梁杰 華深 戴邊 葉素紅

抑郁癥是一種臨床常見的精神類疾病，在普通人群中患病率約為10%～15%，以興趣減退或情感低落為主要臨床特征，伴軀體癥狀、行為紊亂、認(rèn)知功能障礙等[1]。腦卒中是我國常見的慢性疾病之一，該病具有較高的發(fā)病率、致殘率及致死率等，嚴(yán)重威脅患者的身體健康[2]。卒中后抑郁癥是腦卒中患者常見的一種并發(fā)癥，以興趣減退、情緒低落、情緒障礙等為主要表現(xiàn)，發(fā)病率約為20%～79%[3]。由于腦卒中合并抑郁會影響患者的治療效果，延長治療時間，降低其生活質(zhì)量，嚴(yán)重者可致殘甚至死亡，給患者家庭帶來巨大心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]，故選取有效指標(biāo)預(yù)測腦卒中合并抑郁的發(fā)生具有重要臨床意義。載脂蛋白E（apolipoprotein E,APOE）是一種多肽，由單一多肽鏈構(gòu)成，主要存在于多種脂蛋白顆粒中，APOE mRNA主要存在于大腦及肝臟。APOE與心腦血管性疾病相關(guān)，是動脈粥樣硬化和腦卒中的危險因素，有研究發(fā)現(xiàn)APOE對脂質(zhì)代謝具有調(diào)節(jié)作用，使膽固醇維持在正常水平，在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及神經(jīng)功能損傷的修復(fù)中也扮演了關(guān)鍵角色[5-6]。Ramachandran等[7]在研究抑郁癥時發(fā)現(xiàn)，APOE ε3ε4基因型與抑郁癥相關(guān)，首次提出APOE基因多態(tài)性與抑郁癥的關(guān)系。關(guān)于APOE基因多態(tài)性與抑郁情緒的研究指出，攜帶APOE ε4等位基因的抑郁癥患者發(fā)病次數(shù)較多和發(fā)病年齡較早，APOE基因多態(tài)性影響抑郁癥的臨床特征和病程[8]。APOE基因多態(tài)性可能是腦卒中合并抑郁的潛在發(fā)病機(jī)制之一，但目前關(guān)于APOE基因多態(tài)性與腦卒中合并抑郁的相關(guān)性研究較少?；诖耍P者旨在探討APOE基因多態(tài)性與腦卒中合并抑郁的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2020年1月至2021年2月平湖市第一人民醫(yī)院及金華市第二醫(yī)院收治的118例（各59例）腦卒中患者。腦卒中合并抑郁的診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）腦卒中根據(jù)《腦梗死和腦出血中西醫(yī)結(jié)合診斷標(biāo)準(zhǔn)（試行）》[9]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)頭顱MRI和CT檢查證實；（2）抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)：漢密爾頓抑郁量表（Hamilton depression scale,HAMD）[10]評分＞20分，且符合美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第4版（DSM-4）中抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，且為首次發(fā)作者；（2）處于康復(fù)期，意識清楚，病情穩(wěn)定，智力正常，無溝通障礙者；（3）無藥物、酒精依賴史；（4）均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有抑郁或精神病史者；（2）體內(nèi)有金屬異物者；（3）言語、視力或聽力功能障礙，無法配合相關(guān)評測者；（4）合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能衰竭者；（5）因其他器質(zhì)性疾病繼發(fā)抑郁者；（6）依從性差者。根據(jù)是否合并抑郁癥分為合并抑郁癥組48例和單純腦卒中組70例。兩組患者性別、年齡、腦卒中病程、病變性質(zhì)、卒中部位、HAMD評分、吸煙、飲酒、合并癥等比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)平湖市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（20200105）。

表1 兩組患者一般資料的比較

1.2 基因多態(tài)性檢測 所有患者入院后1 d抽取空腹靜脈血8 ml。血液DNA采用美國Sigma公司NA2010 GenElute Blood Genomic DNA Kit提取，提取方法為冷凍血室溫溶化；取1 ml血液置于2 ml無菌離心管中，加入等體積的PBS，混勻后12 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入667 μl緩沖液，20%裂解細(xì)胞24 μl，37 ℃水浴1 h；加入20 mg/ml蛋白酶K 10 μl混勻，55 ℃水浴消化過夜（10～14 h）；將消化的樣品分別加入等體積的Tris飽和酚，酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）充分振蕩混勻，12 000 r/min離心10 min；加入2倍體積的冰乙醇，1/10體積醋酸鈉水平搖動，直到可見絮狀DNA析出；樣品-20℃冰箱冷凍30 min，取出后12 000 r/min離心10 min，使DNA沉淀；洗出DNA的雜質(zhì)；將DNA用真空干燥或自然晾干，加入適量的TE緩沖液回溶，-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩ＨNA 4 μl，稀釋25倍，DNA質(zhì)量、濃度及260nm和280nm吸光度（optuical densit,OD260/280）采用紫外分光光度檢測。由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成APOE基因引物序列，下游：5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3'，上游：5'-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3'。PCR 體系（10 μl）：DNA 模板（1 μl）、dNTPs（0.3 μl）、上游/下游引物（0.2 μl）、10×Buffer（1 μl）、MgCI（20.52 μl）和ddH2O（6.68 μl）；擴(kuò)增后酶切體系：10 μl（10 U/μl）HhaI，10 μl PCR產(chǎn)物，加入去離子水使總體積達(dá)到30 μl，混勻，37℃水浴12 h，消化。用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳反應(yīng)結(jié)束后的酶切產(chǎn)物，分辨基因型。PCR擴(kuò)增：離心固體引物（10 000 r/min離心10 min），加入離子水，混勻，引物稀釋至100 pmol/L，保存于-20℃冰箱內(nèi)。PCR反應(yīng)條件：94℃ 4 min，1個循環(huán)；94℃ 45 s，退火溫度45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min，1個循環(huán)；4℃保存。5%瓊脂糖電泳對反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增效果進(jìn)行觀察。

APOE基因的ε2、ε3、ε4等位基因構(gòu)成ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4、ε2ε3、ε2ε4、ε3ε4共6種不同基因型。等位基因頻率=（[2×純合子＋雜合子）（/2×受檢總例數(shù)）]×100%。比較兩組患者APOE基因型分布及等位基因頻率的差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用多因素logistic回歸分析腦卒中合并抑郁的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基因型分布的比較 合并抑郁癥組ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4、ε2ε3、ε2ε4、ε3ε4占比與單純腦卒中組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 兩組患者基因型分布的比較[例（%）]

2.2 兩組患者等位基因頻率的比較 合并抑郁癥組ε2、ε3基因頻率與單純腦卒中組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；合并抑郁癥組ε4高于單純腦卒中組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者等位基因頻率的比較[例（%）]

2.3 腦卒中患者抑郁影響因素分析 以腦卒中患者合并抑郁為因變量，將上述一般資料、基因型分布及等位基因頻率為自變量，多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，ε2ε3、ε3ε4、ε4是腦卒中合并抑郁的影響因素，見表4。

表4 多因素logistic回歸分析腦卒中合并抑郁的影響因素

3 討論

抑郁癥是腦卒中常見的并發(fā)癥之一，抑郁癥可在腦卒中后的任何時期發(fā)生，其不僅危害腦卒中患者的心理健康，而且嚴(yán)重影響患者神經(jīng)康復(fù)，加重病情，延長病程。目前有研究認(rèn)為，抑郁癥是社會心理學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)共同作用而產(chǎn)生的結(jié)果，其中社會心理學(xué)包括社會與家庭影響、群體行為學(xué)等，神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制則涉及神經(jīng)再生學(xué)、神經(jīng)營養(yǎng)學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)等[11]。近年來，關(guān)于腦卒中合并抑郁發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究中基因多態(tài)性是臨床研究的重點(diǎn)[12]。目前已有文獻(xiàn)對APOE基因多態(tài)性與抑郁癥、冠心病等繼發(fā)抑郁障礙的關(guān)系展開研究，但結(jié)論并不一致[13-14]。而APOE基因多態(tài)性是否與腦卒中合并抑郁相關(guān)的研究甚少。

APOE基因長度約3.7 kb，位于19q13.2，有3個等位基因包括ε2、ε3、ε4，共同構(gòu)成6種基因型，包括雜合子（ε3ε4、ε2ε4、ε2ε3）和純合子（ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4），在多種脂蛋白顆粒中存在，首次在極低密度脂蛋白中發(fā)現(xiàn)，參與脂質(zhì)代謝，其基因多態(tài)性參與神經(jīng)細(xì)胞的生長及修復(fù)[15]。APOE屬于一種多功能蛋白，主要通過與極低密度脂蛋白受體和低密度脂蛋白受體結(jié)合發(fā)揮膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和脂類代謝；另外，APOE與神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育密切相關(guān)，且參與抗氧化、免疫應(yīng)答、脂質(zhì)的再分布、組織損傷后修復(fù)等過程[16]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，APOE由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成，是重要的載脂蛋白，與脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，修復(fù)神經(jīng)組織[16]。APOE異構(gòu)體由ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4所編碼合成，其結(jié)構(gòu)和功能并不相同，因此其在神經(jīng)生物學(xué)上所發(fā)揮的作用也并不相同。腦卒中發(fā)生的重要危險因素包括腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白和神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成，其原因可能是APOE ε2、ε3等位基因的缺失會加速神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成，另外APOE ε4等位基因與腦卒中患者腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白密切相關(guān)[16]。有研究指出，APOE基因多態(tài)性參與抑郁的發(fā)生、發(fā)展[17]?？自伱返萚5]研究指出，腦梗死合并認(rèn)知功能障礙患者的APOE基因型分布與腦梗死患者并無明顯區(qū)別。Feng等[18]研究指出，APOE基因多態(tài)性與抑郁癥易感性關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示，合并抑郁癥組 ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4、ε2ε3、ε2ε4、ε3ε4與單純腦卒中組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），提示腦卒中及腦卒中合并抑郁的APOE基因型分布并無明顯區(qū)別。本研究結(jié)果顯示，合并抑郁癥組ε2、ε3與單純腦卒中組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），但ε4高于單純腦卒中組（P＜0.05），提示腦卒中合并抑郁的APOE等位基因頻率中ε4較高，這可能是由于ε4等位基因與腦卒中合并抑郁中存在一定的關(guān)系，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究證實。

于雪瑩等[6]研究指出，2型糖尿病患者腦梗死的發(fā)生與APOE基因型關(guān)系密切。Das等[19]研究指出，在腦梗死的APOE基因型ε3ε4中TG、極低密度脂蛋白膽固醇水平呈高表達(dá)。張晉霞等[20]研究則認(rèn)為，蛛網(wǎng)膜下腔出血性腦卒中、出血性腦卒中及缺血性腦卒中等各類腦卒中受APOE ε4等位基因影響，增加其發(fā)病率。胡艷清等[21]研究也證實，頸動脈內(nèi)膜中層厚度與APOE ε4等位基因密切相關(guān)，可促使腦梗死的患病率增加。由此可推測，APOE基因型ε3ε4、ε4等位基因會對人體機(jī)體內(nèi)的脂類代謝產(chǎn)生影響，特別是腦內(nèi)脂類的代謝，有利于形成腦內(nèi)動脈粥樣硬化，增加腦梗死的發(fā)生率。Taylor等[22]通過動物研究發(fā)現(xiàn)，APOE ε4等位基因會誘發(fā)動物發(fā)生代謝紊亂，從而引發(fā)腦梗死。Scott等[23]研究指出，抑郁的發(fā)生與APOE基因多態(tài)性相關(guān)，APOE基因多態(tài)性可能是抑郁癥的影響因子。Lavretsky等[8]研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者攜帶APOE ε4等位基因則發(fā)病年齡較年輕、發(fā)病次數(shù)較多，證實APOE ε4等位基因與抑郁癥的臨床特點(diǎn)及病程密切相關(guān)。Ramachandran等[7]研究指出，腦卒中患者合并抑郁與APOE ε4等位基因相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ε2ε3、ε3ε4、ε4是腦卒中患者伴抑郁的影響因素，與上述研究結(jié)果一致，其原因可能是APOE ε4等位基因會對機(jī)體內(nèi)的代謝產(chǎn)生影響，誘導(dǎo)腦血管動脈粥樣硬化，影響腦血管供血，對情感調(diào)節(jié)區(qū)域造成影響，阻斷相關(guān)通路，從而抑制相關(guān)神經(jīng)調(diào)節(jié)因子。

綜上所述，腦卒中合并抑郁患者APOE等位基因頻率中ε4較高，ε2ε3、ε3ε4、ε4是腦卒中合并抑郁的影響因素。由此得出，APOE基因多態(tài)性與腦卒中合并抑郁密切相關(guān)，檢測APOE基因多態(tài)性，有助于預(yù)測腦卒中合并抑郁的發(fā)生風(fēng)險。