李王勝 王雪倩 尹希龍 石楊 劉大麗 譚文勃 興旺

（1黑龍江大學(xué)國家甜菜種質(zhì)中期庫，150080，黑龍江哈爾濱；2黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，150080，黑龍江哈爾濱）

甜菜是世界上重要的糖料作物，也可作為飼料原料[1]，隨著對(duì)甜菜的不斷研究，目前發(fā)現(xiàn)甜菜具有保健功能，如在降脂、降壓等方面[2-3]，應(yīng)用前景十分廣泛。種質(zhì)資源又稱遺傳資源，中國保存的種質(zhì)資源總量突破52萬份，位居世界第二[4]，我國國家甜菜種質(zhì)中期庫現(xiàn)保存甜菜種質(zhì)資源1382份[5]，種質(zhì)資源作為農(nóng)業(yè)“芯片”在科學(xué)研究中越來越受重視。我國甜菜主要種植在新疆、內(nèi)蒙古和黑龍江等地[6]，這些地區(qū)的年降水量多在400mm以下[7]，并且近年來全球變暖造成水資源短缺，干旱成為影響我國甜菜生產(chǎn)的主要非生物因素[8]。苗期耐旱能力直接影響甜菜的生長以及產(chǎn)量，因此對(duì)甜菜種質(zhì)資源進(jìn)行苗期耐旱試驗(yàn)，篩選出優(yōu)異的耐旱種質(zhì)資源，對(duì)促進(jìn)我國農(nóng)業(yè)發(fā)展、加強(qiáng)生態(tài)環(huán)境安全和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

甜菜苗期對(duì)水分脅迫的反應(yīng)可從形態(tài)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，前人[9]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合各指標(biāo)進(jìn)行耐旱性綜合評(píng)價(jià)能更科學(xué)合理地篩選耐旱種質(zhì)。目前綜合評(píng)價(jià)的分析方法已經(jīng)在大豆[10]、甘蔗[11]、薏苡[12]和菜豆[13]等作物上應(yīng)用并取得了理想的效果，甜菜的耐旱研究也有報(bào)道[14-15]，但是應(yīng)用綜合評(píng)價(jià)的方法對(duì)大量甜菜種質(zhì)資源的耐旱性進(jìn)行分析的研究鮮有報(bào)道。

本研究以336份國家甜菜種質(zhì)中期庫中保存的甜菜種質(zhì)資源為材料，通過PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)甜菜苗期的株高、根長、可溶性糖和游離脯氨酸含量等15個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析。通過隸屬函數(shù)法、主成分分析法、相關(guān)分析法和聚類分析法綜合評(píng)價(jià)甜菜種質(zhì)資源的耐旱性，試驗(yàn)主要目的是進(jìn)一步完善甜菜種質(zhì)資源耐旱評(píng)價(jià)體系和評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出苗期耐旱種質(zhì)資源，為今后甜菜種質(zhì)資源耐旱研究以及育種提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以國家甜菜種質(zhì)中期庫提供的來源于17個(gè)國家的336份甜菜種質(zhì)資源為材料，其中中國205份、英國2份、意大利5份、匈牙利2份、瑞典5份、日本9份、俄羅斯16份、美國49份、羅馬尼亞2份、荷蘭12份、法國3份、德國10份、丹麥1份、朝鮮1份、波蘭11份、比利時(shí)2份以及奧地利1份。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年3-12月在黑龍江大學(xué)國家甜菜種質(zhì)中期庫（126°45′E，45°30′N）智能人工氣候室內(nèi)進(jìn)行，以PEG-6000模擬干旱脅迫，通過實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)設(shè)置9%濃度時(shí)脅迫效果顯著且未致死，所以確定設(shè)置干旱9%PEG-6000的Hoagland溶液（DS）和對(duì)照Hoagland溶液（CK）2個(gè)處理組，重復(fù)3次。

每份種質(zhì)挑選30顆籽粒飽滿、大小均勻的種子，用75%酒精浸泡1min后用自來水沖洗1min，在2‰的福美雙溶液浸泡12h，將種子表面殘留藥物用自來水沖洗干凈并播于蛭石中，每天定時(shí)噴水，待子葉長出，每份挑選長勢一致的幼苗12株，洗去根上的蛭石后用海綿定植于24孔水培盆（長37.5cm，寬25.5cm，高13.5cm）中，盆中加入Hoagland營養(yǎng)液9L，每7d更換1次營養(yǎng)液，定植14d后（3對(duì)真葉時(shí)）進(jìn)行干旱和對(duì)照處理，通過實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)設(shè)置脅迫2、5和7d，7d時(shí)效果最好，所以確定脅迫7d后測定最大根長、株高、根鮮重、葉鮮重、葉片飽和鮮重、葉干重、根干重、胚軸直徑、葉片相對(duì)含水量、根冠比、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性以及可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸和丙二醛含量。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

最大根長（root length，RL）和株高（plant height，PH）用直尺測量，根鮮重（root fresh weight，RFW）、葉鮮重（leaf fresh weight，LFW）、葉片飽和鮮重（leaf saturated fresh weight，LSFW）、葉干重（leaf dry weight，LDW）和根干重（root dry weight，RDW）用電子天平稱重，胚軸直徑（embryonic axis diameter，EAD）使用游標(biāo)卡尺測量。

葉片相對(duì)含水量（relative leaf water，RLW）：RLW[16]=(LWF–LDW)/(LSFW–LDW)

根冠比（root-shoot ratio，RSR）：RSR=RFW/LFW

使用氮藍(lán)四唑法[17-19]（NBT methods）測定SOD活性，使用蒽酮比色法[20]（anthrone colorimetry）測定可溶性糖（soluble sugar，SS）含量，使用硫代巴比妥酸法[20]（TBA法）測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，使用酸性茚三酮法[20]（acid ninhydrin process）測定脯氨酸（proline，Pro）含量，使用BCA試劑盒測定可溶性蛋白質(zhì)（soluble protein，SP）含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2007和SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，使用Origin 2021畫圖。參考趙振寧等[21]和謝小玉等[22]的方法，根據(jù)所測量的指標(biāo)計(jì)算耐旱系數(shù)（drought resistance coefficient，DC）、隸屬函數(shù)值[μ(Xi)]和耐旱性度量值（drought tolerance measurement，D）。使用Origin 2021系統(tǒng)聚類中的Ward法對(duì)甜菜種質(zhì)資源D值進(jìn)行聚類分析，并對(duì)D值和各指標(biāo)耐旱系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

分析中涉及的計(jì)算公式如下：

式中，Xi為第i個(gè)指標(biāo)干旱處理后與對(duì)照處理的相對(duì)值，Ximin和Ximax分別表示第i個(gè)指標(biāo)耐旱系數(shù)的最小值和最大值。

式中，F(xiàn)(Xj)表示第j個(gè)綜合指標(biāo)值，aij表示各指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的特征值，Xij為各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化處理的值。

式中，Wj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中所占的權(quán)重，Pj表示各種質(zhì)第j個(gè)綜合指標(biāo)的方差貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)各指標(biāo)的影響

由圖1可知，PEG-6000模擬干旱脅迫條件下，336份甜菜種質(zhì)資源的胚軸直徑、葉干重、株高、根長、葉鮮重、根鮮重、根干重、葉片飽和鮮重和葉片相對(duì)含水量等表型性狀均極顯著低于對(duì)照，干旱脅迫后根冠比、SS、SP和Pro含量等4個(gè)指標(biāo)均極顯著高于對(duì)照；SOD活性和MDA含量在干旱和對(duì)照處理下差異并不顯著。不同甜菜種質(zhì)的各指標(biāo)在干旱脅迫后變化趨勢不同，很難根據(jù)單一指標(biāo)的變化情況客觀、準(zhǔn)確地比較不同甜菜種質(zhì)耐旱情況，應(yīng)該運(yùn)用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)的方法。

圖1 干旱脅迫對(duì)336份甜菜種質(zhì)資源各指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of drought stress on indexes of 336 sugar beet germplasm resources

2.2 主成分分析

由表1可知，前6個(gè)主成分因子可代表全部信息的75.95%，其中λ＞0.918。根據(jù)結(jié)果可將原有的15個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為6個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)。第1主成分的貢獻(xiàn)率為36.47%，其中胚軸直徑、葉鮮重、根鮮重、根干重、葉干重和葉片飽和鮮重等指標(biāo)的載荷系數(shù)絕對(duì)值較大，說明第1主成分主要反映的是生物量信息；第2主成分的貢獻(xiàn)率為11.05%，其中SS和SP的載荷系數(shù)絕對(duì)值較大，說明第2主成分主要反映的是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的信息；第3主成分的貢獻(xiàn)率為9.36%，其中根長、葉片相對(duì)含水量和根冠比的載荷系數(shù)較大，說明第3主成分主要反映的是干旱脅迫下會(huì)增長的表型指標(biāo)；第4主成分的貢獻(xiàn)率為6.68%，其在SOD上有較高載荷系數(shù)；第5主成分的貢獻(xiàn)率為6.26%，其在MDA含量上有較高載荷系數(shù)；第6主成分的貢獻(xiàn)率為6.12%，其在Pro含量上有較高載荷系數(shù)。

表1 甜菜種質(zhì)資源各指標(biāo)的主成分分析Table 1 Principal component analysis of various indexes of sugar beet germplasm resources

由主成分分析（圖2）可將336份種質(zhì)大致分成3個(gè)類群，類群1是耐旱表現(xiàn)較好的種質(zhì)，包括10、79、84、85、124、182、230、251、293 和 298號(hào)等10份；類群3是耐旱表現(xiàn)較差的種質(zhì)，包括42、133、144、229和267號(hào)等5份；類群2的種質(zhì)耐旱性介于類群1和類群3之間。

圖2 336份甜菜種質(zhì)資源各指標(biāo)主成分分析Fig.2 Principal component analysis of indexes of 336 sugar beet germplasm resources

2.3 耐旱性綜合評(píng)價(jià)

通過公式(1)計(jì)算耐旱系數(shù)，利用公式(2)和(3)計(jì)算各種質(zhì)的綜合指標(biāo)值，再結(jié)合公式(4)計(jì)算各綜合指標(biāo)的權(quán)重，最后根據(jù)公式(5)得到各甜菜種質(zhì)資源的耐旱性度量值（D）（圖3），336份甜菜種質(zhì)資源D值介于0.135～1.289，平均值為0.392，D值越大表示該甜菜種質(zhì)耐旱性越強(qiáng)。耐旱性突出的種質(zhì)有10、85和182號(hào)等，耐旱性弱的種質(zhì)有42、133和310號(hào)。D值計(jì)算耐旱性的結(jié)果與主成分分析結(jié)果基本吻合。

圖3 336份甜菜種質(zhì)資源D值散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of D values of 336 sugar beet germplasm resources

2.4 甜菜種質(zhì)資源耐旱性聚類分析

對(duì)336份甜菜種質(zhì)資源D值進(jìn)行聚類分析（圖4），共分為5類。第Ⅰ類為耐旱性強(qiáng)種質(zhì)，有16份，占總數(shù)的4.76%，D值平均值為0.806；第Ⅱ類為耐旱性較強(qiáng)的種質(zhì)，有49份，占總數(shù)的14.58%，D值平均值為0.564；第Ⅲ類為耐旱性中等的種質(zhì)，有109份，占總數(shù)的32.44%，D值變化范圍為0.363～0.501；第Ⅳ類為耐旱性較弱的種質(zhì)，有79份，占總數(shù)的23.51%，D值平均值為0.326；第Ⅴ類為耐旱性弱的種質(zhì)，有83份，占總數(shù)的24.70%，D值變化范圍為0.135～0.283。

圖4 336份甜菜種質(zhì)資源耐旱性分析聚類圖Fig.4 Cluster diagram of drought tolerance analysis of 336 sugar beet germplasm resources

2.5 D值與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果（圖5）可知，表型指標(biāo)除葉片相對(duì)含水量和根冠比外其余各指標(biāo)間均表現(xiàn)出顯著正相關(guān)；根冠比與株高、葉鮮重、葉干重和葉片相對(duì)含水量呈顯著負(fù)相關(guān)。表型指標(biāo)與生理指標(biāo)間除葉片相對(duì)含水量與SS間呈極顯著相關(guān)外其余各指標(biāo)間均無顯著相關(guān)性。生理生化指標(biāo)中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量間呈極顯著正相關(guān)，MDA含量與SP含量呈顯著正相關(guān)，SOD活性與SP和Pro含量均呈顯著正相關(guān)。D值與10個(gè)表型指標(biāo)均表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，其中，D值與胚軸直徑、株高、根長、葉鮮重、根鮮重、根干重、葉干重、葉片飽和鮮重和葉片相對(duì)含水量呈顯著正相關(guān)，D值與根冠比呈顯著負(fù)相關(guān)，D值與5個(gè)生理生化指標(biāo)均無顯著相關(guān)性。

圖5 耐旱性度量D值與各耐旱系數(shù)指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between D value of drought tolerance measure and drought tolerance coefficient of each index

3 討論

3.1 耐旱性評(píng)價(jià)方法的選擇

在對(duì)植物的耐旱性進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，如果只采取等權(quán)重的綜合評(píng)價(jià)方法往往會(huì)忽略了各指標(biāo)不同的重要程度，目前大多數(shù)學(xué)者都會(huì)采用多種方法相結(jié)合進(jìn)行評(píng)價(jià)，本研究參考趙振寧等[21]和謝小玉等[22]對(duì)耐旱研究的綜合評(píng)價(jià)方法，采用隸屬函數(shù)值法和抗旱性度量值法結(jié)合抗旱系數(shù)對(duì)336份甜菜種質(zhì)資源進(jìn)行主成分分析[23]、聚類分析[17]、綜合評(píng)價(jià)分析和相關(guān)性分析[24]，從而客觀、具體、準(zhǔn)確地對(duì)336份甜菜種質(zhì)資源的耐旱性進(jìn)行評(píng)價(jià)，使鑒定結(jié)果更接近真實(shí)情況。

本研究通過以上方法得出各甜菜種質(zhì)資源的D值與主成分分析結(jié)果高度符合，也從側(cè)面印證了綜合評(píng)價(jià)方法的可靠性。最終將甜菜種質(zhì)資源的耐旱性分別為5個(gè)類群，篩選出耐旱型甜菜種質(zhì)16份，這一結(jié)果與汪燦等[12]在薏苡中的研究結(jié)果一致。本研究鑒定出的耐旱材料可作為優(yōu)良的甜菜種質(zhì)資源加入到國家甜菜種質(zhì)中期庫的核心種質(zhì)中，以便在今后新品種培育中加以利用。

3.2 干旱對(duì)甜菜種質(zhì)資源表型和生理生化指標(biāo)的影響

干旱脅迫可對(duì)植物的基因表達(dá)、代謝和生長變化產(chǎn)生影響，這些影響往往在幾秒鐘、幾小時(shí)和幾天內(nèi)顯現(xiàn)出來，但是這些變化中最先被觀察到的是生長變化的影響[25]，所以在干旱研究中表型指標(biāo)至關(guān)重要。本研究的10個(gè)表型指標(biāo)中有9個(gè)在經(jīng)過干旱脅迫后是顯著下降的，只有根冠比在干旱脅迫后顯著增加，這表明干旱脅迫對(duì)表型指標(biāo)的影響是顯著的，可利用以上表型指標(biāo)對(duì)甜菜種質(zhì)資源進(jìn)行耐旱性評(píng)價(jià)。

植物應(yīng)對(duì)干旱的主要生理生化表現(xiàn)有抗氧化酶系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)、活性氧代謝和產(chǎn)生抗逆蛋白等[26]。游離脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和自由基清除劑[27]，SOD可降低活性氧對(duì)植物的損傷[28]，MDA能夠反映植物體內(nèi)活性氧物質(zhì)對(duì)質(zhì)膜透性的損失程度[26]，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可以降低植物體內(nèi)滲透勢，從而降低水勢，提高從外界吸收水分的能力[29]。本研究中，干旱脅迫后SS、SP和Pro含量顯著上升，SOD活性和MDA含量變化不顯著，可能是干旱脅迫后這2個(gè)指標(biāo)升高和降低的種子數(shù)量相當(dāng)，這2個(gè)指標(biāo)對(duì)干旱脅迫的敏感性在不同甜菜種質(zhì)中表現(xiàn)不同。

3.3 甜菜耐旱性評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇

植物的耐旱性是一個(gè)復(fù)雜的過程，不同的指標(biāo)對(duì)干旱脅迫反應(yīng)的敏感性和速度不同，植物在應(yīng)對(duì)干旱脅迫時(shí)會(huì)隨著脅迫的時(shí)間呈現(xiàn)出階段性的特點(diǎn)，根系在感受到脅迫信號(hào)后，通過信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)體內(nèi)酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而影響表型指標(biāo)，使植物來適應(yīng)外界脅迫[30-32]，本研究通過對(duì)336份甜菜種質(zhì)資源脅迫7d后的各指標(biāo)的耐旱系數(shù)和D值進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)D值與所測的5個(gè)生理生化指標(biāo)（SS、SP、SOD、Pro和MDA）均無顯著相關(guān)性，與10個(gè)表型指標(biāo)（EAD、PH、RL、LFW、RFW、RDW、LDW、LSFW、RLW和RSR）均表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，在長時(shí)間的干旱脅迫下甜菜種質(zhì)耐旱鑒定可依據(jù)表型指標(biāo)進(jìn)行，這一結(jié)果與路之娟等[33]在苦蕎中的研究結(jié)果相似。D值與根鮮重、胚軸直徑和葉鮮重的相關(guān)系數(shù)分別為0.91、0.89和0.89，在大田試驗(yàn)中可以依據(jù)地上部指標(biāo)葉鮮重、地下部指標(biāo)根鮮重和胚軸直徑這3個(gè)指標(biāo)對(duì)甜菜種質(zhì)耐旱性快速、有效地進(jìn)行鑒定。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)336份甜菜種質(zhì)資源苗期耐旱性進(jìn)行分析，對(duì)D值進(jìn)行聚類分析，篩選出16份苗期耐旱性強(qiáng)的甜菜種質(zhì)。并根據(jù)相關(guān)性分析確定了D值與胚軸直徑、株高、根長、葉鮮重、根鮮重、根干重、葉干重、葉片飽和鮮重和葉片相對(duì)含水量呈顯著正相關(guān)，D值與根冠比呈顯著負(fù)相關(guān)，本研究結(jié)果可以為甜菜抗旱育種提供材料和理論基礎(chǔ)。