韋雪艷 林秋伶 邱模勤 陳佩琴 周子寒 劉穎春梁偉康 張若昕 余紅平

1廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（南寧 530021）；2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（南寧 530021）；3復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室（上海 200032）

原發(fā)性肝癌（簡稱肝癌）發(fā)病率和死亡率分別居于惡性腫瘤第6位和第3位[1]。廣西的肝癌死亡率居廣西腫瘤死因譜首位[2]。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌的主要臨床病理類型[1]，且HCC的5年總生存率仍低于 15%[3]。研究表明，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與個體疾病進(jìn)展以及預(yù)后密切相關(guān)[4-5]。超級增強(qiáng)子（super-enhancers，SEs）是基因組中大量增強(qiáng)子富集的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)癌基因表達(dá)[6-7]。SEs主要負(fù)責(zé)調(diào)控決定細(xì)胞身份的基因表達(dá)，如決定癌細(xì)胞身份的致癌基因[8-9]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，SE區(qū)域的SNPs可通過調(diào)控致癌SEs的活性促進(jìn)或抑制靶基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[10-12]。然而，目前尚無SEs區(qū)域SNPs與HCC患者預(yù)后的研究報(bào)道。本研究探討SEs區(qū)域SNPs與HCC患者預(yù)后之間的關(guān)系，以識別新的預(yù)后標(biāo)志物，為尋找HCC的治療靶點(diǎn)和個體化防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 病例選擇及一般資料基于本課題組全基因組芯片分析數(shù)據(jù)庫中來源于2007年7月至2017年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院首次確診并行肝癌切除術(shù)的866例HBV相關(guān)HCC患者，均為HBsAg血清陽性及經(jīng)病理檢查或AFP等確診為HCC。排除丙肝抗體陽性患者，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或晚期患者，合并嚴(yán)重心臟、肺臟、腎臟及腦血管疾病和術(shù)前接受化療和（或）放療的患者。調(diào)查員通過查閱病歷和電話隨訪等方式收集患者的一般情況以及隨訪情況，如年齡、性別、吸煙、飲酒、HBV感染狀況等。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，將866例的總?cè)巳菏褂秒S機(jī)數(shù)按1∶1比例分為發(fā)現(xiàn)集和驗(yàn)證集，各433例。本研究獲得廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并經(jīng)患者知情同意（批準(zhǔn)號：LW2022076）。

1.2 隨訪按照HCC患者出院后前兩年每3個月隨訪一次、之后每6個月隨訪一次的隨訪周期，以電話隨訪患者本人或其家屬。以死亡為研究終點(diǎn)，總生存期（overall survival，OS）作為研究變量，OS定義為手術(shù)日期至死亡或末次隨訪日期（2020年3月）。失訪或末次隨訪未死亡的病例作為截尾事件。

1.3 DNA提取、基因分型和質(zhì)量控制本研究術(shù)前對研究對象抽取5 mL外周血，采用血液DNA提取試劑盒（愷碩生物科技（廈門）有限公司）從外周血中提取DNA。全基因組分型使用Illumina Infinium? Global Screening Assay芯片。用PLINK（v1.9）軟件進(jìn)行質(zhì)量控制處理。SNP排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）位于性染色體上；（2）檢出率＜ 95%；（3）次等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＜ 0.1%；（4）哈迪溫伯格平衡（hardy-weinberg equilibrium，HWE）P＜1×10-6。

1.4 候選SNPs篩選本研究通過檢索人類超級增強(qiáng)子SEdb數(shù)據(jù)庫中肝癌細(xì)胞系HepG2和HuH7的H3K27ac數(shù)據(jù)，鑒定了956個HCC的特異性SEs。隨后，使用PLINK1.90軟件提取SEs區(qū)域上的SNPs位點(diǎn)。SNPs篩選標(biāo)準(zhǔn)：（1）MAF ≥ 0.05；（2）基因分型成功率≥95%；（3）HWE P≥1.0×10-6。最終，基于RegulomeDB和HaploReg v4.2等網(wǎng)站進(jìn)行功能預(yù)測分析，篩選具有潛在功能性SNPs位點(diǎn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用R4.1.0的survival和survminer包，采用Log-Rank檢驗(yàn)和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評估患者基本特征以及不同遺傳模型中SNPs與HCC患者術(shù)后OS的關(guān)系，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）及其 95%置信區(qū)間（confidence interval，CI），并繪制風(fēng)險(xiǎn)基因型Kaplan Meier生存曲線。利用HaploView軟件進(jìn)行連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）分析，并繪制LD圖。

2 結(jié)果

2.1 研究人群基本特征及其與HCC術(shù)后OS關(guān)系本研究共納入866例HCC患者，截止到2020年3月，共419例（48.4%）患者發(fā)生死亡，中位生存時(shí)間（median survival time，MST）為39.05個月。Log-Rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，年齡、AFP、癌栓和BCLC分期均與HCC患者OS相關(guān)（P＜0.05）。見表1。

表1 866例HBV相關(guān)HCC患者的一般臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of 866 patients with HBV-related HCC 例（%）

2.2 超級增強(qiáng)子區(qū)域SNPs與HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后OS的關(guān)系在加性模型下，利用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析并校正年齡、性別、吸煙、飲酒、AFP、肝硬化、有無癌栓、BCLC分期和主成分分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的成分等因素，并采用假陽性報(bào)告率（false positive report probability，F(xiàn)PRP）進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)。在發(fā)現(xiàn)集篩選出與HCC患者OS相關(guān)的1 272個SNPs（P＜0.05，F(xiàn)PRP＜ 0.2）；接著，在驗(yàn)證集中驗(yàn)證這1 272個SNPs位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于3個基因的7個SNPs位點(diǎn)與HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后OS仍存在關(guān)聯(lián)。見表2。

表2 與HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后OS相關(guān)的7個SNPSTab.2 Associations between seven validated significant SNPs and postoperative OS of HBV-related HCC

2.3 篩選具有潛在功能性SNPs位點(diǎn)本研究對與HCC患者術(shù)后OS相關(guān)的谷氨酰胺合成酶（glutamate-ammonia ligase，GLUL）上的5個SNPs進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這5個SNPs高度連鎖（r2＞0.9），見圖1。隨后，采用生物信息學(xué)工具對上述7個SNPs的進(jìn)行功能注釋，見表3。結(jié)果顯示，軸抑制蛋白 2（axis inhibition protein 2，AXIN2）和Bcl2修飾因子（bcl2 modifying factor，BMF）rs546220預(yù)測都位于增強(qiáng)子區(qū)組蛋白標(biāo)記處，且可能會對基序有影響；GLUL rs61805159預(yù)測得分最高為2a，位于增強(qiáng)子區(qū)組蛋白標(biāo)記處且可能會對9個基序有影響。最終，根據(jù)連鎖不平衡分析和功能注釋結(jié)果選擇3個具有潛在功能性SNPs（GLUL rs61805159，BMF rs546220，AXIN2 rs4791170）進(jìn)行進(jìn)一步分析。

表3 7個與HBV相關(guān)HCC OS相關(guān)SNPs的功能預(yù)測Tab.3 Functional prediction of seven significant SNPs

圖1 GLUL基因SNPs的連鎖不平衡分析Fig.1 Linkage disequilibrium of GLUL gene SNPs

2.4 SNPs與HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后OS的關(guān)系在不同遺傳模型下（加性、顯性模型）對上述3個SNPs進(jìn)行多因素Cox回歸分析，評估其與HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后OS的影響。顯性模型下，攜帶GLUL rs61805159位點(diǎn)GA/AA基因型的HCC患者比攜帶GG基因型的患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)增加45%（HR=1.45，95%CI：1.17 ～ 1.79，P＜ 0.001）；攜帶BMF rs546220 AA/AC基因型患者較攜帶CC基因型HCC患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)降低35%（HR=0.65，95%CI：0.52～ 0.81，P＜0.001）；與攜帶GG基因型的患者相比，攜帶AXIN2 rs4791170位點(diǎn)GA/AA基因型的患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)增加43%（HR=1.43，95%CI：1.17～ 1.74，P＜ 0.001）。見表4。

表4 3個相關(guān)的SNPs的遺傳模型分析Tab.4 Different genetic model analyses of three SNPs

2.5 SNP-SNP聯(lián)合作用對HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后OS影響考慮到各SNP之間在HCC發(fā)生發(fā)展中可能存在潛在聯(lián)合作用，本研究將rs61805159位點(diǎn)GA/AA基因型、rs546220位點(diǎn)CC基因型、rs4791170位點(diǎn)GA/AA基因型定義為假設(shè)危險(xiǎn)基因型（簡稱危險(xiǎn)基因型），進(jìn)一步分析SNPs聯(lián)合作用對HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后OS的影響。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，相比于攜帶0個風(fēng)險(xiǎn)基因型的患者，攜帶1、2或3個風(fēng)險(xiǎn)基因型的患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)更高，預(yù)后更差，且死亡風(fēng)險(xiǎn)隨著風(fēng)險(xiǎn)基因型的個數(shù)增加而增加（Ptrend＜0.001），見表5。同時(shí)，Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)與攜帶0個風(fēng)險(xiǎn)基因型的患者相比，攜帶1、2或3個風(fēng)險(xiǎn)基因型的患者M(jìn)ST更短（MST分別為 103.8、74.5、51.3、24.4個月），且MST隨著風(fēng)險(xiǎn)基因型的個數(shù)增加而縮短，P＜ 0.001（圖2）。

圖2 聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)基因型與HCC患者OS關(guān)系的KM曲線Fig.2 Kaplan-Meier curves of combined risk genotypes and OS of HCC

表5 聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)基因型與HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后OS的相關(guān)性Tab.5 Correlation analysis of combined risk genotypes with postoperative OS of HBV-related HCC

3 討論

本研究探討超級增強(qiáng)子區(qū)域SNPs與HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后OS關(guān)系。單位點(diǎn)分析中，GLUL rs61805159和AXIN2 rs4791170的A等位基因均可增加患者術(shù)后的死亡風(fēng)險(xiǎn)，BMF rs546220 A等位基因降低患者術(shù)后的死亡風(fēng)險(xiǎn)；SNPs聯(lián)合作用分析發(fā)現(xiàn)，這3個SNPs的聯(lián)合作用影響HCC患者術(shù)后的OS，攜帶風(fēng)險(xiǎn)基因型的個數(shù)越多，其OS越短，存在明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果提示超級增強(qiáng)子區(qū)域SNPs與HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后預(yù)后有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，單個SNP位點(diǎn)對肝癌發(fā)生發(fā)展作用微小，而多位點(diǎn)的聯(lián)合作用往往在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮更大的作用[13-14]。WANG等[15]對rs567403和rs7969508的風(fēng)險(xiǎn)基因型聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，與攜帶0-1個不利風(fēng)險(xiǎn)基因型相比，攜帶2個不利風(fēng)險(xiǎn)基因型的皮膚黑色素瘤患者發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.17倍。本研究發(fā)現(xiàn)與攜帶0個風(fēng)險(xiǎn)基因型患者相比，攜帶多個風(fēng)險(xiǎn)基因型的患者發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加，提示rs61805159 GA/AA、rs546220 CC和rs4791170 GA/AA位點(diǎn)的聯(lián)合作用可協(xié)同增加HBV相關(guān)HCC術(shù)后患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，且HCC術(shù)后患者OS明顯縮短，提示其不利風(fēng)險(xiǎn)基因型對HCC患者預(yù)后存在顯著的累加效應(yīng)。

GLUL具有催化谷氨酰胺的功能，在維持細(xì)胞酸堿穩(wěn)態(tài)以及氨解毒，細(xì)胞信號傳導(dǎo)和增殖過程也發(fā)揮重要的作用[16]。據(jù)報(bào)道，體外敲低GLUL可有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[17]，上調(diào)GLUL能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖[18]，還是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的不良預(yù)后標(biāo)志物[19]。上述研究提示，GLUL可能參與HCC發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而影響HCC患者的預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶rs61805159 AA和GA基因型的HBV相關(guān)HCC患者比攜帶GG基因型的患者有較短的OS。功能注釋分析發(fā)現(xiàn)rs61805159 G＞A位于超級增強(qiáng)子區(qū)域，可能會引起基序改變。因此，筆者推測rs61805159 A等位基因可能通過提高增強(qiáng)子活性來促進(jìn)GLUL表達(dá)，從而增加HCC患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。

BMF屬于Bcl2家族的成員，其形成的異質(zhì)或同源二聚體，可以作為參與各種細(xì)胞活動的抗凋亡或促凋亡調(diào)節(jié)劑[20]。KANDASWAMY等[21]發(fā)現(xiàn)在慢性淋巴細(xì)胞性白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）中，rs539846（C ＞A）A等位基因能夠降低BMF的表達(dá)，減少腫瘤細(xì)胞凋亡，從而增加CLL易感性。JIANG等[22]發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-640可以通過靶向抑制BMF基因促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。在本研究中，BMF rs546220位點(diǎn)A等位基因可降低HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后的死亡風(fēng)險(xiǎn)，延長患者的生存時(shí)間。功能預(yù)測分析表明，BMF rs546220位于超級增強(qiáng)子區(qū)域，可能對基序改變發(fā)揮作用，提示rs546220 A等位基因可能發(fā)揮促進(jìn)增強(qiáng)子的作用來上調(diào)BMF mRNA表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控HCC的生物學(xué)過程，并改善HCC患者的術(shù)后生存情況。

AXIN2是Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞生長、許多惡性腫瘤的發(fā)生、腫瘤進(jìn)展等方面起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，AXIN2是一個促癌啟動子，它可以上調(diào)轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail的活性誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促使腫癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤不良預(yù)后[23-24]。ROSALESREYNOSO 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶 AXIN2 rs2240308（C＞T）T等位基因個體罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。在本研究中，AXIN2 rs4791170 A等位基因與HBV相關(guān)HCC患者預(yù)后較差相關(guān)，這可能與激活Wnt/β-catenin信號通路，上調(diào)AXIN2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲相關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)攜帶GLUL rs61805159 GA/AA、BMFrs546220CC和AXIN2rs4791170GA/AA風(fēng)險(xiǎn)基因型的HBV相關(guān)HCC患者術(shù)后OS更差。然而，對于這些SNPs的作用機(jī)制尚未能完全闡明，需要今后進(jìn)一步深入開展SNP功能學(xué)研究進(jìn)行解析。本研究的局限性是樣本量相對較小，在一定程度上可能影響了檢驗(yàn)效能；其次未能收集患者術(shù)后治療信息，可能對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。因此，本研究需要更大樣本量的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。