針對EAPV分子檢測技術的研究甚少，迄今未見TC-RT-PCR技術用于EAPV檢測的報道?！緮M解決的關鍵問題】在筆者前期報道EAPV在我國大陸地區(qū)發(fā)生的基礎上，以EAPV福建分離物（EAPV-FJ）為研究對象，采用小RNA深度測序技術結合分段克隆、RACE技術，獲得該分離物全基因組序列，并將其與GenBank上已報道的其他EAPV分離物進行比較，分析其基因組結構特征，揭示其分子變異情況，同時建立簡便、高效的分子檢測技術，以期為該病毒的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018—2021年在福建省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所完成。

1.1 材料

EAPV-FJ采自福建省西番蓮果園，新鮮樣品迅速置于液氮中，-85℃超低溫冰箱保存。

TRIzol 試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、DNA聚合酶、2×PCR mix為Promega公司產(chǎn)品；DNA Marker、Gel Purification Kit為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；Tks GflexTMDNA Polymerase、RACE 5′/3′試劑盒、pMD-18T載體等為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 西番蓮總RNA提取及小RNA深度測序

采用TRIzol 試劑提取西番蓮病葉總RNA，參照試劑盒說明書進行。將病葉總RNA送上海生工生物工程技術服務有限公司，經(jīng)質(zhì)量檢測合格后進行小RNA深度測序。文庫構建及測序均由測序公司完成，測序平臺為HiSeq X Ten（Illumina公司）。測序所得序列去除接頭序列和低質(zhì)量讀長（reads），序列拼接成較長的重疊群（contig）后進行BLAST比對分析。

1.3 小RNA深度測序結果RT-PCR驗證

利用根據(jù)EAPV基因組序列設計的特異性引物EAPV-F/EAPV-R（正向引物EAPV-F：5′-CTTGCATG TCCTAGACCTCG-3′，反向引物EAPV-R：5′-AACTGT GGTCGGTTTACCCAA-3′）[7]對小RNA深度測序結果進行RT-PCR驗證。cDNA的合成采用20 μL反應體系：3 μL RNA，EAPV-R 1 μL、ddH2O 7 μL，70℃水浴10 min后迅速冰浴5 min，再加入5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μL、dNTPs（10 mmol·L-1）2 μL、RNasin（40 U·μL-1）1 μL、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U·μl-1）1 μL；42℃ 1 h、70℃ 10 min。經(jīng)優(yōu)化的PCR反應體系及條件：cDNA 2 μL，EAPV-F（10 μmol·L-1）1 μL，EAPV-R（10 μmol·L-1）1 μL，2×PCR mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL；94℃預變性3 min后94℃ 30 s、55℃ 45 s、72℃ 1 min，共35個循環(huán)，最后一輪循環(huán)后72℃延伸10 min。取10 μL PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠（染料為GelRed）進行電泳檢測。PCR產(chǎn)物回收、純化后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，然后挑選陽性克隆子進行測序。

1.4 EAPV基因組序列擴增及分析

根據(jù)小RNA測序后序列拼接結果和GenBank已報道的EAPV基因組序列，設計重疊的特異性引物對（表1），用于擴增EAPV的基因組，5′和3′末端采用cDNA末端快速擴增（RACE）。PCR反應體系和反應條件參照說明書進行。PCR產(chǎn)物回收、純化后，進行克隆測序，測定的序列采用DNAMAN軟件進行拼接，獲得EAPV全基因組序列，并提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。EAPV基因組的核苷酸和氨基酸序列一致性分析采用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序進行在線比對。

表1 EAPV全基因組擴增引物

1.5 EAPV基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

應用最大似然法（maximum likelihood，ML）基于多聚蛋白編碼區(qū)的核苷酸序列重建EAPV系統(tǒng)發(fā)育關系。建樹前，使用PhyloSuite1.21[8]軟件中的MAFFT算法[9]基于密碼子（codon）方式進行多重序列比對。應用ModelFinder[10]對數(shù)據(jù)集的最佳替代模型進行選擇，并基于貝葉斯信息標準（Bayesian information criterion，BIC）設置模型參數(shù)，應用IQ-TREE 1.6.8[11]重建EAPV系統(tǒng)發(fā)育關系。系統(tǒng)發(fā)育樹各節(jié)點的可靠性采用10 000次超快自舉檢驗（Ultrafast bootstrap）和1 000次 SH-aLRT進行評估。以浙貝母病毒Y（fritillary virus Y，F(xiàn)VY）（GenBank 登錄號NC_ 010954）為外群（outgroup）。用于系統(tǒng)發(fā)育分析的EAPV參考分離物信息如表2所示，寄主均為西番蓮。

表2 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的EAPV分離物信息

1.6 EAPV基因組重組分析

先應用SplitsTree 4.14.5[12]重建EAPV系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡并計算成對同質(zhì)性指數(shù)（pairwise homoplasy index，PHI），隨后通過RDP 4.101[13]軟件包中整合的7種算法進一步進行重組分析，這7種算法包括RDP、Geneconv、Bootscan、Maxchi、Chimaera、Siscan和3Seq。為避免假陽性結果，設置顯著性閾值＜1.0×10-6，7種方法中超過半數(shù)方法都檢測到重組事件視為有效。最后，應用Simplot進行序列相似性繪圖。

1.7 TC-RT-PCR檢測

稱取0.1 g西番蓮葉片，按1﹕10（W/V）比例加入提取緩沖液（PBST，含0.05% Tween-20），研磨后4℃下10 000 r/min離心5 min，棄去沉淀。取上清100 μL包被PCR管，4℃下包被過夜，PBST洗管3次，每次3 min，ddH2O洗2次后晾干10 min。向PCR管中加入反向引物EAPV-R（10 μmol·L-1）1 μL，ddH2O 10 μL，70℃水浴10 min后立即置于冰上冷卻3 min，再加入下列試劑：5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μL，dNTPs（10 mmol·L-1）2 μL，RNasin（40 U·μL-1）1 μL、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U·μL-1）1 μL。經(jīng)42℃ 1 h，70℃ 10 min合成cDNA。PCR反應體系和條件同1.3。分別以EPAV、CMV、PLV、HLFPV、TuMV、SMV和TeMV陽性樣品為材料，以健康西番蓮葉片為陰性對照，進行TC-RT-PCR，測定其特異性；將感染EPAV的西番蓮病葉提取液原液進行10倍梯度稀釋，然后對原液和各稀釋液分別進行TC-RT-PCR，測定其靈敏度。此外，分別取100 μL原液和各稀釋液，利用RNA提取試劑盒，參照說明書提取總RNA作為模板，測定普通RT-PCR的靈敏度。

1.8 西番蓮樣品EAPV的檢測

利用建立的TC-RT-PCR檢測方法對采集的福建地區(qū)西番蓮疑似病樣進行EAPV檢測。樣品共60份，各稱取0.1 g后按1.7方法進行TC-RT-PCR，檢測結果用普通RT-PCR進行驗證。

2 結果

2.1 小RNA深度測序結果及病毒篩查

感染EAPV的西番蓮病葉樣品經(jīng)小RNA深度測序，共得到8 481 805個原始reads，經(jīng)質(zhì)量控制后獲得3 276 757個高質(zhì)量reads，占總reads的38.6%。拼接得到的contig經(jīng)BLAST比對，與EAPV具有高度一致性的contig有15條。為驗證小RNA深度測序結果，利用特異性引物EAPV-F/EAPV-R進行RT-PCR檢測，結果顯示，從病葉樣品中擴增到預期大?。s955 bp）的目的片段（圖1）。PCR產(chǎn)物克隆測序結果進一步表明，擴增到的目的片段為EAPV基因的部分片段，其核苷酸序列與已報道的EAPV分離物一致性最高達99%。此外，小RNA深度測序還檢測發(fā)現(xiàn)了TeMV和CMV兩種病毒。

M：DNA分子量標準（100 bp）DNA Marker (100 bp)；1、2：EAPV疑似病樣EAPV suspected sample；3：陰性對照Negative control；4：空白對照Blank control

2.2 全基因組序列特征

經(jīng)拼接獲得的EAPV-FJ分離物不含poly (A)尾的全基因組長度為10 065 nt（GenBank登錄號：ON641738），不同基因的位置、編碼分析及與EAPV代表分離物核苷酸和氨基酸序列一致性如表3所示。該分離物的5′端和3′端的UTR長度分別為147和255 nt。148—9 810 nt為多聚蛋白編碼區(qū)序列，編碼一個包含3 220個氨基酸長度的多聚蛋白。EAPV-FJ分離物的9個剪切位點分別為Y/S、G/G、Q/A、Q/S、Q/S、Q/G、E/S、Q/S、Q/T，多聚蛋白被自身編碼的蛋白酶切割成10個成熟蛋白，從N′-端到C′-端依次為P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb和CP。此外，在P3蛋白內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了由移碼翻譯（相對于P3基因以+2相位編碼）產(chǎn)生的PIPO蛋白。在全基因組水平上，EAPV-FJ分離物與4個EAPV代表分離物的核苷酸序列一致性為80%—99%，其中與越南分離物EAPV-GL1的一致性最高，為99%。EAPV-FJ分離物多聚蛋白與4個EAPV代表分離物的核苷酸、氨基酸序列一致性分別為79%—99%、82%—98%。在各基因區(qū)段上，該分離物和EAVP AO株系的代表分離物核苷酸序列一致性較高（95%—99%），而與IB株系的代表分離物核苷酸序列一致性較低（70%—87%）；在基因編碼區(qū)，該分離物與EAVP AO株系的代表分離物氨基酸序列一致性較高（94%—100%），而與IB株系的代表分離物氨基酸序列一致性較低（56%—94%）。上述結果表明，EAPV-FJ分離物與EAVP AO株系代表分離物高度同源，親緣關系較近。

表3 EAPV-FJ與EAPV代表分離物的核苷酸和氨基酸序列一致性

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于BIC標準，建樹序列最適合的核苷酸替換模型為GTR+G4+F，ML法重建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。從圖2可以看出，EAPV-FJ分離物與AO株系的5個分離物（EAPV-AO、EAPV-YW、EAPV-GL1、EAPV-TW、EAPV-0920-6）形成一個類群（Group I），其中與越南分離物EAPV-GL1單獨聚為一簇，IB株系的4個分離物（EAPV-IB、EAPV-PFK1、EAPV-IB-dpd、EAPV-pt）則形成另一個類群（Group Ⅱ）。系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，EAPV-FJ分離物在系統(tǒng)發(fā)育關系上與越南分離物EAPV-GL1的親緣關系最近。

2.4 重組分析

SplitsTree計算獲得的PHI檢驗的值小于0.05，表示EAPV基因組中可能存在重組事件。進一步的RDP軟件分析發(fā)現(xiàn)，EAPV-FJ分離物為非重組分離物，EAPV-IB-dpd分離物（GenBank登錄號：KT724930）被鑒定為重組分離物，其可能的親本為pt分離物和PFK1分離物（7種檢測方法值＜1.0×10-6）。通過Simplot軟件繪圖，如圖3所示，EAPV-IB-dpd基因組的前半段與pt分離物的序列一致性非常高，而后半段則與PFK1分離物的一致性相近。

2.5 TC-RT-PCR檢測的特異性

經(jīng)反應體系和反應條件優(yōu)化，建立了用于EAPV檢測的TC-RT-PCR技術。TC-RT-PCR具有良好的特異性，僅能從感染EAPV西番蓮樣品上擴增出預期大小（約955 bp）的目的片段，而從CMV、PLV、HLFPV、TuMV、SMV、TeMV及健康樣品上未擴增出目的片段（圖4）。PCR擴增產(chǎn)物克隆測序結果顯示，目的片段與預期大小完全相符，且與GenBank已報道的EAPV基因序列一致性最高達99%，進一步驗證了TC-RT-PCR檢測的準確性。

2.6 TC-RT-PCR檢測的靈敏度

將感染EPAV的西番蓮病葉提取液原液進行10倍梯度稀釋后，分別作為模板進行TC-RT-PCR和普通RT-PCR檢測。當EPAV病葉提取液原液稀釋10倍時目的片段變淡，稀釋102倍后無特異性目的片段，說明TC-RT-PCR最低能檢測到稀釋10倍的EPAV病葉提取液原液（圖5-A）。同樣，普通RT-PCR的靈敏度也是最低檢測到稀釋10倍的EPAV病葉提取液原液（圖5-B）。上述結果表明，TC-RT-PCR的靈敏度與普通RT-PCR相當。

分支上顯示數(shù)值為SH-aLRT支持率/自舉值（＞90%），標度尺為替代數(shù)/位點

圖3 重組分離物EAPV-IB-dpd的Simplot序列一致性分析

M：DNA分子量標準（100 bp）DNA Marker (100 bp)；1：EAPV樣品EAPV sample；2：CMV樣品CMV sample；3：PLV樣品PLV sample；4：HLFPV樣品HLFPV sample；5：TuMV樣品TuMV sample；6：SMV樣品SMV sample；7：TeMV樣品TeMV sample；8：陰性對照Negative control

2.7 西番蓮樣品TC-RT-PCR檢測

利用建立的TC-RT-PCR對福建省西番蓮果園采集的60份西番蓮疑似病樣進行檢測，結果如圖6所示。60份樣品中共檢出EPAV為陽性的有13份，檢出率為21.7%，該結果與普通RT-PCR結果一致，陽性符合率為100%。

3 討論

EAPV侵染引起的木質(zhì)化病對西番蓮造成極其嚴重的危害，至今尚無有效的防治藥劑。開展EAPV全基因組序列及分子特征研究，對于明確我國EAPV的分類地位、分子變異進化特征及致病機制研究具有重要意義。目前，EAPV僅日本分離物、我國臺灣地區(qū)分離物全基因組序列有報道，而我國大陸地區(qū)全基因組序列尚未報道。近年來，小RNA深度測序技術已越來越多地用于植物病毒的檢測鑒定，在未知病毒、新病毒的發(fā)現(xiàn)上發(fā)揮了重要作用。Li等[14]利用小RNA深度測序技術，從美國和墨西哥番茄病樣上檢測出馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒（potato spindle tuber viroid，PSTVd），獲得了其完整基因組序列，同時發(fā)現(xiàn)了鳳果花葉病毒（pepino mosaic virus，PepMV）和一種新的馬鈴薯Y病毒屬病毒；范旭東等[15]對安尼斯基葡萄病葉進行小RNA深度測序，然后通過RT-PCR擴增，成功地獲得了葡萄漿果內(nèi)壞死病毒（grapevine berry inner necrosis virus，GINV）變種類型l分離物基因組全長序列。本研究以福建地區(qū)采集的西番蓮疑似病毒癥狀葉片為材料，首先利用小RNA深度測序?qū)Σ《痉N類進行鑒定，再根據(jù)拼接的序列設計引物進行RT-PCR擴增，結合分段克隆、RACE技術，獲得了EAPV福建分離物的全基因組序列，分析了其分子特征，并建立了無需RNA提取步驟的操作簡便、特異性強、靈敏度高以及成本低的TC-RT-PCR快速檢測技術，為預防和控制EAPV危害打下了良好的基礎。

A：TC-RT-PCR；B：普通RT-PCR conventional RT-PCR。M：DNA分子量標準（100 bp）DNA Marker (100 bp)；1：EAPV病葉提取液原液（100）Crude extract of EAPV-infected leaf (100)；2：101倍稀釋101 times dilution；3：102倍稀釋102 times dilution；4：103倍稀釋103 times dilution；5：104倍稀釋104 times dilution；6：105倍稀釋105 times dilution；7：106倍稀釋106 times dilution；8：107倍稀釋107 times dilution；9：陰性對照Negative control

A：1—20號西番蓮樣品P. edulis sample 1-20；B：21—40號西番蓮樣品P. edulis sample 21-40；C：41—60號西番蓮樣品P. edulis sample 41-60。M：DNA分子量標準（100 bp）DNA Marker (100 bp)；1—20：西番蓮樣品P. edulis sample；21：陰性對照Negative control

3.1 EAPV基因組結構

根據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）關于馬鈴薯Y病毒屬的分類標準，CP基因的氨基酸序列一致性約低于80%；CP基因或全基因組的核苷酸序列一致性低于76%才可劃分為不同的病毒種[16]。基因組結構分析發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的EAPV-FJ全基因組序列與已報道的EAPV代表分離物一致性最高達99%，CP基因的氨基酸、核苷酸序列與已報道的EAPV代表分離物一致性最高分別為98%、96%，均高于馬鈴薯Y病毒屬不同病毒種的界定標準，證實了EAPV-FJ為EAPV的分離物。EAPV-FJ編碼的所有蛋白中，P1蛋白相對變異較大，與EAPV IB株系代表分離物氨基酸序列一致性最低（56%—58%），與EAPV AO株系代表分離物氨基酸序列的一致性最高（98%—99%），而CI蛋白則較為保守，無論與EAPV AO株系還是EAVP IB株系代表分離物的氨基酸序列一致性均高于90%，分別為99%和94%。Fukumoto等[5]研究表明，EAPV不同株系間的P1基因氨基酸序列差異最大，而CI基因氨基酸序列差異最小。本研究結果與前人的報道相一致。馬鈴薯Y病毒屬P1基因與寄主的癥狀表達相關，且其變異性程度與寄主范圍密切相關[17-18]。EAPV AO、IB株系的寄主范圍和侵染寄主引起的癥狀有一定的差異，但這是否與P1基因分子變異有關有待進一步研究。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，EAPV-FJ編碼的P3蛋白內(nèi)有一個由移碼翻譯產(chǎn)生的蛋白（PIPO），進一步驗證了前人關于馬鈴薯Y病毒屬基因組內(nèi)存在的報道[19]。

3.2 EAPV系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究基于全基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育關系分析顯示，EAPV分為AO、IB株系兩個類群（Group I和Group Ⅱ），未表現(xiàn)出明顯的地理相關性，EAPV-FJ分離物屬于AO株系類群，這與筆者前期根據(jù)CP基因序列進行的系統(tǒng)發(fā)育分析結果一致。重組是促進病毒進化的重要因素，能幫助病毒適應新寄主或擴大寄主范圍，在馬鈴薯Y病毒屬病毒中普遍存在[20-23]。本研究針對EAPV全基因組序列進行重組分析，發(fā)現(xiàn)EAPV-FJ與其他分離物沒有重組現(xiàn)象，但EAPV其他分離物基因組中存在重組信號，EAPV-IB-dpd分離物為潛在的重組分離物，其親本可能為pt分離物和PFK1分離物。Fukumoto等[1]對日本鹿兒島地區(qū)的EAPV進行重組分析，結果表明不管是CP還是其他蛋白編碼區(qū)基因序列，均無重組現(xiàn)象；Chiaki等[5]進一步對日本鹿兒島地區(qū)EAPV多聚蛋白重組分析，也未發(fā)現(xiàn)重組信號。日本鹿兒島地區(qū)的EAPV分離物以及本研究獲得的EAPV-FJ均屬于AO株系，由此推測AO株系種群結構相對穩(wěn)定，無明顯遺傳差異。盡管重組現(xiàn)象在馬鈴薯Y病毒屬病毒中發(fā)生普遍，但本研究僅發(fā)現(xiàn)EAPV-IB-dpd分離物為重組分離物，這可能與已報道的EAPV分離物全基因組數(shù)量、來源地相對較少有關，因此EAPV是否還有其他重組分離物有待進一步分析確認。

3.3 EAPV的TC-RT-PCR檢測

目前，分子生物學檢測是包括EAPV在內(nèi)的西番蓮各病毒的主要檢測方法，如RT-PCR、RT-LAMP等[7,24-27]。針對EAPV，普通RT-PCR檢測方法首先需要提取RNA，然后再進行反轉(zhuǎn)錄和PCR。提取的RNA質(zhì)量直接影響檢測結果的準確性。TC-RT-PCR是利用PCR管壁非特異性捕捉病毒粒子，省去RNA提取步驟，將樣品提取液包被PCR管后，直接在管內(nèi)進行反轉(zhuǎn)錄和PCR。與普通RT-PCR相比，TC-RT-PCR具有操作簡便、檢測成本低和不使用有機溶劑的突出優(yōu)點。沈建國等[28]根據(jù)已報道的菜豆莢斑駁病毒（bean pod mottle virus，BPMV）CP基因序列設計特異性引物，建立了適用于大豆種子上BPMV快速檢測的TC-RT-PCR技術。本研究建立的TC-RT-PCR檢測技術，能夠?qū)APV與CMV、PLV、HLFPV、TuMV、SMV、TeMV等其他病毒相區(qū)分，顯示出良好的特異性，同時檢測靈敏度與普通RT-PCR檢測方法相當，說明TC-RT-PCR檢測EAPV具有特異性好、靈敏度高的優(yōu)點。由于TC-RT-PCR無需提取RNA，因此非常適合大批量樣品的分子檢測。本研究應用建立的TC-RT-PCR檢測技術，對60份從福建省西番蓮果園采集的樣品進行了檢測，驗證其實際檢測效果，檢測結果與普通RT-PCR完全相符，這表明該檢測技術可有效用于EAPV的實際檢測。

4 結論

測定了EAPV-FJ的全基因組序列，這是我國大陸地區(qū)EAPV全基因組序列的首次報道。序列分析結果表明，EAPV-FJ與已報道的EAPV基因組結構一致。系統(tǒng)發(fā)育分析結果發(fā)現(xiàn)，EAPV-FJ與越南分離物EAPV-GL1親緣關系最近?；蚪M重組分析結果顯示，EAPV-FJ與其他分離物無重組現(xiàn)象。針對EAPV，建立了簡便、高效的TC-RT-PCR快速檢測技術。

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Complete Genome Sequence Characteristics and TC-RT-PCR Detection of East Asian Passiflora Virus Infecting

XIE Lixue, ZHANG Xiaoyan, ZHANG Lijie, ZHENG Shan, LI Tao

Fruit Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013

【Objective】East Asian Passiflora virus (EAPV) is an important virus in. The objective of this study is to determine the complete genome sequence of EAPV Fujian isolate (EAPV-FJ) in mainland China, define the genome sequence characteristics of EAPV-FJ, establish the TC-RT-PCR (tube capture RT-PCR) assay for the specific detection, and to provide theoretical basis and technical support for the detection, monitoring and control of the virus.【Method】The complete genome sequence of EAPV-FJ was determined by using small RNA deep sequencing technology, combined with segmental cloning and RACE technology. The obtained EAPV-FJ sequence was analyzed for sequence characteristics, phylogenetic relationship and recombination. The TC-RT-PCR technology for rapid detection of EAPV was established through optimization of reaction conditions and reaction system. The specificity and sensitivity of the TC-RT-PCR were determined. The established TC-RT-PCR technology was used to detect samples collected fromorchards in Fujian Province, and the conventional RT-PCR was used for verification.【Result】The full length of the obtained EAPV-FJ was 10 065 nt (excluding polyA tail), containing an open reading frame of 9 663 nt in length that encodes a polyprotein of 3 220 aa. The polyprotein was cleavaged into 10 proteins, which are P1, HC-Pro, P3, 6K1, CI, 6K2, VPg, NIa, NIb and CP, respectively. The results of genome sequence identity analysis showed that the nucleotide sequence identity between EAPV-FJ genome and the four EAPV representative isolates registered in GenBank was 80%-99%, among which Vietnamese isolate EAPV-GL1 (GenBank accession number MT450870) of AO strain had the highest identity (99%). The nucleotide and amino acid sequences of the polyprotein were 79%-99% and 82%-98% identical to the four EAPV representative isolates registered in GenBank, respectively. Phylogenetic analysis based on the nucleotide sequence of EAPV-FJ polyprotein showed that EAPV isolates were divided into two groups (Group I was AO strain and Group Ⅱ was IB strain), which did not show obvious geographical correlation. EAPV-FJ belonged to Group I and was most closely related to the reported Vietnamese isolate EAPV-GL1. The results of recombination analysis revealed that EAPV-FJ is not a recombinant of EAPV. The established TC-RT-PCR detection technology showed good specificity and sensitivity, and can only detect EAPV-infected samples of, while other viruses including cucumber mosaic virus (CMV), passiflora latent virus (PLV), hibiscus latent Fort Pierce virus (HLFPV), turnip mosaic virus (TuMV), soybean mosaic virus (SMV), telosma mosaic virus (TeMV) as well as healthy samples cannot be detected. The lowest sensitivity of the TC-RT-PCR could detect the crude leaf extract of EAPV-infected samples ofdiluted by 10times, which was similar to the sensitivity of conventional RT-PCR. A total of 13 EAPV-positive samples were detected from 60 suspected virus disease samples ofcollected fromorchards in Fujian Province by using the established TC-RT-PCR assay, and the results were in good agreement with conventional RT-PCR.【Conclusion】This is the first report of complete genome sequence of EAPV in mainland China. The genome structure of this isolate (EAPV-FJ) is consistent with other reported isolates. EAPV-FJ has the closest relative to the Vietnamese isolate EAPV-GL1 in phylogenetic relationship, and no recombination sites were detected. The established TC-RT-PCR assay has the advantages of convenient operation, strong specificity, high sensitivity and low cost, and can be effectively used for the actual detection of EAPV inorchard samples.

; East Asian Passiflora virus (EAPV); complete genome; TC-RT-PCR detection

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.22.007

2022-06-21；

2022-07-25

國家重點研發(fā)計劃（2016YFF0203200）、福建省公益類科研院所專項（2020R1028005）、福建省農(nóng)業(yè)科學院引導性科技創(chuàng)新項目（YDXM202202）

謝麗雪，E-mail：xielx_faas@126.com。通信作者李韜，Tel：0591-87573907；E-mail：leetao06@163.com

（責任編輯 岳梅）